Abstract
Mekanismen av tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) motstand i kreftceller ikke er fullt ut forstått. Her viser vi at det Akt overlevelsesreaksjonsveien spiller en viktig rolle i TRAIL motstand i humane kreftceller. Vi fant spesielt at TRAIL behandling aktiverer Akt overlevelse sti og at hemming av denne veien ved PI3K inhibitor LY294002 eller knockdown av Akt sensitizes resistente kreftceller til TRAIL. Siden Akt er negativt regulert av tumor suppressor PTEN, undersøkte vi TRAIL følsomhet i PTEN knockdown mus prostata epitelceller og funnet ut at PTEN
– /- cellene er mer motstandsdyktig enn PTEN
+ /+ celler mens følsomheten PTEN
+/- celler falt i mellom. Videre viste vi at overekspresjon av en mutant PTEN overfører TRAIL motstand i PTEN
+ /+ celler, som støtter en rolle PTEN i TRAIL følsomhet. I TRAIL resistente bryst T47D celler, overekspresjon av mutant PTEN ytterligere økt sin motstand mot TRAIL. Tatt sammen, våre data tyder på at inaktivering av funksjonelle PTEN og påfølgende aktivering av Akt sti hindrer at TRAIL-fremkalt apoptose, som fører til TRAIL motstand. Derfor våre resultater tyder på at TRAIL motstand kan overvinnes ved å målrette PTEN eller Akt overlevelse sti i kreftceller
Citation. Xu J, Zhou JY, Wei WZ, Wu GS (2010) Aktivering av Akt Survival pathway Bidrar til TRAIL Resistance i kreftceller. PLoS ONE 5 (4): e10226. doi: 10,1371 /journal.pone.0010226
Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 22 februar 2010; Godkjent: 19 mars 2010; Publisert: 19 april 2010
Copyright: © 2010 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH /NCI tilskuddet R01 CA100073 og Department of Defense Breast Cancer Program W81XWH-07-1-05-21. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
TRAIL (eller Apo2L) er et medlem av tumornekrosefaktor super som selektivt induserer apoptose i kreft, men ikke normale celler, noe som gjør det til et attraktivt middel for kreftbehandling. TRAIL induserer apoptose gjennom aktivering av sine dødsreseptorer DR4 (TRAIL-R2) og /eller DR5 (KILLER, TRAIL-R1, TRICK2) [1], [2], [3], [4]. Når TRAIL binder seg til DR4 og /eller DR5 reseptorer, dødsreseptorer blir trimerisert og deretter rekruttere adapteren protein FADD (Fas-assosiert protein med døden domene) og procaspase 8 eller procaspase 10 for å danne DISC, som fører til caspase 8 aktivering [1 ], [2]. Aktivert caspase 8 kan direkte aktivere effektor caspases 3, 6 og 7 for å utløse apoptose eller indirekte induserer apoptose gjennom tBid-indusert caspase 9 mediert mitokondrie apoptose vei [2], [4].
Selv TRAIL er en attraktivt terapeutisk middel mange kreftceller er resistente mot dette midlet [2]. Mekanismene for TRAIL motstand er ikke fullt ut forstått, men det kan oppstå på flere nivåer fra dets reseptorer for å fullbyrder caspaser innenfor sin signalveien [2], [4]. På reseptornivået, har mutasjoner i DR4 og DR5 blitt funnet i noen tumorer inkludert bryst og lunge-kreft [4]. Økt uttrykk av lokkefugl reseptorer og redusert DR4 /DR5 uttrykk har blitt korrelert med TRAIL motstand, selv om andre studier indikerte at uttrykket nivåer av TRAIL reseptorer ikke korrelerer med TRAIL følsomhet. Ved døds inducting aliserte kompleks (DISC) nivå, blir c-FLIP antas å være en vesentlig inhibitor for TRAIL signale [5], [6]. En fersk studie viste at TRAIL sensitive ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler montere DISC i lipid flåter av plasmamembranen som fører til caspase 8 aktivering, mens ikke-flåten DISC montering fører til rekruttering av c-FLIP og RIP og aktivering av pro-overlevelse signalveier så som NF-kB og ERK1 /2 trasé [7]. I tillegg er det blitt vist at anti-apoptotiske medlemmer av Bcl-2-familien, herunder Bcl-2 og Mcl-1, er også involvert i TRAIL motstand [8], [9]. Aktiveringen av andre overlevelsesreaksjonsveier inkludert Akt og NF-kB reaksjonsveier fører til celleoverlevelse og chemoresistance [10]. Dessuten har det vist seg at aktiveringen av Akt reaksjonsveien er nært forbundet med legemiddelresistens inkludert TRAIL motstand [11], [12]. Imidlertid er den eksakte mekanismen som Akt sti fører TRAIL motstand ikke fullt ut forstått.
PI3K /Akt signalveien er en prototypisk overlevelse sti som spiller en sentral rolle i ulike cellulære funksjoner, inkludert spredning, vekst, overlevelse og metabolisme [13]. Ved vekstfaktor stimulering, er PI3K aktivert til å fosforylere fosfatidylinositol-3, 4-bifosfat (PIP2), genererer phosphatidylinsitol-3, 4, 5-trifosfat (PIP3). PIP3 binder seg til Akt, så translocates til plasmamembranen hvor Akt aktiveres ved sekvensiell fosforylering på T308 og S473 rester. Fosforylering ved T308 er mediert av PDK-1 (3′-phosphoinositide-avhengig kinase 1) under fosforyleringen ved S473 kan være mediert av flere kinaser inkludert PDK-1 og mTORC2 [13]. Når aktivert, kan Akt fosforylere mange underlag for å utøve sine funksjoner. Den best karakteriseres substrat av Akt er serin /treonin kinase mTOR (mammalian target of rapamycin). Akt kan direkte fosforylere og aktivere mTOR og indirekte aktivere mTOR ved fosforylering og inaktivere tuberøs sklerosekompleks 2 (TSC2). Aktivert mTOR danner et kompleks med Raptor å aktivere ribosomalt protein S6 kinaser (S6K) og hemme 4E-BP, som fører til økt protein oversettelse [13]. Det er kjent at aktivering av PI3K /Akt /mTOR svei kan øke celleoverlevelse og apoptose motstand indusert av et antall agenter [12], [13]. For eksempel overekspresjon av Akt øker TRAIL motstand [11], [14]. På den annen side kan det tumorsuppressorgen PTEN (fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom ti) dephosphorylate PIP3 til å fungere som en negativ regulator av PI3K /Akt /mTOR signalering. PTEN inaktivering fører til aktivering av PI3K /Akt /mTOR-signalreaksjonsveien. Imidlertid er den nøyaktige mekanisme ved hjelp av hvilken PI3K /Akt /mTOR svei overfører TRAIL motstand ikke fullt ut forstått.
I denne studien demonstrerte vi at økt aktivering av Akt reaksjonsvei spiller en viktig rolle i TRAIL motstand. Spesielt viste vi at TRAIL aktiverer Akt sti og at blokaden av Akt aktivering av PI3K inhibitor LY294002 eller knockdown av Akt uttrykk av siRNA sensitizes resistente celler til stien. Vi fant også at gjeninnføring av villtype PTEN inn PTEN knockout celler sensitizes PTEN
– /- cellene i Trail mens inaktivering av PTEN i PTEN
+ /+ og PTEN
+/- celler fører til TRAIL motstand . Disse resultatene tyder på at økt aktivering av Akt vei via inaktivering av PTEN spiller en viktig rolle i TRAIL motstand.
Materialer og metoder
Reagenser
LY294002 ble kjøpt fra Alexis Biochemicals (San Diego, California). Rekombinant TRAIL ble kjøpt fra Peprotech (Rocky Hill, NJ). Kanin polyklonale antistoffer mot fosforylert Akt (Ser473), fosforylert mTOR, fosforylert p70S6K, fosforylert eIF4E, PTEN, total Akt, og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-aktin antistoff ble kjøpt fra Sigma. De adenovirus som uttrykker vill-type og dominant negativ PTEN, samt kontroll adenovirus som uttrykker galactosidase (Ad-LacZ), ble vennligst tilveiebrakt av Dr. Mengjer Lee (University of Louisville).
cellelinjer, dyrkningsbetingelser og behandling
humane brystcancer T47D-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection og opprettholdt i DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS). Humane ovarie cancer SKOV3-celler ble dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS, OVCA432 ble cellene dyrket i MCDB105 /M199 medium med 10% FBS, som beskrevet [15]. PTEN-knockout mus prostata epitelceller (PTEN
– /- og PTEN
+/-) og normale celler (PTEN
+ /+) ble hentet fra Dr. Young Chen (Wake Forest University) og vedlikeholdes i DMEM med 10% FBS, som tidligere beskrevet [16]. Alle cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i en fuktig atmosfære bestående av 5% CO
2 og 95% luft.
siRNA transfeksjon for knockdown av Akt
Signal Silence siRNA for Akt og tilsvarende kontroll siRNA ble kjøpt fra Cell Signaling. Transfeksjonene ble utført som foreslått av fabrikanten med små modifikasjoner, som tidligere beskrevet [17]. Kort sagt ble T47D-celler sådd ut på 6 x 10
5 per brønn i seks-brønns plater. Den neste dag ble cellene transfektert med Akt eller ikke-target-styre sirnas ved hjelp Oligofectamine (Invitrogen). Etter 24 timer ble transfekterte celler trypsinert og sådd ut på 6 x 10
5 per brønn i seks-brønns plater. 48 timer senere ble transfekterte celler ubehandlet eller behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 24 timer og deretter høstet for å vurdere ekspresjonen av Akt og spaltet PARP ved Western blot-analyse. For å bestemme kjemosensitivitet, ble celler med eller uten transfeksjon plassert på 8000 per brønn i 96-brønners plater og deretter behandlet med TRAIL i 24 timer, og cellelevedyktigheten ble bestemt ved 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyser.
MTT analyser
MTT analysene ble beskrevet tidligere [18].
Western blot analyse
prosedyrene for tilberedning av hel-celle protein lysates og Western blot analyse ble beskrevet tidligere [18].
Adenoviruse infeksjoner
PTEN
+ /+, PTEN
+/- og PTEN
– /- mus prostata epitelceller og menneskelige brystkreft T47D celler ble sådd ut i 60 mm retter på 8 × 10
5, 6 × 10
5, 5 × 10
5 og 8 × 10
5 celler per tallerken, henholdsvis. Den neste dag ble cellene vasket med normal medium og infisert med adenovirus som uttrykker vill-type PTEN, dominant negativ PTEN, eller LacZ. Under infeksjon, ble cellene forsiktig ristet hvert 10 min i 1 time, og deretter holdt i adenovirus inneholdende medium ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. 24 timer senere ble infiserte celler byttet til normal medium uten adenovirus og deretter kontinuerlig dyrket i en annen 48 timer. På 72 timer etter infeksjon ble cellene trypsinert og belagt i 60 mm rett på 5 × 10
5 celler. Den neste dag ble cellene ubehandlet eller behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 48 timer. Cellene ble høstet for Western blot analyse og MTT analysen, henholdsvis.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble gjort ved hjelp av Student
t
test. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SD, og
P
≤0.05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Karakterisering av TRAIL følsomhet i et panel av brystkreft og eggstokkreft celle linjer
for å forstå mekanismene for TRAIL motstand, må vi først undersøkt TRAIL følsomhet i 14 kreftcellelinjer inkludert 3 bryst og 11 eggstokkreft cellelinjer. Disse cellelinjer ble behandlet med forskjellige doser av TRAIL i 24 timer, og celleproliferasjon ble målt ved MTT-analyse. Fig. 1 viser at disse cellelinjene viste differensial TRAIL følsomhet; MDA-231, DOV13, OV433 og OVCA420 celler var følsomme for TRAIL mens resten av linjene var resistente mot TRAIL bortsett MCF-7 celler som viste beskjeden motstand. Disse dataene viser at mange eggstokkreft og brystkreft cellelinjer er resistente mot TRAIL.
humane brystkreftcellelinjer T47D, MDA231, og MCF7 og eggstokkreft cellelinjer DOV13, E52, OV90, OV433, OVCA432, RMG- 1, TOV-21G, TOV-112d, CAOV3, OVCA420, og SKOV3 ble behandlet med ulike doser av TRAIL for 24 timer. Celleformering ble bestemt ved MTT-analyser. Celleproliferasjon data er uttrykt i prosent av ubehandlede celler. Representant for tre uavhengige eksperimenter.
Den Akt /mTOR pathway er aktivert i TRAIL resistente cellelinjer
Siden mange bryst- og eggstokk-kreft cellelinjer er motstandsdyktig mot TRAIL, er det viktig å forstå den underliggende mekanismen for TRAIL motstand. Det har blitt rapportert at TRAIL kan aktivere flere pro-overlevelsesreaksjonsveier, inkludert Akt, NF-kB og ERK trasé [19], [20], [21], [22]. Fordi aktivering av disse reaksjonsveier modulerer celleoverlevelse og chemoresistance, er det tenkelig at aktivering av disse baner bidrar til TRAIL motstand. For å teste denne muligheten, behandlet vi fire resistente linjer T47D, SKOV3, OVCA432 og OV90 med 100 ng /ml TRAIL for ulike tidsperioder og undersøkt aktivering av Akt, NF-kB og ERK stier, samt uttrykk for Bcl -2 familie proteiner. Som vist på fig. 2A-D, nivåene av både fosforylert Akt og mTOR-protein ble øket så tidlig som 2 timer, og varte opp til 6 timer etter TRAIL behandling, Vi viste også at en slik aktivering var ikke skyldes en økning i den totale Akt og mTOR proteiner som forble konstant (fig. 2A-D). Videre viste vi at p70S6K og elF4E, begge er nedstrøms mål av mTOR er aktivert (fig. 2A og D). Disse data indikerer at TRAIL kan aktivere Akt /mTOR-reaksjonsveien i TRAIL-resistente cellelinjer. Viktigere, viste vi at Akt og mTOR ikke er aktivert i TRAIL sensitive MCF-7 og OVCA420 celler (Fig. 2E og F). Således våre resultater antyder at aktivering av Akt /mTOR veien er et vanlig arrangement i TRAIL-resistente kreftcellelinjer, og at denne bane kan være viktig i TRAIL motstand. I tillegg har vi funnet at TRAIL kunne aktivere MEK /ERK og NF-kB baner i OV90 celler, men ikke i andre tre cellelinjer (data ikke vist). Videre hemming av ERK og NF-kB trasé ved deres tilsvarende farmakologiske inhibitorer ikke påvirker TRAIL følsomhet i OV90 celler (data ikke vist), noe som indikerer at aktiveringen av disse to veier ikke kan være viktig for TRAIL motstand i denne cellelinje.
T47D (A), SKOV3 (B), OVCA432 (C), OV90 (D), MCF7 (E) og (F) OVCA420 celler ble behandlet med 100 ng /ml TRAIL for 0, 2, 4- og 8 t (i T47D celler, ble 6 timer behandling inkludert), og total protein ble hentet. Nivåene av total og fosforylert Akt (
p-AKT
), og fosforylert mTOR (
p-mTOR
) ble bestemt ved Western blot analyse. I T47D (A) og OV90 (D) celler, ble nivåene av fosforylert p-p70S6K og fosforylert elF4E (p-elF4E) også undersøkt. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Av notatet, var det to band for Akt (akt1 og akt2) i både OVCA432 og OV90 celler mens bare ett band for Akt ble påvist i T47D og SKOV3 celler.
Hemming av Akt aktivering sensitizes resistente celler å Trail
Siden Akt veien ble aktivert i alle resistente cellelinjer som ble testet, spurte vi om hemming av Akt aktivitet kan øke sin TRAIL følsomhet i resistente celler. For å oppnå dette, behandlet vi T47D-celler med PI3K-inhibitor LY294002 og undersøkt effekten av Akt inhibering på TRAIL-fremkalt apoptose. Som vist på fig. 3, TRAIL behandling økt Akt fosforylering i T47D celler, som ble avskaffet ved LY294002, viser at Akt aktivering er PI3K avhengig. Tilsvarende viste vi også at aktiveringen av Akt er blokkert av LY294002 i OVCA432 celler (fig. 3C). Viktigere, inhibering av Akt-fosforylering av LY294002 betydelig økt TRAIL-fremkalt PARP-spaltning i forhold til celler behandlet med TRAIL eller LY294002 alene (Fig. 3A og C). Videre viste vi at kombinert behandling av TRAIL og LY294002 hemmer celledeling betydelig i forhold til begge substansene alene (Fig. 3B og D). Disse resultatene antyder sterkt at aktiveringen av Akt spiller en viktig rolle i TRAIL motstand i kreftceller.
A og C, effekt av PI3K-inhibitor LY294002 på TRAIL-fremkalt apoptose. Brystkreft celle T47D (
A
) og eggstokkreft celle OVCA432 (
C
) ble stående ubehandlet eller forbehandlet med 10 mm LY294002 (
LY)
i 30 min, og deretter behandlet med eller uten 100 ng /ml TRAIL i 6 timer. Totalt protein ble ekstrahert, og spaltet PARP og total og fosforylert Akt ble bestemt ved Western blotting.
B og D
, effekten av LY294002 på TRAIL-indusert veksthemming. T47D (
B
) og OVCA432 celler (
D
) forble ubehandlet eller forbehandlet med 10 uM LY294002 i 30 minutter, og deretter behandlet med eller uten 100 ng /ml TRAIL i 24 timer. Celleformering ble bestemt ved MTT-analyser og uttrykt i prosent av ubehandlede celler. Representant for tre uavhengige eksperimenter. **
P
0,001, statistisk signifikans; *,
P
. 0,01, statistisk signifikans
knockdown av Akt sensitizes brystkreft T47D celler til Trail
Selv om behandling med PI3K inhibitor LY294002 økt TRAIL indusert apoptose, kan resultatene ikke helt gjenspeiler den eksklusive rollen Akt i TRAIL motstand fordi LY294002 kan hemme andre kinaser. For å undersøke direkte rolle Akt aktivering i TRAIL motstand, brukte vi siRNA til knockdown Akt uttrykk og deretter bestemme effekten av Akt knockdown på TRAIL følsomhet. Vi transfektert T47D-celler med siRNA mot Akt (Akt 1, 2 og 3) eller kontrollere siRNA og viste at Akt var effektivt knock tømte ved Akt siRNA i celler med eller uten TRAIL behandling, sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA (Fig. 4B ). Viktigere, viste vi at knockdown av Akt sensibiliserte TRAIL indusert PARP-spaltning sammenlignet med de samme celler transfektert med kontroll siRNA (Fig. 4B). Videre knockdown av Akt økt TRAIL-indusert veksthemming mens slike endringer var minimal i celler transfektert med kontroll siRNA (Fig. 4A). Dermed våre resultater viser at mens TRAIL kan forårsake apoptose, aktiverer det også Akt overlevelse vei å motvirke TRAIL-indusert apoptose.
En
, effekten av Akt knockdown på celleproliferasjon. T47D-celler ble sådd ut på 6 x 10
5 per brønn i seks-brønns plater. Neste dag ble cellene transfektert med Akt eller kontroll sirnas bruker Oligofectamine. Etter 2 dager ble cellene ubehandlet eller behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 24 timer, og celleformering ble bestemt ved MTT-analyser. Celleproliferasjon data er uttrykt i prosent av ubehandlede celler. Representant for tre uavhengige eksperimenter. *,
P
0,01, statistisk signifikans.
B
, effekten av Akt knockdown på TRAIL-indusert apoptose. T47D-celler ble transfektert med Akt eller kontroll sirnas og deretter behandlet med eller uten TRAIL (100 ng /ml) i 24 timer som beskrevet i (
A
). Totalt protein ble ekstrahert for analyse av total og fosforylert Akt (
p-AKT
) og PARP av Western blot analyse. β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
Tap av PTEN overfører TRAIL motstand
Det har vært kjent at PTEN er en negativ regulator av Akt og at økt Akt aktiviteten har vært forbundet med inaktivering av PTEN i flere kreftformer. For å forstå mekanismen av Akt aktivering-mediert TRAIL motstand, vi behandlet PTEN
+ /+, PTEN
+/- og PTEN
– /- mus prostata epitelceller med TRAIL i 48 timer og målt celleproliferasjon av MTT-analyser. Fig. 5A viser at TRAIL-indusert ca 32% veksthemming i PTEN
+ /+ celler mens TRAIL ikke påvirke celledeling i PTEN
– /- celler, mens PTEN
+/- celler viste ca 13% veksthemming etter TRAIL behandling. Videre viste vi at Akt er aktivert i PTEN
– /- celler, men ikke i PTEN
+ /+, mens minimal aktivering i PTEN
+/- celler. Viktigere, TRAIL behandling forårsaket betydelig PARP spalting i PTEN
+ /+ celler, moderat spalting i PTEN
+/- celler og fullstendig fravær av spalting i PTEN
– /- celler (Fig. 5B). Disse resultatene tyder på at PTEN er nødvendig for TRAIL-fremkalt apoptose i mus prostata epitelceller.
Mus prostata epitelceller med villtype PTEN (PTEN
+ /+), PTEN knockout (PTEN
+/-
) og heterozygot (PTEN
– /-
) ble sådd ut i 96-brønners plater, og deretter behandlet med 100 ng /ml TRAIL i 48 timer. Celler proliferasjon ble bestemt ved MTT-analyser og uttrykt i prosent av ubehandlede celler. Representant for tre uavhengige eksperimenter. *,
P
0,01, statistisk signifikans.
B
, effekten av PTEN tap på TRAIL-indusert apoptose. PTEN
+ /+, PTEN
+/-, og PTEN
– /- celler ble behandlet med 100 ng /ml TRAIL i 48 timer som beskrevet i (
A
). Totalt protein ble ekstrahert for analyse av total og fosforylert Akt (
p-AKT
), PTEN og PARP av Western blot analyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
C
, sensitizes restaurert PTEN uttrykk PTEN
– /- celler til TRAIL. PTEN
– /- celler (5 × 10
5) ble infisert med adenovirus uttrykker villtype PTEN (
Ad-PTEN vekt
) eller uttrykke LacZ (
Ad-lacZ
). På 72 timer etter infeksjon ble cellene trypsinert og belagt i 60 mm rett på 5 × 10
5 celler. Den neste dag ble cellene ubehandlet eller behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 48 timer. Cellene ble høstet for MTT-analyser (
Øvre panel
) og Western blot analyse ble benyttet for å påvise nivåer av PARP og PTEN proteiner (
nedre panel
), henholdsvis. Celleproliferasjon data ble uttrykt som prosent av ubehandlede celler. Representant for tre uavhengige eksperimenter. **
P
0,001, statistisk signifikans.
D, etter hemming av PTEN funksjon av en dominant negativ form av PTEN overfører TRAIL motstand. PTEN
+ /+ og PTEN
+/–celler ble infisert med adenovirus som uttrykker en dominant negativ form av PTEN i 72 timer og deretter behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 48 timer. Celler ble enten anvendt for veksthemming av MTT-analyser (
øvre panel
) eller høstet for å detektere nivåer av PARP, PTEN, og total og fosforylert Akt ved Western blot-analyse (nedre panel). Celleproliferasjon data ble uttrykt som prosent av ubehandlede celler. Representant for tre uavhengige eksperimenter. *,
P
0,01, statistisk signifikans. **
P
0,001, statistisk signifikans
Siden PTEN
– /- cellene er resistente mot TRAIL, spurte vi om restaurering av PTEN uttrykk påvirker TRAIL følsomhet. i PTEN
– /- celler. PTEN
– /- celler ble infisert med adenovirus uttrykker villtype PTEN eller LacZ. Som vist på fig. 5C, PTEN uttrykk ble restaurert i celler infisert med adenovirus uttrykker PTEN men ikke i celler infisert med adenovirus uttrykker LacZ. Viktigere var vi i stand til å vise at restaurering av PTEN uttrykk gjengir PTEN
– /- (Fig. 5C) celler som er følsomme for TRAIL indusert apoptose og veksthemming, mens slike effekter ikke ble observert i celler infisert med kontroll virus. Siden PTEN
+ /+ cellene er følsomme for TRAIL, spurte vi om hemming av PTEN funksjon påvirker TRAIL-indusert apoptose i PTEN
+ /+ celler. For å oppnå dette, infiserte vi PTEN
+ /+ og PTEN
+/- celler med adenovirus som uttrykker en dominant negativ form for PTEN eller LacZ, og behandlede infiserte celler med TRAIL i 48 timer. Fig. 5D viser at innføringen av dominerende negativ form av PTEN økt p-Akt nivå i PTEN
+ /+ celler. Viktigere, innføring av et herredømme negativ form av PTEN gjengir PTEN
+ /+ og PTEN
+/- cellene mer motstandsdyktige mot TRAIL (Fig. 5D). I samsvar med den rollen Akt i hemme apoptose, ble TRAIL indusert PARP cleavage sunket dramatisk i PTEN
+ /+ og PTEN
+/- celler etter at de ble infisert med virus som uttrykker en dominerende negativ form av PTEN. Videre viste vi at TRAIL-indusert veksthemming i PTEN
+ /+ celler infisert med et adenovirus som uttrykker en dominerende negativ form av PTEN ble ca 5%, men ca 27% i de samme cellene infisert med kontroll adenovirus (Fig. 5D ). Vi har også vist at i PTEN
+/- celler infisert med dominant negativ form av PTEN, celleproliferasjon ble omtrent 102% sammenlignet med de samme celler infisert med kontrollvirus hvori celleproliferasjonen var omtrent 81% ved TRAIL behandling (Fig . 5D, øvre panel).
rollen PTEN i TRAIL følsomhet i brystkreft T47D celler
Siden brystkreft T47D celler med en vill-type PTEN var resistente mot TRAIL (fig. 1 ), spurte vi om modulering av PTEN funksjon vil påvirke TRAIL følsomhet i T47D celler. For å oppnå dette, infiserte vi T47D-celler sammen med adenovirus som uttrykker en dominant negativ form for PTEN eller kontrollvirus og deretter behandlet infiserte celler med TRAIL (100 ng /ml) i 48 timer, og effekten av slik behandling på TRAIL følsomhet ble bestemt. Fig. 6 viser at celler infisert med adenovirus som uttrykker en dominant negativ form av PTEN uttrykker et høyere nivå av p-Akt lenge en slik økning ikke ble observert i celler infisert med adenovirus som uttrykker LacZ, noe som antyder at PTEN funksjon ble inhibert med en dominant negativ form PTEN (fig. 6B). I samsvar med den rolle Akt i å hemme apoptose, ble spaltet PARP signifikant redusert i celler som uttrykker en dominant negativ form av PTEN sammenlignet med celler som uttrykker kontrollvirus (fig. 6B). Videre er overekspresjon av en dominant negativ form for PTEN gjør T47D-celler mer resistente mot TRAIL sammenlignet med de samme celler infisert med virus som uttrykker LacZ (fig. 6). Derfor er disse dataene tyder på at økt Akt aktivering på grunn av inaktivering av PTEN kunne gi TRAIL motstand i kreftceller.
En
, effekten av hemming av PTEN-funksjonen på celleproliferasjon. T47D-celler (8 x 10
5) ble infisert med adenovirus som uttrykker en dominant negativ form for PTEN eller adenoviruser som uttrykker LacZ i 72 timer og deretter behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 48 timer. Celleformering ble bestemt ved MTT-analyser. Celleproliferasjon data er uttrykt i prosent av ubehandlede celler. Representant for tre uavhengige eksperimenter. *,
P
0,01, statistisk signifikans.
B
, effekten av hemming av PTEN funksjon på apoptose. T47D celler infisert med adenovirus som beskrevet i A, ble behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 48 timer og deretter høstet for å analysere nivåene av PARP, PTEN, total og fosforylert Akt proteiner ved Western blot-analyse (
nedre panel
). β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
Diskusjoner
I denne studien, viser vi at TRAIL aktiverer Akt overlevelse sti i TRAIL-resistente kreftcellelinjer. Vi viser også at den underliggende mekanismen kan skyldes tap av funksjonelle PTEN fordi PTEN knockout mus prostata epitelceller er motstandsdyktig mot TRAIL mens celler med intakt PTEN er følsomme for TRAIL. Gjenopprette PTEN uttrykk gjengitt PTEN
– /- cellene følsomme for TRAIL. Videre, inaktivering av PTEN øker nivået av TRAIL motstand i T47D-celler. Disse funn antyder at aktiveringen av Akt overlevelsesreaksjonsveien spiller en avgjørende rolle i TRAIL motstand, og at den Akt reaksjonsveien er et potensielt terapeutisk mål å forbedre TRAIL-basert terapi.
Aktiveringen av Akt veien har vært implisert i å beskytte celler av mange døds stimuli, for derved å givende celleoverlevelse [10], [13]. Tidligere studier antydet at overekspresjon av Akt og dens oppstrøms regulator PI3K økt TRAIL motstand i bryst og eggstokk-kreft celler [23], [24]. Imidlertid er den underliggende mekanisme for dens motstand ikke fullt ut forstått. I denne studien viste vi at mens TRAIL induserer apoptose i kreftceller, aktiverer den også flere overlevelsesreaksjonsveier, noe som kan motvirke TRAIL-fremkalt apoptose, som fører til resistens. I mange TRAIL motstandsdyktig bryst- og eggstokk-kreft-cellelinjer, men ikke sensitive cellelinjer, ble Akt veien aktivert (fig. 2), hvilket antyder at aktiveringen av Akt bane kan være en vanlig hendelse i TRAIL-resistente celler. I samsvar med denne oppfatningen, fant vi at hemming av Akt aktivering av den farmakologiske inhibitor LY294002 eller knockdown av dens uttrykk av siRNA sensitizes TRAIL-resistente celler til TRAIL. Sammen er disse data antyder sterkt at aktivering av Akt overlevelsesreaksjonsveien spiller en avgjørende rolle i TRAIL motstand i ovarier og brystkreftceller og antyder at inhibering av denne overlevelsesreaksjonsveien kan overvinne TRAIL motstand.
viste også at inhibering av PI3K-aktivitet blokkert Akt aktivering i TRAIL-resistente cellelinjer. Siden PI3K kan tjene som et oppstrøms positiv regulator av Akt Disse resultatene tyder på at øket Akt aktivering er i det minste delvis gjennom den økte aktivering av PI3K-aktivitet. Ved nedstrøms nivå, er det velkjent at Akt utøver sine biologiske funksjoner ved fosforylering nedstrøms substrater inkludert mTOR. Aktivering av mTOR kan øke protein translasjon, noe som resulterer i celleoverlevelse [13]. I samsvar med dette, fant vi at TRAIL behandling kan føre til mTOR fosforylering og påfølgende aktivering. Våre data antyder at TRAIL kan aktivere PI3K /Akt /mTOR veien for å motvirke TRAIL-fremkalt apoptose, som fører til TRAIL motstand.
i kreftceller, kan det Akt overlevelsesreaksjonsveien aktiveres av flere mekanismer, inkludert inaktivering av dens oppstrøms negativ regulator PTEN. Ved dephosphorylating og konversere PIP3 til PIP2 hemmer PTEN Akt aktivering og deretter sensitizes celler til døden [10], [13]. I samsvar med rollen som PI3K /Akt sti i TRAIL motstand, fant vi at tap av PTEN i mus prostata epitelceller overfører TRAIL motstand mens de samme cellene med intakt PTEN er følsomme for TRAIL mens PTEN
+/- cellene vise mellom motstand. Disse dataene tyder på at PTEN spiller faktisk en viktig rolle i TRAIL følsomhet. Videre viste vi at gjeninnføring av en mutant form av PTEN inn TRAIL resistente T47D celler øker TRAIL motstand videre. Sammen er disse dataene viser at i TRAIL resistente celler, tap av PTEN bidrar til Trail motstand. Det har vært kjent at redusert eller tap av PTEN ekspresjon forekommer i minst 50% av bryst- og eggstokk-kreft [25]. Det er mulig at TRAIL motstandsdyktig bryst- og eggstokk-kreft celler har redusert nivå av PTEN, som trenger videre undersøkelser. Videre en fersk undersøkelse viste at overekspresjon av MIR-221 222 ned regulerer PTEN, som fører til økt aktivering av Akt og påfølgende TRAIL motstand [26]. I tillegg TRAIL motstandsdyktig leukemiceller uttrykte et høyere nivå av fosforylert inaktiv form av PTEN, noe som resulterte i en økning i Akt aktivering og TRAIL motstand [27].
