Abstract
Hensikten med denne studien var å undersøke anti-tumor effekt og mulige mekanismer i.p. hypertermi i kombinasjon med α-galaktosylceramid (α-GalCer) for behandling av eggstokkreft. I denne studien ble immuno-kompetente tumormodeller etablert ved hjelp av murine ovarie cancer cellelinjer og behandlet med i.p. hypertermi kombinere α-GalCer. Th1 /Th2 cytokin uttrykk profiler i serum, NK-celle cytotoksisitet og phagocytic aktiviteter dendrittiske celler (DCS) ble analysert. Vi har også analysert antall CD8
+ /IFN-γ
+ tumorspesifikke cytotoksiske T-celler, samt tumorveksten basert på uttømming av lymfocytt sub-populasjon. Terapeutisk virkning på de ovarietumorer ble overvåket ved en ikke-invasiv luminescerende bildedanningssystem. Intra-peritoneal hypertermi induserte signifikant pro-inflammatoriske cytokiner uttrykk, og vedvarende respons til NK og DC indusert av α-GalCer behandling. Kombinasjonen behandling forbedret cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) immunrespons i to muse eggstokkreft modeller. Denne nye behandlingsform ved kombinasjon av hypertermi og glykolipid gir en markert anti-tumor immunrespons og bedre overlevelse. I konklusjonen, intra-peritoneal hypertermi forbedret pro-inflammatorisk cytokin sekresjon og phagocytic aktivitet av DC stimulert av α-GalCer. Den påfølgende CTL immunrespons indusert av α-GalCer ble ytterligere styrket ved å kombinere med i.p. hypertermi. Både medfødte og ervervede immunitet var involvert, og resulterte i en overlegen terapeutisk effekt i behandling av eggstokkreft
Citation. Wu C-C, Chuang Y-T, Hsu Y-T, Huang J-T, Wu T-C, Hung C-F, et al. (2013) Intra-peritoneal Hypertermi Kombinere α-galaktosylceramidet i behandling av eggstokkreft. PLoS ONE 8 (7): e69336. doi: 10,1371 /journal.pone.0069336
Redaktør: Moriya Tsuji, Aaron Diamond AIDS Research Center med Rockefeller University, USA
mottatt: 15 februar 2013; Godkjent: 07.06.2013; Publisert: 23.07.2013
Copyright: © 2013 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av et stipend fra Taiwan National Science Council (NSC 98-2314-B-195-008-My3). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Selv om eggstokkreft utgjør bare 3% av alle kreftformen hos kvinner, er det den mest dødelige gynekologisk kreft på verdensbasis [1]. På grunn av fravær av spesifikke symptomer eller tegn og mangel på pålitelige screening modaliteter i tidlig sykdom, kreft i eggstokkene hovedsakelig diagnostisert på et avansert stadium [2] – [4]. Foreløpig standard forhånd behandling for ovarialcancer består av maksimal cytoreduserende kirurgi etterfulgt av adjuvant kjemoterapi med platina-taxan kombinasjonsregimet. Selv om responsraten er ca 70-80%, vil de fleste av disse pasientene til slutt tilbakefall. Til tross for den økende antall kjemoterapeutiske legemidler tilgjengelig for tilbakevendende sykdom, er i løpet av eggstokkreft vanligvis kjennetegnet ved gjentatte perioder av remisjon og tilbakefall, og i de fleste tilfeller av sykdommen til slutt vil utvikle resistens mot alle kjemoterapeutiske midler og blir uhelbredelig [5]. Basert på den biologiske atferd og spredning mønster av eggstokkreft celler, flere i.p. behandlingsopplegg har blitt argumentert for å oppnå bedre sykdomskontroll [6]. Blant dem, i.p. hypertermi, spesielt når kombinert med kjemoterapi, har vist seg å forbedre den terapeutiske effekt, enten for optimalt eller sub-optimal debulked eggstokkreft [7], [8]. Det har blitt rapportert at høy temperatur kan indusere direkte termisk cytotoksisitet og også bringe «termisk chemo-allergi» [9]. Det er generelt antatt at de overfølsomhets resultatene fra øket vevsperfusjon og gjennomtrengning av de cytotoksiske midler vev. Selv om de grunnleggende mekanismer for hypertermi er generelt godt akseptert, anvendelsen av terapeutiske hypertermi i kombinasjon med kjemoterapi for pasienter er mye mer kompleks [10]. Hyperthermic kjemoterapi (42-43 ° C) har vært kjent for å være forbundet med større cytotoksisitet overfor kreftceller. Det er imidlertid noen ulemper som begrenser dens bruk i behandling av ovarialcancer, slik som potensiell dårlig heling av tarm-anastomose, risiko for kjemoterapeutiske metabolitter forurensning til de kirurgiske personell gjennom kroppsvæske eller inhalering av fordamper kjemoterapeutika [11]. Videre kan det ikke brukes gjentatte ganger uten at utforskningen av bukhulen.
hypertermi i seg selv er blitt vist å utøve en serie av cellulære og molekylære virkninger, særlig for å frembringe komplekse immunologiske endringer i verts [12], [ ,,,0],1. 3]. Spesielt, er hypertermi i stand til å opp-regulerer ekspresjonen av varmesjokkprotein på tumorcellene, og som er forbundet med antigen-presentasjon, på tvers presentasjon og anti-tumor immun [14]. Alle disse data gir begrunnelsen ved å øke den anti-tumor effekten av hypertermi ved å kombinere med immun-modulerende midler.
glykolipider, såsom α-galaktosylceramid (KRN7000, α-GalCer, en glykosphingolipid) har vist seg å hemme tumorvekst og forlenge overlevelsen i noen få musetumormodeller gjennom aktivering av medfødte og ervervede immunresponser [15], [16]. Flere kliniske studier har også dokumentert sikkerhet og biologiske effekter hos pasienter med solide tumorer gjennom parenteral levering [17], [18]. Denne forbindelsen er ikke i seg selv et cytotoksisk middel, men kan bli presentert til NKT-celler ved CD1d [19], [20]. α-GalCer-aktivert NKT-celler ble rapportert å utskille store mengder av cytokiner, inkludert IFN-γ og IL-4, og derved aktivisere andre Effektor celler, så som NK-celler, T-celler, B-celler og makrofager DCS [16]. Administreringen av α-GalCer i dyr kan også indusere produksjonen av andre cytokiner, slik som IL-2, IL-6, IL-12 og GM-CSF, som også kan forsterke immunforsvaret [21].
Vi antok at hypertermi ikke bare er cytotoksisk, men også i stand til å avsløre immunogenisiteten til tumorceller, med å styre immunresponsen over mikromiljøet til både Th1 /Th2-trasé. Vi foreslått at tilsetningen av α-GalCer kan indusere aktivering av NKT-celler, så vel som modningen av DC. Etter behandling med α-GalCer, er en sterk cytokin kaskade senere fremkalte, og dermed øke krysstale mellom medfødte og ervervede anti-tumor immunresponser.
I denne studien benyttet vi ulike murine eggstokkreft celler som modeller for å teste våre hypoteser og å undersøke anti-tumor effekt og underliggende mekanismene for ip hypertermi kombinert med α-GalCer i behandling av eggstokkreft.
Materialer og metoder
Mus og cellelinje
C57BL /6 mus og BC3F1 (C57BL /6 × C3H F1) mus ble kjøpt fra BioLASCO, Taiwan. Dyrene ble tatt vare under spesielle patogenfrie forhold. Musen eggstokkreft cellelinje MOSEC-luc (C57BL /6 opprinnelse og konstruert uttrykk for ildflue luciferase), ID8-luc (avledet fra MOSEC-luc med VEGF over-uttrykk), og HM-1 (BC3F1 opprinnelse) ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco) supplementert med 10% FBS (Biological Industrial, Israel), 100 U /ml penicillin (Gibco) og 100 pg /ml streptomycin (Gibco) i en fuktet atmosfære av 5% CO
2/95% luft ved 37 ° C.
Etikk erklæringen
Alle forsøkene fulgt retningslinjene med hensyn til eksperimentell dyrevelferd og fikk tillatelse av IUAUC fra Mackay Memorial Hospital (MMH-AS-97030).
Intra-peritoneal Hypertermi og α-GalCer Behandling
For å utføre ip hypertermi, utforsk laparotomi ble utført etter musene ble bedøvet med Zoletil (VIRBAC, Frankrike) og Rompun (Bayer Vital GmbH, Leverkusen) først. Bukhulen til hver mus ble stadig fylt med 45 ° C 1 x PBS. Oppvarmet PBS ble etterfylt å erstatte avkjølt PBS ved hyppigheten av 20~30 sec /sykle til sammen 10 minutter. I den kombinerte behandlingsgruppe, ble 2 ug av α-GalCer (Enzo Life Science, USA) satt inn i bukhulen umiddelbart etter fullføring av hypertermi. Bukhulen ble også åpnet i 10 minutter i kontrollgruppen av mus. Mus ble holdt varme under varme lys før de utvinnes fra anestesi.
Multiplex Serum Cytokine Detection
venøst blod høstet fra halen til hver mus ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter og deretter sentrifugert ved 1500 x g i 10 min. Supernatanten serum ble overført til et annet rent rør og lagret ved -20 ° C før analyse. Konsentrasjonen av IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, INF-α, og TNF-α i serum hos hver mus ble påvist ved BD cytometrisk Bead Array kit (BD Bioscience) som beskrevet av produsenten.
Primær Cell Isolasjon og NK /NKT Cell Detection
for å isolere de hvite blodceller (WBC), perifert blod ble samlet fra halevenen til mus. RBC-ene i blod ble fjernet ved ACK lyseringsbuffer (Invitrogen) og WBC ble deretter resuspendert i RPMI 1640 før analyse. For å isolere cellene i bukhulen ble musene avlivet ved CO
2 eutanasi. Cellene i bukhulen ble samlet ved peritoneal lavage med 3% BSA i kald 1 x PBS. Celler utvunnet fra kylling ble vasket og resuspendert i RPMI 1640 medium. Cellene ble deretter farget med FITC-anti-CD3 og PE-anti-NK1.1 antistoff som fremstillingen beskrevet (eBioscience). Bestander av NK og NKT-celler ble detektert ved strømningscytometri. (Calibur, BD Biovitenskap). Resultatene ble analysert ved FACS uttrykkelig programvare.
Påvisning av Cancer Cell apoptose
En million av ID8-Luc celler ble injisert intra-peritonealt i hver C57BL /6 mus i den eksperimentelle gruppen. Tre dager senere, i.p. hypertermi ble gitt i tumorbærende mus som beskrevet tidligere. Ingen intervensjon ble utført i kontrollgruppen av mus med unntak av åpning /lukking av bukhulen. En dag senere, ble musene avlivet av CO
2 dødshjelp. Celler i bukhulen ble lavaged og farget med Annexin V-APC og propidiumjodid (PI, BD biovitenskap), og deretter utsatt for analyse av flowcytometri.
Cytotoksisitet av Peritoneal Effektor celler
tyve tusen ID8-Luc celler ble sådd i hver brønn i rundbunnede 96-brønners plater som målceller. Disse platene ble forseglet med parafin og sette på væskeoverflaten på 42 ° C vannbad og inkubert i 20 min. De lavaged celler (fra kontrollgruppen eller α-GalCer-behandlede gruppe mus) som Effektor-celler ble deretter tilsatt til ID8-luc celle som inneholder godt med effektorer /target (E /T) forhold på 05:01 og 10:01 , og dyrket ved 37 ° C over natten. Etter tilsetning av luciferin (Sylinder), ble mengden av overlevde ID8-Luc-celler presentert som intensiteten av kemoluminescens detekteres av IVIS avbildningssystem. (Xenogen).
Dendritic Cell Fagocytose analysen
in vitro
To mikrogram α-GalCer var i.p. injisert i C57BL /6 mus og stående over natten. Musene med og uten α-GalCer behandling ble avlivet og milten ble overført til RPMI 1640 medium. De splenocytter ble isolert ved å knuse milten på 100 mikrometer celle sil i 6 cm tallerken inneholder 5 ml RPMI 1640 medium. De suspenderte cellene ble vasket og RBC-ene ble fjernet ved ACK lyseringsbuffer (Invitrogen). DCS i disse splenocytter ble renset ved hjelp av anti-CD11c magnetiske kuler (MACS, Tyskland). For fagocytose assay, ble ID8-Luc-celler farget med 25 pM av CFSE (Sigma), og deretter ble gitt varmebehandling som tidligere beskrevet. Rensede DC fra kontrollgruppen eller α-GalCer-behandlede gruppe mus ble deretter ko-dyrket med 1 x 10
5 av enten oppvarmede eller ikke-oppvarmede CFSE-farget ID8-Luc-celler i 6 timer. DC var merking ved farging med APC-anti-CD11c antistoff (eBioscience). Prosentandelen av CFSE-positive DC ble analysert ved flowcytometri med gating av CD11c positive celler.
Dendritic Cell Fagocytose analysen
in vivo
En million av CFSE-farget (25 mm) ID8-luc celler ble ip injisert i C57BL /6 mus. På de neste dagene, ble alle mus delt inn i 4 grupper og gitt i.p. hypertermi og /eller 2 ug a-GalCer. Mus fikk bare laparotomi (uten behandling) ble satt som kontrollgruppe. Etter 24 timer ble intra-peritoneal celler lavaged og farget med PE-anti-mus CD11b og APC-anti-mus CD11c antistoffer (eBioscience). Prosentandelen av CFSE-positive DC ble analysert ved flowcytometri ved gating av CD11b
+ /CD11c
+ positive celler.
tumorspesifikke CD8
+ T celle immunanalysen
En million av HM-1 celler ble ip injisert i B6C3F1 mus og 3 × 10
5 av ID8-Luc celler ble injisert intra-peritonealt i C57BL /6 mus. Tre dager senere ble musene bedøvet og behandlet i.p. med eller uten α-GalCer. Etter at en eller tre uker ble musene avlivet for å isolere splenocytter. Splenocytter (1 x 10
7) ble dyrket med eller uten 1 x 10
5 av de syngenetic kreftcellene (de som var blitt injisert inn i bukhulen på mus) med 1 ug av Golgi-plugg (BD Pharmingen ) i 24-brønners plater. På neste dag ble cellene farget med APC-konjugert monoklonalt rotte-anti-muse-CD8a (eBioscience) i 20 minutter, og fiksert med Cytofix /Cytoperm kit (BD Pharmingen), etterfulgt av farging med FITC-konjugert rotte-anti-mus-interferon -γ (eBioscience) som produserer beskrevet. Antallet CD8 /interferon-y positive celler ble analysert ved flowcytometri.
Ikke-invasive tumorvekst Måling
En million av MOSEC-Luc cellene i.p. injisert i C57BL /6 mus. Etter en uke, i.p. hypertermi ble utført med eller uten α-GalCer behandling. Tumorvekst av MOSEC-Luc celler i mus ble oppdaget av non-invasiv kemoluminescens bildesystem (IVIS, Xenogen).
Nedbryting lymfocytt underpopulasjoner
En million MOSEC-Luc cellene i.p. injisert i C57BL /6 mus. Fem dager senere ble musene delt i 4 grupper og fikk i.p. injeksjon av enten 100 ug anti-mus CD4 (klon GK1.5), anti-muse-CD8 (klon TIB210) eller rotte-IgG-kontroll (Millipore) antistoffer ved en to-dagers intervall. Alle mus ble gitt i.p. hypertermi kombinert med 2 ug α-GalCer en uke etter tumor-inokulering. Tumorvekst ble målt ved ikke-invasive IVIS avbildningssystem som tidligere beskrevet.
statistikker og
Alle resultater ble representert ved gjennomsnitt ± SE (standardavvik) fra minst to uavhengige eksperimenter. Sammenligningene mellom ulike datapunkter ble utført ved hjelp av ANOVA test eller en student T test. Overlevelsen var representert ved Kaplan-Meier kurve og sammenlignet ved hjelp av lang-rankanalyse.
Resultater
Intra-peritoneal Hypertermi Forbedret sekresjon av proinflammatoriske cytokiner indusert av α-GalCer
de viktigste antitumoreffekter av α-GalCer er antatt å være ved modulering av immunnedstrøms kaskader ved å stimulere Th1 /Th2 cytokin produksjon av NKT-celler. Med unntak av IL-5, i.p. hypertermi ytterligere forbedret sekresjon av disse seks cytokiner innledningsvis fremkalt ved i.p. a-GalCer behandling. Vi først undersøkt om tillegg av i.p. hypertermi er i stand til å påvirke ekspresjonen av disse cytokinene stimulert av α-GalCer installasjon. Figur 1 viser at i.p. hypertermi alene ikke endre nivåene av Th1 /Th2 cytokiner, mens i.p. a-GalCer administrering utløste sekresjon av flere cytokiner, som nådde sitt høyeste nivå ved forskjellige tidspunkter. Nivåer av IL-2 (p = 0,0003, α-GalCer
versus
kontroll), IL-4 (p = 0,0012, α-GalCer
versus
kontroll), IL-6 (p 0,0001, α-GalCer
versus
kontroll), og vev nekrotisk faktor alfa (TNF-α) (p = 0,0007, α-GalCer
versus
kontroll) toppet seg i 6 timer, mens IL- 5 og IL-13 på topp i 12 timer (p = 0,0013, α-GalCer
versus
kontroll for IL-5; p 0,0001, α-GalCer
versus
kontroll for IL-13) . Det tok opptil 24 timer for IFN-γto oppnå sitt høyeste nivå (p 0,0001, α-GalCer
versus
kontroll). Bortsett fra IL-5, i.p. hypertermi ytterligere forbedret sekresjon av disse fem cytokiner innledningsvis fremkalt ved i.p. α-GalCer behandling (p = 0,0056, for IL-2; p = 0,0041, for IL-4; p 0,0001 for IL-6; p = 0,0058, for IFN-γ og p = 0,018 for TNF-α). Denne modusen for behandlingen også forbedret sekresjon av IL-13 (p 0,0001, hypertermi pluss α-GalCer versus α-GalCer alene) som toppet seg tidligere på 6 timer etter behandling. Disse resultatene indikerte at α-GalCer kan indusere sterkere anti-tumor immunrespons hovedsakelig gjennom forbedring av Th1 /Th2 cytokiner uttrykk ved å kombinere med i.p. hypertermi.
C57BL /6 mus ble delt inn i 4 grupper med fem mus i hver gruppe og behandlet med i.p. hypertermi bare ved 43 ° C i 10 min, i.p. tilsatt 2 ug α-GalCer, og kombinerer begge deler. Kontrollgruppen Musene ble bare utført unders laparotomi i 10 min. Museserum ble samlet ved 6, 12 og 24 timer etter behandling. IL-2, IL-4, IL-5, interferon-γ, TNF-α, ble IL-6 og IL-13 konsentrasjoner av serum påvises ved multipleks CBA kit. Noen cytokinnivåer ble økt med α-GalCer og nådde en topp på 6 timer etter behandlingen (IL-2, p = 0,0003, α-GalCer stående
versus
kontroll), (IL-4, p = 0,0012, α -GalCer alene
versus
kontroll), (IL-6, p 0,0001, α-GalCer
versus
kontroll), (TNF-α, p = 0,0007, α-GalCer
versus
kontroll); Noen nådde en topp på 12 timer etter behandlingen (IL-5, p = 0,0013, α-GalCer
versus
kontroll) (IL-13, p 0,0001, α-GalCer
versus
kontroll); en topp på 24 timer etter behandling (INF-γ, p 0,0001, α-GalCer
versus
kontroll). Med unntak av IL-5, er Th1 /Th2 cytokin-nivåer høyere i kombinerte behandlingsgruppe enn a-GalCer alene (IL-2, p = 0,0056, IL-4, p = 0,0041; TNF-α, p = 0,018; INF -γ, p = 0,0058). Toppnivået av IL-13 ble nådd tidligere i den kombinerte behandlingsgruppen og nivået var mye høyere enn for α-GalCer alene (p 0,0001). Disse resultatene antydet at α-GalCer behandling kan utløse immunrespons mot Th1 /Th2 rute og hypertermi kan ytterligere forsterke denne effekten. (# P 0,05, * p 0,01; ** p 0,001; *** p 0,0001).
α-GalCer Behandling utstilt Synergistic cytotoksiske effekter Against Oppvarmet eggstokkreft celler
det er blitt vist at de viktigste antitumoreffektene indusert ved α-GalCer er gjennom frigjøring av visse cytokiner, som utvider aktivitetene til NK og T-celler. For å undersøke om α-GalCer behandling har en innvirkning på aktiviteten til NK-celler, overvåket vi NK-cellen befolkningen på ulike tidspunkter etter intraperitoneal a-GalCer behandling. I perifert blod, har NK-cellepopulasjon ikke endrer seg vesentlig i løpet av første 24 timer. Men andelen av NK-celler dramatisk økt 72 timer etter behandlingen (Figur 2A; p 0,001, 72 t
versus
andre tidspunkter). Inne i bukhulen, økt NK-cellepopulasjonen i 3 timer etter at α-GalCer administrering, og tilsetning av i.p. hypertermi påvirket ikke trinn (figur 2B).
(A) 2 ug α-GalCer ble injisert ip 5 C57BL /6 mus og halevenen blod ble oppsamlet ved 0,5, 1, 3, 6 , 24, og 72 timer etter behandling. Andelen variasjon av NK-celler i perifert blod ble analysert ved hjelp av strømningscytometri med fluorescerende CD3 og NK1.1 antistoff farging. Resultatene viste at α-GalCer vesentlig rekruttert NK-cellepopulasjonen i perifert blod 72 timer etter behandling. (P 0,001, 72 hr
versus
på andre tidspunkter) (B) C57BL /6 mus ble delt inn i 4 grupper og behandlet ved intraperitoneal hypertermi ved 43 ° C, 2 ug α-GalCer, eller en kombinasjon. Kontrollgruppen Musene ble bare åpnet magen i 10 minutter. Intra-peritoneale celler ble høstet ved peritoneal lavage 3 timer etter behandling. Variasjon på proporsjonene av intra-peritoneal NK-celler ble analysert ved flowcytometri med fluorescerende CD3 og NK1.1 antistoff farging. Resultatene underforstått i.p. a-GalCer administrering økt lokal NK-celleandelen i løpet av få timer. Kombinasjon av hypertermi ikke kompromiss denne effekten. (P = 0,0007, α-GalCer
versus
kontroll, p = 0,0009, α-GalCer
versus
hypertermi; ingen signifikant forskjellig mellom α-GalCer alene og kombinert behandling) (C) ID8 tumor -holdige C57BL /6-mus ble behandlet med intra-peritoneal hypertermi ved 43 ° C i 10 min. En dag etter behandling ble det intra-peritoneale celler lavaged og farget med Annexin V og PI. Kreftcellene ble inngjerdet og apoptotiske indeksen ble analysert ved flowcytometri. Andelen av apoptotiske kreftceller ble øket etter intra-peritoneal hypertermi. (P = 0,0084, hypertermi
versus
kontroll) (D) 2 x 10
4 av ID8-Luc-celler ble sådd på 96-brønners rund knapp plater og oppvarmet på 42 ° C vannbad i 20 minutter . Forskjellige forhold mellom intra-peritoneal lavaged celler fra mus i.p. injisert med eller uten α-GalCer ble deretter lagt inn i tillegg til Effektor celler og co-dyrket over natten med oppvarmet eller ikke-oppvarmet ID8-Luc celler som målceller. Ikke-oppvarmede ID8-Luc celler co-dyrkede med lavaged celler uten behandling α-GalCer ble brukt som kontroll. Cytotoksisiteten representert ved intensiteten av chemoluminence ble påvist ved IVIS avbildningssystem. Resultatene viste at ko-kultur av oppvarmet kreftcelle med intra-peritoneale celler fra lavage α-GalCer-behandlede mus induserte høyest cytotoksisitet av kreftceller in vitro. (På E /T-forholdet = 5:01, p 0,0001, varme pluss α-GalCer
versus
kontroll; p = 0,0162, varme pluss α-GalCer
versus
varme; p = 0,0004 termo pluss α-GalCer
versus
a-GalCer). (# P 0,05, ** p 0,001; *** p 0,0001).
hypertermi har blitt rapportert å forårsake død av kreft celler. I ID8 tumorbærende mus, ble mer apoptotiske ID8 celler (ip) funnet i mus behandlet ved hypertermi enn de i kontrollmusene (Figur 2C; p = 0,0084, hypertermi
versus
kontroll)
i
ex-vivo
ko-kulturen, ble det også funnet at oppvarmet ID8 celler var mer utsatt for peritoneale lavaged celler oppnådd fra α-GalCer-behandlede mus (figur 2D; p = 0,0004, oppvarmet
versus
ikke-oppvarmede ID8 celler på E /T-forholdet 5:01). Disse resultatene antydet at i.p. administrasjon av α-GalCer kan rekruttere flere NK-celler, noe som fører til økt kreftcelle drapet, og hypertermi induserer en ekstra cytotoksisk effekt på kreftceller.
Behandling Kombinere i.p. Hypertermi med α-GalCer skapt en synergistisk effekt på DCs «Fagocyttiske Aktiviteter
in vitro og in vivo
En av de anti-tumor aktivitet av NKT celler involverer aktivering av DC. Hovedfunksjonen til DC i anti-tumor-immunitet er å sluke tumorcellene og tilstedeværende tumorantigener til de relevante Effektor-celler, såsom cytotoksiske T-celler. Vi undersøkte videre de resulterende effektene av α-GalCer behandling med hypertermi på fagocyterende aktiviteter DC. Basert på ko-kultur av kreftceller med DC isolert fra milt, er det funnet at oppvarmet kreftceller var mer utsatt for DC «fagocytose (figur 3A; p = 0,005, hypertermi
versus
kontroll). Videre DC isolert fra α-GalCer-behandlede mus viste betydelig høyere aktivitet av fagocytose (p = 0,0037, α-GalCer
versus
kontroll). Å sette sammen, co-kulturen i de oppvarmede kreftceller med DC hentet fra α-GalCer-behandlede mus demonstrerte mye mer fagocytose (p = 0,0002, kombinert behandling
versus
kontroll; p = 0,0008, kombinert behandling
versus
hypertermi, p = 0,005, kombinert behandling
versus
α-GalCer). Resultatene viste at α-GalCer behandling pluss hypertermi som fører til en synergistisk effekt på DCs «fagocytose
in vitro.
Gitt at den kombinerte behandlingen ble gitt for å oppnå intra-peritoneal kreftceller, vi analyserte phagocytic aktiviteter intra -peritoneal DCs innhentet gjennom peritoneal lavage. Ved å telle antall CFSE-farget CD11b
+ /CD11c
+ DC, bemerkes det at α-GalCer forbedret phagocytic aktiviteter i.p. DC (p = 0,0289, α-GalCer
versus
Control) og hypertermi pluss α-GalCer ytterligere forsterket denne effekten (p = .0.038, kombinert
versus
α-GalCer alene). Resultatene viste klart at α-GalCer behandling plus hypertermi også fører til en synergistisk effekt på DC «fagocytose inne i bukhulen.
(A) C57BL /6 mus ble først i.p. injisert med to mikrogram av α-GalCer. Etter 18 timer ble musene avlivet og DC ble renset fra milt ved hjelp av anti-CD11c magnetiske kuler. For dendrittisk celle fagocytose analysen ble cellene ID8 første farget med CFSE og oppvarmet på 42 ° C vannbad i 20 minutter. DCS fra α-GalCer stimulert (eller ikke-stimulerte) mus ble ko-dyrket med oppvarmede eller ikke-oppvarmede ID8 celler i 6 timer ved forholdet 05:01. Andelen av DC med fagocytisk aktivitet ble representert som CFSE positiv i gated CD11c uttrykkende celler analysert ved flow-cytometri. Resultatene viste at både
in vitro
varmebehandling på kreftceller og
in vivo
stimulering av DC ved α-GalCer kunne øke den fagocytisk aktivitet av DC (p = 0,005, varme
versus
kontroll; p = 0,0037, α-GalCer
versus
kontroll). Den synergistisk effekt dukket opp i den kombinerte behandlingen (p = 0,0002, kombinert behandling
versus
kontroll; p = 0,0008 kombinert behandling
versus
varme; p = 0,005, kombinert behandling
mot
α-GalCer). (B) C57BL /6 mus var i.p. injisert med 1 × 10
6 CFSE-fargede ID8 celler. På den neste dag, ble musene inndelt i fire grupper med behandling ved i.p. hypertermi og /eller α-GalCer som tidligere beskrevet. En dag senere ble intra-peritoneale celler høstet ved i.p. lavage og andelen CFSE-positive CD11b
+ /CD11c
+ celler indikerer fagocyterende aktiviteter av DC ble analysert ved flowcytometri. Det er vist at α-GalCer behandling kan øke fagocytose av DC
in vivo product: (p = 0,0289, α-GalCer
versus
kontroll). Denne effekten ble ytterligere forsterket av ytterligere hypertermi (p = 0,038, kombinert behandling
versus
α-GalCer). (# P 0,05, * p 0,01; ** p 0,001).
Kombinasjon av Intra-peritoneal Hypertermi og α-GalCer fremkalte en tumor-spesifikke cytotoksiske CD8
+ T Cell immunrespons
Siden α-GalCer behandling kan forbedre phagocytic aktiviteter DC og hypertermi kan ytterligere forsterke denne effekten, vil det neste spørsmålet være om kombinasjon av ip hypertermi og α-GalCer behandling kan indusere tumorspesifikke cytotoksiske T-cellerespons. For å vurdere nærværet av cellulær immunrespons mot kreftceller, i to forskjellige museeggstokkkreftceller, HM-1 og ID8-luc, ble anvendt som immuno-kompetente tumormodeller. Syv dager etter behandling, behandling av HM-1-bærende mus med α-GalCer alene bare øke et lite antall tumor-spesifikke CD8
+ T-celler i løpet av splenocyttene (p = 0,0033, α-GalCer stående
versus
kontroll). Imidlertid har vi funnet en signifikant økning i antallet av tumor-spesifikke CD8
+ T-celler i HM-1-bærende mus behandlet med i.p. hypertermi pluss α-GalCer (p 0,0001, kombinert behandling
versus
kontroll; p 0,0001, kombinert behandling
versus
hypertermi; p = 0,0026, kombinert behandling
versus
α -GalCer alene, figur 4A). I ID8-luc-modellen, kan tumor- spesifikke CD8
+ T-celle immunrespons bli påvist i gruppen behandlet med α-GalCer alene (p 0,0001, α-GalCer stående
versus
kontroll). Men denne effekten ble funnet å være av større betydning i gruppen behandlet med kombinasjonsterapi (p 0,0001, kombinert behandlings
versus
andre grupper). Forbedringen av tumor spesifikk CTL respons ble svekket av 21 dager etter behandling (data ikke vist). Dette kan være på grunn av overvekst av tumorceller som behersket det anti-tumor immunrespons indusert ved bare en gangs behandling. Teoretisk ville det være mye effektiv dersom hypertermi kan utføres gjentatte ganger, eller tumorveksten kan til slutt overvinne den anti-tumor immunrespons i denne hurtig voksende tumormodell. Disse resultatene viste at i.p. hypertermi kan ytterligere forsterke den cytotoksiske tumorspesifikke CD8
+ T-celle immunrespons indusert av α-GalCer behandling.
(A) 1 x 10
6 av HM-1 celler ble ip injisert inn B6C3F1 mus og (B) 3 × 10
5 av ID8-Luc cellene ip injisert i C57BL /6 mus. Mus ble delt inn i fire grupper (ubehandlet kontroll, bare hypertermi, α-GalCer alene og kombinert behandling med hypertermi pluss α-GalCer) med fem mus pr gruppe og behandlet som beskrevet ovenfor. Etter 7 dager ble splenocytter isolert og stimulert over natten med ID8 celler eller HM-1-celler. De splenocytter fra hver gruppe uten re-stimulert med ID8 celler eller HM-1 celler ble også dyrket over natten som kontroll. Prosentandelen av cancer-spesifikk CTL representert som CD8
+ /IFN-γ
+ ble detektert ved strømningscytometri ved portstyring av 2 x 10
5 lymfocytter. Det er vist at 7 dager etter behandling, i.p. α-GalCer behandling litt økt antall tumor spesifikke CTL (p = 0,0033, kontroll
versus
α-GalCer for HM-1; p 0,0001, α-GalCer
versus
kontroll for ID8 ). Hypertermi pluss α-GalCer utstilt sterkest effekt i å aktivere spesifikk CTL (p = 0,0026, kombinert behandling
versus
α-GalCer for HM-1; p 0,0001, kombinert behandling
versus
α-GalCer for ID8). (* P 0,01; *** p 0,001).
Intra-peritoneal Hypertermi Forbedret den terapeutiske effekten av α-GalCer
in vivo
Det er innlysende at ip hypertermi forbedret både medfødt og adaptive anti-tumor immunresponser indusert av α-GalCer behandling. Vi validert om dette kombinatoriske behandling kan resultere i bedre terapeutisk effekt
in vivo
. I MOSEC-luc tumorbærende C57BL /6 mus, i.p. hypertermi pluss α-GalCer utstilt sterkere hemming av tumorvekst (figur 5A; p 0,05, kombinert behandling
versus
α-GalCer alene). Og denne behandlingen også forlenget overlevelse av tumorbærende mus (figur 5B; p = 0,0018, kombinert behandling
versus
kontroll).
