Abstract
Mål
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR)
genmutasjoner i svulster forutsi tumor respons på EGFR tyrosinkinasehemmere (EGFR-TKI) i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Imidlertid er å skaffe tumorvev for mutasjonsanalyse utfordrende. Her ønsket vi å detektere serum peptider /proteiner assosiert med
EGFR
genmutasjon status, og teste om en klassifisering algoritme basert på serum proteomikk profilering kunne utvikles til å analysere
EGFR
genmutasjon status til hjelpe terapeutiske beslutninger.
pasienter og metoder
Serum samlet inn fra 223 stadium IIIB eller IV NSCLC pasienter med kjent
EGFR
genmutasjon status i sine tumorer før behandlingen var analysert ved matriks-assistert laserdesorpsjon /ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF-MS) og ClinProTools programvare. Forskjeller i serum peptider /proteiner mellom pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og villtype
EGFR
gener ble påvist i en treningsgruppe på 100 pasienter; basert på denne analysen, ble en serum proteomikk klassifisering algoritme utviklet for å klassifisere
EGFR
genmutasjon status og testet i en uavhengig validering gruppe av 123 pasienter. Korrelasjonen mellom
EGFR
genmutasjon status, som er identifisert med serum proteomikk klassifikator og responsen på EGFR-TKI ble analysert.
Resultater
Nine peptid /protein toppene var signifikant forskjellig mellom NSCLC pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og villtype
EGFR
gener i treningsgruppen. En genetisk algoritme modell bestående av fem peptider /proteiner (m /z 4092,4, 4585,05, 1365,1, 4643,49 og 4438,43) ble utviklet fra treningsgruppen for å skille pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og villtype
EGFR
gener. Klassifikator viste en følsomhet på 84,6% og en spesifisitet på 77,5% i valideringen gruppe. I de 81 pasientene fra valideringen gruppen behandlet med EGFR-TKI, 28 (59,6%) av 47 pasienter som matchet prøver ble merket som «mutant» av sorter og 3 (8,8%) av 34 pasienter som matchet prøver ble merket som » wild «oppnådde en objektiv respons (p 0,0001). Pasienter som matchet prøver ble merket som «mutant» av sorter hadde en betydelig lengre progresjonsfri overlevelse (PFS) enn pasienter som matchet prøver ble merket som «wild» (p = 0,001).
Konklusjon
peptider /proteiner knyttet til
EGFR
genmutasjon status ble funnet i serum. Klassifisering av
EGFR
genmutasjon status bruke serum proteomikk klassifikator etablert i denne studien i pasienter med stadium IIIB eller IV NSCLC er gjennomførbart og kan forutsi tumor respons på EGFR-TKI
Citation.: Yang L, Tang C, Xu B, Wang W, Li J, Li X, et al. (2015) Klassifisering av
epidermal vekstfaktor reseptor
Gene Mutation Status Bruke Serum proteomikk Profilering Spår tumorrespons hos pasienter med stadium IIIB eller IV Ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (6): e0128970. doi: 10,1371 /journal.pone.0128970
Academic Redaktør: Ramon Andrade de Mello, Universitetet i Algarve, Portugal
mottatt: 03.02.2015; Godkjent: 21 mars 2015; Publisert: 05.06.2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra departementet for vitenskap og teknologi i Folkerepublikken Kina (kinesisk National Instrumentation Program, nr 2011YQI70067; URL til Funder hjemmeside. www. most.gov.cn; XQL mottatt finansiering). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den vanligste histologiske typen sykdom og står for ca 80% av lungekrefttilfellene [2]. Fordi mer enn 70% av pasienter med lungekreft er diagnostisert med avansert stadium sykdommen [3], spiller systemisk behandling en viktig rolle i klinisk behandling. Kjemoterapi har vært hjørnesteinen i behandling for NSCLC i mange år. Men epidermal vekstfaktor reseptor tyrosin kinase hemmere (EGFR-TKI), for eksempel erlotinib, gefitinib og icotinib, har vist seg å forbedre kliniske utfall og sikkerhet sammenlignet med kjemoterapi hos noen pasienter med avansert NSCLC [4-8]. EGFR-TKI følsomhet har vært forbundet med aktive mutasjoner i kinase domenet til
EGFR
genet, spesielt en
ekson 19
sletting og mutasjoner i
ekson 21 (L858R)
og
ekson 18 (G719X) product: [9-11]. Alle
EGFR TKI
gen følsomme mutasjoner resulterer i aktivering av EGFR-tyrosinkinase-domene, som er målet for EGFR-TKI. Pasienter med disse
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner har en betydelig bedre respons på EGFR-TKI, mens de med villtype
EGFR
gener viser en dårligere tumorrespons. Vurdering av
EGFR
genmutasjon status er kritisk viktig for terapeutisk beslutninger.
National omfattende kreft nettverk (NCCN) Retningslinjene slår fast at DNA mutasjonsanalyse i tumorceller er den foretrukne metode for å vurdere
EGFR
genmutasjon status. Imidlertid, i noen tilfeller, tumorvev enten er utilstrekkelig for molekylær testing på grunn av sin lille mengde eller meget lavt innhold tumor eller ikke er lett tilgjengelige [3]. Flere grupper har oppdaget
EGFR
gen-mutasjoner i DNA isolert fra plasma [3, 12-16] eller serumprøver [17, 18], som tjener som erstatninger for tumorvev; enkelte grupper har vist en sammenheng mellom mutasjonstatus i plasma /serum og tumorvev [3, 12, 13, 15-18]. Videre
EGFR
genmutasjoner påvist i plasma eller serum kan forutsis responsen på EGFR-TKI [3, 13, 14, 16, 18]. Men metodene som brukes for å vurdere
EGFR
genmutasjon status på plasma- eller serumprøver ikke er godkjent av gjeldende retningslinjer. Dermed andre sensitive og ikke-invasive metoder for evaluering av
EGFR
genmutasjon status ved hjelp av surrogat tumorvev å forutsi EGFR-TKI effekt er fortsatt nødvendig.
Matrix-assistert laser desorpsjon /ionisering tid-of- uren massespektrometri (MALDI-TOF-MS) er en følsom, rask, billig og enkel teknikk for proteomikk analyse av komplekse biologiske prøver, for eksempel vev, blod og urin [19-26]. Topper i massespektrumet samsvarer med ioner som dannes fra relativt rikelig arter i prøven, hovedsakelig peptider og proteiner. Nylig har peptid mass fingerprinting basert på MALDI-TOF-MS vært mye brukt til å oppdage diagnostiske, prognostiske og prediktive proteomikk biomarkører. I nylig publiserte studier har peptid mass fingerprinting blitt brukt til å analysere serum fra pasienter og friske kontroller for å avdekke forskjeller i peptider /proteiner; disse forskjellene ble brukt til å utvikle klasse algoritmer for sykdom diagnose [22-25]. I tillegg kan peptidet masse fingerprinting oppdage forskjeller i serum /plasma-peptider /proteiner mellom undergrupper av pasienter med samme type sykdom. Taguchi [26] og Wu [27] brukes MALDI-TOF-MS for å analysere serum og plasma fra NSCLC pasienter; de observert små forskjeller i serum /plasma peptider /proteiner mellom to undergrupper som opplevde betydelig forskjellige EGFR-TKI efficacies og utviklet klassifiseringsalgoritmer bruker differensial peptider /proteiner for å forutsi effekten av EGFR-TKI i NSCLC pasienter. Fordi effekten av EGFR-TKI har vært forbundet med
EGFR
genmutasjon status, de som utgjør peptider /proteiner i serum /plasma-klassifisering algoritmer utviklet ved Taguchi og Wu å forutsi EGFR-TKI effekt kan være forbundet med
EGFR
genmutasjon status [27, 28].
i denne studien, vi forsøkte å detektere serum peptider /proteiner assosiert med
EGFR
genmutasjon status og teste om en klassifisering algoritme basert på serum proteomikk profilering kunne utvikles for analyse av
EGFR
genmutasjon status for å bistå i terapeutiske beslutninger. For å oppnå dette, søkte vi peptid mass fingerprinting hjelp MALDI-TOF-MS kombinert med ClinProTools programvare for å analysere serum fra 223 NSCLC pasienter med kjent
EGFR
genmutasjon status (dvs. bestemt av forsterkning ildfast mutasjon system [ARMS ] i svulstvev) og oppdage forskjeller i serum peptider /proteiner mellom NSCLC pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og NSCLC pasienter med villtype
EGFR
gener. Vi utviklet et serum proteomikk klassifikator å evaluere
EGFR
genmutasjon status og testet klassifikator på en uavhengig validering gruppe. Vi har også analysert sammenhenger mellom
EGFR
genmutasjon status som identifiseres av serum proteomikk klassifikator og responsen på EGFR-TKI å teste potensialet nytten av
EGFR
genmutasjon status identifisert av serum proteomikk klassifikator for å forutsi den kliniske responsen til EGFR-TKI behandling.
pasienter og metoder
pasienter og prøver
for å være kvalifisert for studien ble pasientene pålagt å ha patologisk bekreftet stadium IIIB eller IV NSCLC, en Eastern Cooperative Oncology Group funksjonsstatus 0 til 2, forhåndsdefinert
EGFR
genmutasjon status i tumorvev basert på ARMS (skorpioner forsterkning ildfast mutasjon system, Qiagen, Tyskland) før terapi, og er tilgjengelig serum. Kun pasienter behandlet ved 307 sykehus i PLA fra mai 2011 til april 2013 ble registrert. Denne studien ble utført i henhold til protokoller godkjent av lokal etisk komité (de etiske komiteer av 307 Hospital, PLA), og alle pasientene gitt skriftlig informert samtykke til å delta i denne studien og ga tillatelse til bruk av deres blodprøver. For tumorrespons vurdering, evaluert vi objektive responser etter 8 ukers behandling på grunnlag av computertomografi (CT) skanner. Tumorrespons ble bestemt i henhold til RECIST 1.0. Total overlevelse (OS) ble definert som tiden fra dato for lungekreft diagnose til dødsdato. Progresjonsfri overlevelse (PFS) ble definert som tiden fra starten av EGFR-TKI behandling til dato for sykdomsprogresjon eller død uavhengig av årsak. Cutoff dato for oppfølging var 10. november ble 2014. røykestatus basert på registreringer fra pasientenes første legebesøk, og folk som hadde røykt mer enn 100 sigaretter i sin levetid ble ansett røykere. Laboratoriedata ble innhentet og registrert uavhengig av etterforskere som var blindet for de kliniske data før analysene ble gjennomført av en biostatistiker.
Femti pasienter ble tilfeldig valgt fra pasienter med
EGFR
genet TKI-sensitive mutasjoner og villtype
EGFR
gener henholdsvis (totalt 100 pasienter) for å danne treningsgruppen for påvisning av forskjeller i serum peptider /proteiner mellom NSCLC pasienter med
EGFR
genet TKI- sensitive mutasjoner og NSCLC pasienter med villtype
EGFR
gener, og generering av klassifiseringsmodell, og de resterende pasientene dannet valideringsgruppe for å teste modellen.
pasientene fastet over natten. Alle blodprøver ble oppsamlet før pasientene fikk førstelinjebehandling. Blodprøver ble oppsamlet i vakuum blodprøverør inneholdende koaguleringsmiddel og separasjon gel og sentrifugert ved 3000 rpm i 10 min ved 4 ° C for å separere serumet. Supernatanten ble oppdelt i 100-mL alikvoter og lagret ved -80 ° C inntil behandling.
Peptidome isolasjon
Serumprøver ble tint på is og fraksjonert med svak kationbytter-magnetiske kuler (MB- WCX, National Center of Biomedical Analysis, Kina). Prøvene ble behandlet i tre trinn: binding, vasking og eluering. For hver analyse, 5 ul av kulene vasket tre ganger i 50 ul bindingsløsning (National Center of Biomedical Analysis, Kina), 20 ul bindingsløsning og 5 ul prøve ble tilsatt til et Eppendorf-rør og inkubert i 10 min ved værelses temperatur. Røret ble plassert på en magnetisk perle separasjonsanordning for å isolere peptidome. Supernatanten ble fjernet, og kulene ble vasket tre ganger med 100 ul vaskeløsning (National Center of Biomedical Analysis, Kina) å forkaste ubundne proteiner. Til slutt ble kulene vasket med 20 mL av eluere løsning (National Center of Biomedical Analysis, Kina) om å kjøpe bundet proteiner for MALDI-TOF-MS analyse.
MALDI-TOF-MS analyse
for det MALDI-TOF-MS-analyse, 1 ul av peptid eluat blandet 1: 1 (v /v) med en matrise oppløsning bestående av mettede α-cyano-4-hydroksy-kanelsyre (α-HCCA, Bruker Daltonics, Tyskland ) i 50% acetonitril (ACN, Sigma-Aldrich, USA) og 0,1% trifluoreddiksyre (TFA, Sigma-Aldrich, USA) ble oppdaget på prøven anker flekker av en AnchorChip 600/384 måleplaten (Bruker Daltonics, Tyskland) og fikk lufttørke ved romtemperatur for å la matriksen krystalliseres. ClinProt Peptide kalibreringsstandard I (Bruker Daltonics, Tyskland), en kommersielt tilgjengelig blanding av protein /peptid kalibratorer som besto av angiotensin II (m /z 1,047.19), angiotensin I (m /z 1,297.49), substans P (m /z 1,348.64) , bombesin (m /z 1,620.86), ACTH 1-17 klips (m /z 2,094.43), ACTH klemmen 18-39 (m /z 2,466.48), og somatostatin (m /z 3,149.57) ble blandet 1: 1 (v /v ) med matriseoppløsningen, og 0,5 ml ble avsatt på kalibreringsfestestedene ved AnchorChip skyteskiven for instrument-kalibrering.
Massespektrometri-analyser ble utført på en Ultraflex III MALDI-TOF-MS (Bruker Daltonics, Tyskland). Driftsbetingelsene var som følger: lineær positiv ion-modus; repetisjon rente, 200 Hz; ion kilde spenninger, 25 og 23.50 kV; linse spenning, 6,5 kV; pulset ion utvinning tid, 100 ns. For matrise undertrykkelse, brukte vi en høy gating faktor med signal undertrykkelse av opp til 300 m /z. For hvert spektrum ble ervervet 3000 skudd manuelt fra seks tilfeldige posisjoner over overflaten av det sted (dvs. 500 skudd pr stilling). Datainnsamling ble utført ved 43% av den maksimale laserenergi. Hver spekteret ble eksternt kalibrert. Topper i m /z rekke 800-10,000 Da ble registrert med Flexcontrol oppkjøpet programvare v3.4 (Bruker Daltonics, Tyskland).
Bioinformatikk
Spectral behandling.
ClinProTools programvare v2.1 (bruker Daltonics, Tyskland) ble brukt til å automatisk behandle MALDI-TOFMS spektrene data ved hjelp av data forberedelse innstillinger i henhold til følgende standard arbeidsflyt: Hver rå spektrum ble normalisert til den totale ion strøm; alle spektra ble rekalibrert hjelp av fremtredende, felles m /z-verdier; baseline subtraksjon, glatting, og toppdeteksjon ble utført; og topparealene for hvert spektrum ble beregnet. Signal-til-støy-forhold ble satt til 5 til toppdeteksjons. Peak områder ble beregnet ved hjelp av nullnivå integrasjon type. Spectra var også » top hat «baseline trekkes med minimum baseline bredde satt til 10%, glattet og behandles i 800-10,000 Da serien.
Trening og klassifiseringsmodell etablering i treningsgruppen.
Bare spektra fra treningsgruppen ble brukt. Forskjeller i peptid topper mellom pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og pasienter med villtype
EGFR
gener ble valgt ved hjelp av topparealer på grunnlag av statistiske forskjeller. Innebygd matematiske modeller i ClinProTools 2.1 (dvs. genetisk algoritme (GA), overvåket nettverk (SNN) algoritme og rask klassifikator (QC) algoritme) ble så brukt til å velge peptid topper og sette opp klassifiseringssystemer for å bestemme de optimale separasjons flyene mellom prøver fra pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og villtype
EGFR
gener. Etter hver modell ble generert, ble et tilfeldig kryssvalideringsprosessen utført med programvaren, og den prosentvise å utelate og antall gjentakelser ble satt til 20 og 10, henholdsvis.
For å bestemme nøyaktigheten av klasse prediksjon modell, kvantifiserer programvaren kryssvalidering og anerkjennelse evne. Kryssvalidering er et mål for påliteligheten av en modell og kan brukes til å forutsi hvordan en modell vil oppføre seg i fremtiden. Denne metoden brukes for å evaluere resultatene av en algoritme for et gitt datasett og under en gitt parametrisering. Anerkjennelse evne beskriver resultatene av en algoritme, dvs. den riktige klassifiseringen av en gitt datasett.
Blind test av klassifiseringsmodell som mest effektivt skilt prøver fra pasienter med
EGFR
genet TKI- sensitive mutasjoner fra prøver fra pasienter med villtype
EGFR
gener i valideringsgruppen.
Denne validering ble utført i en blindet måte ved at MALDI-TOF-MS analyse ble utført og prøvene var klassifiseres før de kliniske utfall data ble gjort tilgjengelig for etterforskerne.
for hver pasient fra validerings gruppene, ble et tilsvarende spektrum presentert for den valgte klassifiseringsmodell (oppkalt klassifiserer), som deretter returnerte etikett, enten » mutant «(dvs. klassifisering klasse bestående av prøver fra pasienter med
EGFR
genet TKI-sensitive mutasjoner) eller» wild «(dvs. klassifisering klasse bestående av prøver fra pasienter med villtype
EGFR
genet), eller sende ut en melding om at spekteret var unclassifiable. Resultatene fra den valgte klassifiseringsmodell ble sammenlignet med funn fra ARMS i svulster å anslå separasjonseffektiviteten av modellen.
Statistisk analyse
De kliniske og sykdomskarakteristika mellom ulike våpen, den objektiv respons rate (ORR) og sykdomskontrollrate (DCR) mellom pasienter som matchet prøver ble merket som «mutant» og «vill» ble sammenliknet med en χ
2 eller Fishers eksakte test. Den samsvar mellom armene i tumorer og serum proteomikk klassifikator i evalueringen
EGFR
genmutasjon status ble vurdert ved hjelp av en Kappa test. Overlevelseskurver ble anslått av Kaplan-Meier-metoden, og forskjellene mellom kurvene ble evaluert av log-rank test. Statistiske analyser ble utført med SPSS programvare, v19.0 (SPSS Inc., USA). En p-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Pasient Kjennetegn
I alt 223 pasienter som oppfylte innmelding kriteriene og ble inkludert i denne studien. Basert på kriteriet om ARMS i svulster, var det 102 pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og 121 pasienter med villtype
EGFR
gener. Femti pasienter ble tilfeldig valgt fra de med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og fra de med villtype
EGFR
gener (dvs. totalt 100 pasienter) for å danne treningsgruppen, og de resterende 123 pasienter (dvs. 52 pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og 71 med vill-type
EGFR
gener) dannet valideringsgruppen. De kliniske og sykdoms-karakteristikker for alle pasienter er listet opp i Tabell 1. Pasientene ble balansert mellom treningsgruppen og valideringsgruppen (tabell 2). I treningsgruppe, var det ingen signifikante forskjeller mellom pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og villtype
EGFR
gener med hensyn til alder, histologisk type eller stadium av sykdommen, men Det ble ikke observert forskjeller i kjønn og røyking historie mellom disse to armer, med flere kvinner og flere ikke-røykere hos pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner (tabell 3).
Forskjeller av toppene i serum mellom pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og pasienter med villtype
EGFR
gener i treningsgruppen
totalt 129 peptid-topper ble identifisert i spektra for treningsgruppen datasettet generert ved MALDI-TOF-MS, og 9 toppene var signifikant forskjellige (p 0,05) mellom de pasienter med
EGFR
gen TKI- følsomme mutasjoner og pasienter med villtype
EGFR
gener (tabell 4). To signaler (med m /z 1365,1 og 1866,47) viste en lavere toppområdet og syv signaler (med m /z 3315,75, 3883,79, 3956,66, 4092,4, 4585,05, 4643,49, og 5866,96) utviste en høyere topp område hos pasienter med
EGFR
gen TKI-følsomme mutasjoner sammenlignet med pasienter med villtype
EGFR
gener. Peptid topper med m /z 4092,4 og 4585,05 utstilt den største forskjellen i de travleste områdene mellom pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og pasienter med villtype
EGFR
gener (p 0,00001) . Derfor er disse to toppene (m /z 4092,4, x-aksen, m /z 4585,05, y-aksen). Ble plottet i en 2D topp fordeling view (fig 1)
diskriminerende trekk ved de to utvalgte peptider var generert av ClinProTools bioinformatikk programvare. Verdiene representerer peptid overflod forholdet, og disse verdiene var signifikant forskjellig mellom pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og pasienter med villtype
EGFR
gener. Ellipsene representerer standardavvik av klassen gjennomsnittet av de travleste områder /intensiteter.
Klassifisering modell etablering
Tre algoritmer, GA (optimalisert ved å justere antall naboer for en k-nærmeste nabo klassifisering), SNN og QC, ble brukt for klassifisering modell konstruksjon med spektrale data fra treningsgruppen generert av MALDI-TOF-MS. Den anerkjennelse evne og kryss-validering av modellene er presentert i tabell 5 og modell GA-7 (oppkalt klassifiserer), som var sammensatt av fem peptid topper med m /z 4092,4, 4585,05, 1365,1, 4643,49 og 4438,43, utstilt beste effektivitet i å skille prøver fra pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner og prøver fra pasienter med villtype
EGFR
gener, med en anerkjennelse evne til 93,32% og en kryssvalidering av 81,23% (figur 2).
blindet test av sorter i valideringsgruppen
klassifikator ble deretter validert i en uavhengig validering gruppe av 123 NSCLC pasienter i en blindet test (tabell 6). Tre av de 123 prøvene ga unclassifiable spektra (dvs. én prøve var fra en pasient med
EGFR
genet TKI-sensitive mutasjon, og to var fra pasienter med villtype
EGFR
gener, som bekreftet av ARMS i tumorer). Blant de 52 prøver fra pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner bekreftet av ARMS i svulster, 44 (84,6%) ble merket som «mutant» av serum proteomikk klassifikator; og blant de 71 prøver fra pasienter med villtype
EGFR
gener bekreftet av ARMS i svulster, 55 (77,5%) ble merket som «vill» av serum proteomikk klassifikator, oppnå en samlet nøyaktighet på 80,5%, med en sensitivitet på 84,6% og en spesifisitet på 77,5%, noe som indikerte en høy konsistens mellom ARMS i tumorer og serum proteomikk klassifikator i evalueringen
EGFR
genmutasjon status (P 0,001; Kappa verdi, 0,648, 3 pasienter med ugyldige spektra ble ekskludert). Men av 52 prøver fra pasienter med
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner bekreftet av ARMS i svulster, 7 (13,5%) ble merket som «vill» av sorter; Tilsvarende av 71 prøver fra pasienter med villtype
EGFR
gener bestemmes av ARMS i svulster, 14 (19,7%) ble merket som «mutant» av klassifikator.
korrelasjon mellom
EGFR
gen TKI-sensitive mutasjoner identifisert av klassifikator og den terapeutiske effekten av EGFR-TKI i valideringsgruppen
i valideringsgruppen, tre av de 123 prøvene ga unclassifiable spektra, og de tre tilsvarende pasienter ble ekskludert fra analysen. Blant de resterende 120 pasienter, 81 hadde målbare svulster og fikk EGFR-TKI behandling. De kliniske og sykdoms egenskapene til disse 81 pasientene er presentert i tabell 7, og median oppfølgingstid av disse pasientene var 29,0 måneder (range, 7,0 til 40,0 måneder). Pasienter som matchet prøver ble merket som «mutant» og «vill» av sorter utstilt forskjellige tumor respons på EGFR-TKI; Disse responser er angitt i tabell 8. Tjueåtte (59,6%) av 47 pasienter som sams prøver ble merket som «mutant» med klassifikator og 3 (8,8%) av 34 pasienter som sams prøver ble merket som «vill» av klassifikator utstilt en objektiv respons (p 0,0001). Sykdomskontroll ble notert i 41 (87,2%) av 47 pasienter som matchet prøver ble merket som «mutant» av sorter og 12 (35,3%) av 34 pasienter som matchet prøver ble merket som «vill» av sorter (p 0,0001 ). Kaplan-Meier-overlevelses plott av PFS og OS for pasienter med matchet prøver ble merket som «mutant» og «vill» av sortereren er vist i figur 3. Median PFS tid for pasienter som har avstemt prøver ble merket som «mutant» og » wild «av sorter var 10,0 måneder (95% KI, 9,0 til 10,9) og 2,3 måneder (95% KI, 01.09 til 02.07), henholdsvis. Pasienter som matchet prøver ble merket som «mutant» av sorter hadde en betydelig lengre PFS enn pasienter som matchet prøver ble merket som «vill» av sorter (p = 0,001, log-rank test, figur 3A). Pasienter som matchet prøver ble merket som «mutant» av sorter hadde en OS tid på 29,0 måneder (95% KI, 25,2 til 32,8) sammenlignet med 28,0 måneder (95% KI, 17,7 til 38,3) for pasienter som matchet prøvene ble merket som «wild-type» med klassifikator. Det var ingen signifikant forskjell i OS mellom de to gruppene (p = 0,441, log-rank test, figur 3B).
(A) PFS mellom pasienter som matchet prøver ble merket som » mutant «(n = 47) og pasienter som matchet prøver ble merket som» wild «(n = 34). (B) OS mellom pasienter som matchet prøver ble merket som «mutant» (n = 47) og «vill» (n = 34).
Diskusjoner
Vurderingen av
EGFR
genmutasjon status i svulstvev har viktig prediktiv verdi og kan brukes til å velge terapi for behandling av NSCLC. Mange pasienter med avansert og metastatisk NSCLC er diagnostisert med små biopsier eller tynn nål aspirasjon av svulster, som ofte gir tilstrekkelig DNA for å vurdere
EGFR
genmutasjon status. Noninvasive metoder for evaluering av
EGFR
genmutasjon status ved hjelp av erstatninger for tumorvev vil være av verdi for pasienter der tilstrekkelig svulstvev er ikke tilgjengelig [16]. Tabell 9 gir informasjon om de ulike metodene som brukes i tidligere rapporter for å oppdage
EGFR
genmutasjoner i serum /plasmaprøver [3, 12-18]. Avhengig av teknikken, er samsvar mellom
EGFR
genmutasjon status i tumor og plasma /serumprøver i området fra 66% til 100%, med det høyeste korrelasjonsindeks blir rapportert for denaturering med høy ytelse kromatografi [3] og mutant-anrikede PCR [13]. Imidlertid er disse metoder for å vurdere
EGFR
genmutasjon status i plasma- eller serumprøver er ikke mye brukt til å lede EGFR-TKI terapi i klinisk praksis på grunn av sin dårligere følsomhet sammenlignet med resultater fra tumorvev eller det faktum at studier som undersøker disse metodene har brukt små utvalgsstørrelser. I denne studien fant vi at blant 123 pasienter i valideringsgruppen, vurdering av
EGFR
genmutasjon status ved hjelp av serum proteomikk classifiers ga resultater som var konkordant med resultatene av våpen i svulster i 80,5% av tilfellene, med en høy sensitivitet på 84,6%.
Men vi fant
EGFR
genmutasjoner som ble vellykket identifisert av bare én metode (dvs. serum proteomikk klassifikator eller ARMS i tumorer) i 17,1% av pasientene i valideringsgruppen (dvs. 11,4% [14/123] av serum proteomikk klassifikator bare 5,7% [7/123] av ARMS i tumorer bare). Det er viktig å merke seg at tilfeller der testresultater var inkonsekvent mellom serum proteomikk klassifikator og ARMS i tumorer ikke kan betraktes som vanlige «falske-negative» eller «falsk-positive.» En mulig forklaring på dette inkonsekvens i fastsettelse av mutasjons status er heterogenitet av genetiske avvik i svulstene. I slike tilfeller kan tumorbiopsi-prøver ikke bære
EGFR
genmutasjoner identifisert av serum proteomikk klassifikator fordi disse Klassifiserings-utgjør peptider /proteiner knyttet til
EGFR
genmutasjon status kan være avledet fra forskjellige deler av tumoren. Den nedre tumorcelle-innhold i noen av tumorene kan også bidra til mangelen på påvisbare mutasjoner. På samme måte, enten det er lite eller ingen Klassifiserings-som utgjør peptider /proteiner relatert til
EGFR
genmutasjon status blir felle i blodet i et gitt tilfelle, eller mengden av peptider /proteiner i serumet er påvirket av visse forhold, for eksempel betennelse, klassifisering av
EGFR
genmutasjon status basert på serum proteomikk profilering kan bli hindret tross av tilstedeværelsen av mutasjoner i svulstene.
EGFR kodet av villtype
EGFR
genet er et transmembran tyrosin-kinase-reseptor med en molekylvekt på 170 kDa. Forskjellen mellom EGFR kodet av
EGFR
gen med TKI-sensitive mutasjoner og EGFR kodet for av villtype
EGFR
gen er at de tidligere havner aktiverende tyrosin kinase domene. Disse to EGFRs bør ha lignende molekylvekter. På grunn av den høye molekylvekt, er det viktig å merke seg at MALDI-TOF-MS som er beskrevet i denne studien er heller ikke egnet for direkte detektering av EGFR kodet av
EGFR
gen med TKI-sensitive mutasjoner eller EGFR kodet for av vill -type
EGFR
genet fordi den typiske observermassespekter er 800-10000 Da. I stedet, vi har oppdaget de differensial peptid /protein profiler mellom EGFR kodet av
EGFR
gen med TKI-sensitive mutasjoner og EGFR kodet av villtype
EGFR
genet. Identiteten til de som utgjør peptider /proteiner er ukjent i dag; det er mulig at de er ukjente co-uttrykte peptider /proteiner med lav molekylvekt som er involvert, eller som vi har oppdaget fragmenter av EGFR eller andre høymolekylære proteiner, slik som proteiner fra EGFR-signaleringsreaksjonsveien [29].
