Abstract
overaktivering av Wnt /β-catenin banen i voksent vev har vært innblandet i mange sykdommer, slik som tykktarmskreft. Finne kjemiske stoffer som kan hindre dette fenomenet er et voksende problem. Nylig har flere naturlige forbindelser blitt beskrevet som Wnt /β-catenin inhibitorer og kan være lovende midler for kontroll av kreftutvikling. Her beskriver vi to naturlige stoffer, derricin og derricidin, tilhører chalconet underklasse, som viser potent transkripsjonen hemming av Wnt /β-catenin veien. Begge chalconer er i stand til å påvirke celle fordelingen av β-catenin, og hemmer Wnt-spesifikk rapportøraktivitet i HCT116-celler og i
Xenopus
embryoer. Derricin og derricidin også sterkt hemmet kanoniske Wnt aktivitet
in vitro
, og reddet Wnt-indusert dobbel akse fenotype i
Xenopus
embryoer. Som en konsekvens av Wnt /β-catenin inhibering, derricin og derricidin behandlinger redusere cellenes levedyktighet og fører til cellesyklusarrest i kolorektale cancercellelinjer. Til sammen våre resultater støtter det sterkeste disse chalconer som nye negative modulatorer av Wnt /β-catenin sti og tykktarmskreft cellevekst
in vitro
Citation. Fonseca BF, Predes D, Cerqueira DM, Reis AH, Amado NG, Cayres MCL, et al. (2015) Derricin og Derricidin Hemme Wnt /β-catenin Signalering og undertrykke Colon kreft celle vekst
In Vitro
. PLoS ONE 10 (3): e0120919. doi: 10,1371 /journal.pone.0120919
Academic Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA
mottatt: 25 juni 2014; Godkjent: 09.02.2015; Publisert: 16 mars 2015
Copyright: © 2015 Fonseca et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:. Denne studien ble finansiert av brasilianske virkemiddelapparatet Conselho Nacional de Desenvolvimento científico e Tecnológico, Fundação de Amparo en Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nivel superior .
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Wnt /β-catenin signalering er den viktigste årsaken til mange forskjellige neoplasier, og har. et nært samarbeid med tykk- og endetarmskreft (CRC). Omtrent 80% av alle CRC har mutasjoner i wnt komponenter, noe som resulterer i overaktivering av veien i kolon celler. De mest vanlige mutasjoner resulterer i tap av APC-funksjon som er negative regulatorer av denne signalveien; og gevinst på funksjons mutasjoner i β-catenin, hoved effektorproteinet av dette signal [1,2,3,4]. Disse mutasjoner forårsaker ukontrollert overekspresjon av flere onkogener og cellesyklus gener, spesielt i celler avledet fra tarm krypter [5].
CRC er en ondartet sykdom med høy forekomst, og den tredje vanligste diagnosen kreft i verden [6]. Det er vanskelig å behandle; kirurgi og adjuvant stoffer brukes ofte, men herder bare en liten prosentandel av tumorer [7]. CRC er sterkt assosiert med genetiske forstyrrelser, noe som er et resultat av mutasjoner i viktige cellesyklus og apoptose regulatoriske gener, slik som KRAS, TP53 og BRAF [8]. I tillegg kan CRC også være resultat av menneskelige ernæringsmønstre. Det har vist seg at et høyt forbruk av plante-opprinnelse mat er relatert til en reduksjon av CRC forekomst, på grunn av de store mengder av naturlig antitumor-forbindelser, så som flavonoider og andre polyfenoler [7,9].
flavonoider er polyfenoliske forbindelser som finnes i mange planter, og har et bredt spekter av biologiske virkninger. Fordi flavonoider er en stor del av menneskets diett, har de blitt intensivt studert med hensyn til deres fordelaktige effekter i mange menneskelige sykdommer, som kreft. De har anti-proliferative, anti-invasive og pro-apoptotiske effekter [10,11,12]. Mange flavonoider beskrevet som wnt inhibitorer har interessante effekter på CRC-kontroll og også bidrar til å forebygge denne sykdommen [13,14,15,16,17]. Den flavonoider EGCG og quercetin har blitt rapportert som lovende anti-kreft narkotika [18,19]. Blant effektene av disse flavonoider er regulering av signalveier som er nært forbundet med kreft, for eksempel Wnt /β-catenin signalering, selv om ingen av dem har lykkes som et effektivt legemiddel for behandling av kreft.
Her vi undersøkte effekten av to lite kjente flavonoider, derricin og derricidin, som ble hentet fra
lonchocarpus sericeus product: [20]. Derricin og derricidin er i stand til å redusere CRC vekst
in vitro
, ved regulering av cellesyklusprogresjon. Videre derricin og derricidin sterkt hemmet Wnt8-indusert dobbel akse i
Xenopus
embryo, som sterkt indikerer at disse flavonoider er modulatorer av Wnt /β-catenin veien.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP, kjemikalier og reagenser
Alle cellekultur reagenser ble kjøpt fra Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Dimetylsulfoksid (DMSO) og anti-β-catenin ble innkjøpt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Sekundære antistoffer ble kjøpt fra Life Technologies (CA, USA). Cellelinjer som ble brukt var HEK293t, L-celle, L-Wnt3a, HCT116, DLD-en og IEC-18 (ATCC) og RKO-pBAR /
Renilla product: [21]. De chalconer derricin og derricidin brukt i denne studien ble hentet ut og renset ved Nascimento og Mors (1972) [20].
Wnt-luciferaserapportørplasmid Analyser
RKO-pBAR /
Renilla
celler ble dyrket på 96-brønners plater med 1,0 x 10
4 celler /brønn i DMEM-High Glucose med 10% føtalt bovint serum (Gibco). Etter konfluens, ble cellene behandlet med derricin (10, 20 eller 50 uM) eller derricidin (10, 20 eller 50 uM) i nærvær av Wnt3a kondisjonert medium [22], i ytterligere 24 timer. L-celle-kondisjonert medium ble anvendt som negativ kontroll. DMSO ble også tilsatt som en bærerkontrollen. Etter 24 timer med behandling, Firefly og
Renilla
luciferasepreparater aktiviteter ble oppdaget i henhold til produsentens protokoll (Dual luciferaserapportørplasmid analysesystem, Promega).
HEK293t og HCT116 ble dyrket på 96-brønners plater med 1,0 x 10
4 celler /brønn i DMEM-F12 med 10% føtalt bovint serum (Gibco). Etter 70% samløpet ble nådd, ble hver brønn transfektert med 50 ng TOP-Flash eller FOP-Flash plasmider, 5 ng tk
Renilla
-luciferase, med eller uten β-catenin [23]. Transfeksjon reagens brukt var Lipofectamine (Invitrogen). 15 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med chalconer i nærvær av Wnt3a kondisjonert medium, i 24 timer ved anvendelse av 10, 20 eller 30 uM av derricin eller 10, 20 eller 30 uM av derricidin. På neste dag, Firefly og
Renilla
luciferasepreparater aktiviteter ble oppdaget i henhold til produsentens protokoll (Dual luciferaserapportørplasmid analysesystem, Promega).
embryo manipulasjoner.
Frog eksperimenter ble utført i henhold til retningslinjene gitt av Animal Care og bruk Etikk komité (Comissão de Etica ingen Uso de Animais-CEUA) av føderale universitetet i Rio de Janeiro, og ble godkjent av denne komiteen under tillatelse nummer 152/13. Voksen frosker (Nasco Inc., WI, USA) ble stimulert med humant choriongonadotropin (Sigma, St. Louis, MO, USA).
Xenopus
embryoer ble oppnådd ved å
in vitro
befruktning og iscenesatt ifølge Nieuwkoop og Farber [24]. Alle forsøkene ble utført ved 22 ° C. For syntetisk xWnt8 mRNA, ble plasmidet linearisert med Noti og transkribert med SP6-RNA-polymerase ved hjelp av mMessage mMachine kit (Applied Biosystems). Fire-celle-trinns embryoer ble injisert inn i den ventrale marginalsonen for å indusere sekundær akse formasjon. I tillegg fire-celle-trinns embryoene ble co-injisert med 10 pg /embryo av xWnt8 mRNA pluss 0,4 pmol /embryo av hver chalcone eller 250 pg av Wnt /β-catenin luciferase reporter plasmid (S01234-Luc) og 50 pg TK –
Renilla
å utføre embryo luciferase analysene. Etter injeksjon, ble embryoer opprettholdt i 0.1x Barth (8,89 mM NaCl, 0,1 mM KCl, 0,24 mM NaHCO
3; 0,08 mM MgSO
4.7H
2o 1 mm Hepes, 0,03 mM Ca (NO
3)
2,4 H
2o; 0,04 mM CaCl
2.2H
2o, pH 7,7), før scenen 27, når fenotyper ble analysert eller til gastrulastadiet (st 10) når luciferase-aktivitet ble detektert i henhold til produsentens protokoll (Dual luciferaserapportørplasmid assay System, Promega).
MTT-analyse.
3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazoliumbromid (MTT) ble brukt til analysen mitokondriell aktivitet i levedyktige celler. Celler ble sådd ut ved en konsentrasjon på 1,0 x 10
4 celler /brønn i 96-brønners vevskulturplater i DMEM F-12 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum og dyrket i 24 timer før behandling med chalconer (10, 20, 30, 50, eller 100 pM) i 0, 24, 48 eller 72 timer. MTT ble tilsatt til hver brønn til en sluttkonsentrasjon på 150 mg /ml i 4 timer før høsting celle. Den formazanforbindelsen reaksjonsprodukt ble oppløst med DMSO og kvantifisert spektrofotometrisk ved 570 nm (Modulus II mikromultimode-leser).
Farging.
HCT116 cellene ble fiksert i 4% paraformaldehyde, vasket med PBS, og permeabilisert med 0,1% Triton X-100. Prøvene ble deretter blokkert i 1 time med 5% bovint serumalbumin. Et kanin anti-β-catenin (1: 200) som primært antistoff ble inkubert over natten. Spesifikke sekundære antistoffer konjugert med Cy3 fluorokrom (1: 5000) ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Etter PBS-vaskinger, DAPI farging (4,6-diamidino-2-fenylindol) (cellesignalisering) ble utført i 5 minutter, og deretter ble objektglassene montert med FluorSave (Calbiochem) og observert i et Nikon TE 2000-S invertert mikroskop (Melville , NY, USA). Bilder ble tatt med en CoolSNAP-Pro (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA) digitalkamera, med en zoom på 100x og 600x.
Celleproliferering analysen
For celleproliferasjonsanalyse, 5 , 0 x10
4 celler ble sådd ut på dagen og behandlet med 30 mikrometer eller 50 mikrometer derricin eller derricidin i 24 timer. Klikk-iT Edu (Life Sciences) Analysen ble utført i henhold til produsentens protokoll. DMSO ble anvendt som en bærer for å oppløse flavonoider og ble tilsatt til kontrollkulturer forholdene på 0,5%.
cellesyklus-analyse.
cellesyklusanalyse ble utført ved hjelp av flow cytometri. Celler ble skylt kort med kalsium og PBS og frittliggende med trypsin ved romtemperatur. Etter sentrifugering 1 x 10
6-celler ble suspendert i 0,5 ml iskald Vindeløv løsning [25] som inneholdt 0,1% Triton X-100, 0,1% citrat-buffer, 0,1 mg /ml RNase og 50 ug /ml propidiumjodid ( Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Etter 15 minutter ble cellene analysert for DNA innhold ved hjelp av en FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Levende celler ble analysert i henhold DNA-innhold. Celler som viser fragmenterte DNA og mulige dubletter ble ekskludert fra analysen. Cellene med diploid DNA innhold (2n, G0-G1 fase), syntetisere DNA ( 2n men 4n, S fase), og duplisert DNA (4n, G2 /M fase) ble kjøpt og analysert ved hjelp av Cellquest og WinMDI 2.9 programvare, respektivt.
Statistisk analyse.
Hvert eksperiment ble utført minst tre ganger. Luciferase, cellesyklus og MTT-analyser ble utført i tre eksemplarer. Cellefarging kvantifisering ble utført ved å telle antallet av DAPI og antallet av ikke-nukleære og nukleære β-catenin fargede celler i tilfeldig valgte mikroskopfelt, og da andelen av ikke-nukleære og nukleære celler av de totale celler, ble beregnet. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av uparede Students t-test. I MTT analyser, vi brukte to-veis ANOVA etter en Bonferroni post-test (GraphPad Prism versjon 5.00, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). I
Xenopus
Wnt /β-catenin reporter analysen brukte vi enveis ANOVA etter en Kruskal-Wallis (GraphPad Prism versjon 6.00, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Statistisk signifikans satt til * P 0,05, ** P 0,01, og *** P 0,001
Resultater
Derricin og derricidin hemme spredning av CRC cellelinjer
Mange naturlige forbindelser, inkludert flavonoider, er i stand til å påvirke celleproliferasjon og apoptose og er således viktige kandidater for kontroll av kreft. Vi utførte en lav gjennomstrømning Wnt spesifikk reporter analyse for å screene naturlige forbindelser hentet fra forskjellige brasilianske planter (data ikke vist). Blant hemmere fant vi en påvisbar Wnt /β-catenin hemming aktivitet vises av chalconer derricin og derricidin (Fig. 1). Her har vi brukt to CRC cellelinjer, HCT116 og DLD-en, og undersøkt om derricin og derricidin kan påvirke kolon celler vekst. Vi undersøkte også den chalconer effekt i IEC-18, et ikke-transformerte cellelinje avledet fra rotte tarm epitel. Først, behandlet vi disse cellene ved forskjellige konsentrasjoner (10-100 uM) i denne chalconer for forskjellige behandlingsperioder (0-72 h), og analysert celleviabilitet, ved MTT-analyse. I HCT116, observerte vi en signifikant reduksjon i cellelevedyktighet ved 100 uM av derricin i de første 24 timer etter behandling. Etter 48 timer med behandling var 20 pM av derricin var i stand til å redusere MTT absorbansen (Fig. 2A). Derricidin hadde lignende effekt på HCT116 og også redusert cellelevedyktighet i en treringstrinnet og tidsavhengig måte (fig. 2B). Videre behandling med derricin og derricidin redusert antall HCT116-celler, oppnå tilnærmet 58% og 65% av reduksjon av DAPI-fargede kjerner med 50 uM av derricin og derricidin, respektivt (figur 2C.). I DLD-1, kan derricin redusere cellenes levedyktighet ved 100 uM konsentrasjon med en mildere effekt på 18 timer og en intens reduksjon etter 48 timers behandling (Fig. 2D). Derricidin, på den annen side, hadde en sterkere effekt i DLD-1, som 50 uM av dette chalcone var tilstrekkelig til sterkt å redusere cellenes levedyktighet etter 18 timers behandling (fig. 2E). Disse chalconer var også i stand til å redusere antall DLD-1-celler i kultur, å oppnå omtrent 50% og 70% av reduksjon med 50 uM av derricin og derricidin, henholdsvis (fig. 2F). Når vi analyserte effekten av derricin og derricidin i celle levedyktighet av IEC-18 celler, kunne vi observere at både flavonoider redusere MTT absorbans, starter på 18 timer med behandling ved 100. Interessant nok ble det ikke effekter i cellelevedyktighet påvises ved lavere konsentrasjoner (fig. 2G, H). Videre 50 uM av derricin og derricidin behandling resulterte i en maksimal reduksjon på 32% og 38% av IEC-18 celletall (fig. 2I).
(A, B, D, E, G, H) Grafer viser MTT absorbans nivåer i HCT116, DLD-en og IEC-18 cellelinjer, etter behandling opp til 72 timer med 10-100 mikrometer av derricin eller derricidin. (A) I HCT116-celler, er det observert signifikant reduksjon i cellelevedyktigheten etter 100 uM av derricin i 24 timer og 20 uM av derricin i 48 timer (B) etter derricidin behandling, reduksjon av cellelevedyktighet forekom ved 100 uM av derricidin etter 24 time og ved 30 uM etter 72 timer. (D) På DLD-1-celler, er det observert en mildere effekt på 100 uM Etter 18 timer fra behandlingen. Ellers er en intens reduksjon av MTT absorbans påvises etter 48 timer behandling med 100 uM av derricin. (E) Derricidin behandling reduserer DLD-en celle levedyktighet etter 18t behandling med 50 mikrometer av flavonoider og 20 mikrometer etter 72h. (G) På IEC-18-celler, er reduksjon av levedyktighet observert med 100 uM av derricin, starter på 18 timer fra behandlingen. (H) En lignende profil er observert etter derricidin behandling. (C, F, I) DAPI-farget kjerner ble talt etter 24 timer behandling med derricin og derricidin. (C) 30 og 50 uM av derricin redusert omtrent 30% og 58% antallet HCT116 kjerner, henholdsvis; mens derricidin redusert med henholdsvis ca. 39% og 65%. (F) DLD-1 kjerner ble redusert ca. 44% og 50% etter derricin behandling ved 30 og 50 uM konsentrasjoner henholdsvis. Derricidin behandling redusert omtrent 50% og 70%, respektivt. (I) IEC-18-kjernene ble også redusert, med verdier på 25% og 32% av reduksjon med 30 og 50 uM av derricin, henholdsvis, og 40% og 38% med 30 og 50 uM av derricidin, respektivt. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001
De første analysene viste at derricin og derricidin var i stand til å redusere celle levedyktighet, noe som tyder på at begge flavonoider påvirke kreftcellevekst . For å teste om derricin og derricidin kunne hemme spredning av CRC cellelinjer utførte vi Edu-inkorporering analysen. Vi bemerket at begge chalconer var i stand til å redusere antall prolifererende celler, ved 30 og 50 uM, i alle cellelinjer (Fig. 3 A-O «). Etter kvantifisering, var det mulig å observere at 30 uM av begge chalconer hemmer rundt 40% av celleproliferasjon i HCT116 og omtrent 50% i DLD-1 (fig. 3 P, Q). Interessant, 30 uM av begge flavonoider var i stand til å hemme bare omtrent 20% av celleproliferasjon i IEC-18, noe som indikerer en forskjell i regulering av celledeling i tumor og ikke-tumorale cellelinjer (Fig. 3R).
Edu innlemmelse i kolon celler etter behandling med 30 og 50 uM av derricin og derricidin for 24 timer. (A, A «, B, B», C, C «) I kontrollbetingelser, er det observert en betydelig antall edu-positive celler. (D, D «, E, E», F, F «, G, G», H, H «, I, I») Etter behandling med derricin, det er observert et lavere antall edu-positive celler. (J, J «, K, K», L, L «, M, M», N, N «, O, O») Derricidin behandling reduserer også edu-positive celler. (P, Q, R) Kvantifisering av Edu-positive celler i HCT116, DLD-en og IEC-18. Scale bar 50 mikrometer, ** p 0,01, *** p. 0,001
neste spurte om disse effektene kan være relatert til cellesyklus arrest. For å gjøre dette, behandlet vi HCT116, DLD-1 og IEC-18 celler med hver flavonoid i 96 timer og kvantifisert prosentandelen av celler i ulike cellesyklusfaser (Fig. 4). DMSO-behandlede HCT116 cellene var for det meste på G1 /G0 cellesyklus fase (Fig. 4A i M1 region). Derricin behandling induserte en signifikant forstyrrelse i disse diploide celler, noe som reduserte celletall i G1 /G0 fase til 67,6% og 54% ved behandling med 30 og 50 uM av dette flavonoid, henholdsvis (fig. 4A, i M1 region). Derricin påvirket cellesyklus i en doseavhengig måte, med tanke på at 30 uM arrestert cellesyklus i S-fasen og 50 uM arrestert cellesyklus i G2 /M fase (fig. 4A, D). Derricidin ble også evaluert for sin evne til å kontrollere cellesyklusen. Behandling med 30 uM og 50 uM av derricidin redusert prosentandelen av diploide celler til 53,8% og 35,5%, henholdsvis, og induserte en signifikant cellesyklus-stans i G2 /M fase i begge konsentrasjoner (fig. 4E). Hyppigheten av DLD-1-celler inneholdende duplisert DNA-innholdet var omtrent 50% i kontrollceller og økte til 30,3% og 59,3% av cellene etter behandling med 30 uM og 50 uM av derricidin. På den annen side bor DLD-1 adenokarsinomceller akkumulert på G0 /G1-fasen av cellesyklusen etter 30 uM og 50 uM av derricin (fig. 4B, i M1 region). 31,6% av cellene var i G0 /G1 fase i ubehandlede eller DMSO-behandlede betingelser. Dette nummeret oppnår 66,9% og 65,7% av cellene i 30 um og 50 uM, henholdsvis, av derricin. Disse resultatene indikerer også en ikke-avhengige doserespons av derricin behandling (fig. 4F). Lignende effekter ble observert når vi behandlet disse cellelinje med derricidin ved begge konsentrasjoner (Fig. 4B, i M1 region, 4G). Interessant, IEC-18 presentert en svak cellesyklus fasemodulasjon i begge derricin og derricidin behandlinger, med unntak av en mildere effekt på 50 uM av derricin (Fig. 4C, H, I). Til sammen viser disse data en anti-proliferativ effekt av derricin og derricidin, som fungerte ved å stanse cellesyklus i HCT116 og DLD-1 tumorcellelinjer.
(A, D, E) i HCT116, ubehandlet cellene viste omtrent 75% av celler i G1 /G0 fase, mens 30 og 50 uM av derricin redusert denne proporsjon til 67,6% og 54%, henholdsvis, noe som resulterer i cellesyklusarrest i S- og G2 /M-fasene, respektivt. Derricidin redusert denne andelen til 53,8% og 35,5%, henholdsvis, og også indusert cellesyklus arrest i G2 /M-fasen. (B, F, G) på den annen side, DLD-1-celler samlet opp i G0 /G1 fasen av cellesyklusen etter 30 uM og 50 uM av derricin eller derricidin. (C, H, I) Derricin og derricidin behandling hadde mildere virkning i cellesyklusprogresjon av IEC-18-celler, med unntak av en lett stanse ved G2 /M med 50 uM av derricin. Søylediagram representerer prosentandelen av celler i henhold behandling og betydelige data var representert i figuren. Svarte striper: G0 /G1 fase; Hvite striper: S fase; og Gray barer:. G2 /M faser
Derricin og derricidin som potente hemmere av Wnt /β-catenin signale
Deregulering i kanonisk Wnt signal er nært knyttet til tykktarmskreftceller [ ,,,0],1,3]. For eksempel, HCT116-celler har en mutasjon i et gen som koder for CTNNB1 β-catenin protein, og således har en høy aktivitet av Wnt /β-catenin veien [2]. Vi spurte om celle levedyktighet og cellesyklus-arrestasjon effekter av derricin og derricidin i HCT116 cellene skyldtes modulering av Wnt /β-catenin signalering. Vi først analysert den cellulære fordelingen av β-catenin. I ubehandlede eller DMSO-behandlede celler, ble β-catenin protein som finnes i kjernen av nesten 50% av cellene (fig. 5A, B, C, J). Imidlertid, når vi behandlede celler med derricin, bare 25% av cellene viste nukleær farging med β-catenin (fig. 5D, E, F, J). I tilfelle av derricidin, 26% av cellene viste atom β-catenin, noe som var også en signifikant reduksjon i nukleær farging (fig. 5G, H, I, J). Fordi disse resultatene støtte en mulig Wnt /β-catenin hemming, adressert vi Wnt veien aktivering staten mer direkte, ved å utføre Wnt /β-catenin spesifikke reporter analyser på HCT116 transfektert med TOPFlash plasmid. Konsekvent med tidligere data, derricin og derricidin spesielt hemmet Wnt reporter aktivitet (Fig. 5K). Disse resultater viser at derricin og derricidin var i stand til å inhibere Wnt /β-catenin bane i HCT116 tumorcellelinje.
(AI) β-catenin farging av HCT116-celler som ble behandlet med 30 pM av hver chalcone for 24 h. (A-C) I kontrollforhold flertall av celler som viser β-catenin farging av cellekjernen. (D-F) Etter behandling med derricin, er denne farging tapt, og de fleste cellene viser β-catenin i cytoplasma og membranen. (G-I) Derricidin behandling reduserer også nukleær farging av β-catenin. (J) Kvantifisering av farging viste at begge chalconer redusere atom β-catenin. (K) Wnt /β-catenin spesifikke reporter analysen av TOPFlash /
Renilla
transfektert HCT116-celler. Begge chalconer redusere Wnt rapportøraktivitet etter 30 og 50 uM behandling i 24 timer. Skala:. 50 M, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001
Våre eksperimenter med HCT116 sterkt at derricin og derricidin er potente hemmere av kanonisk Wnt signal . For å møte denne effekten mer spesifikt, utførte vi klassiske eksperimenter for å analysere Wnt veien regulering, dvs. luciferase reporter-gen-analyser i RKO-pBAR /
Renilla
celler og HEK293t celler. Disse cellene ble behandlet med 10, 20 eller 50 uM av derricin i nærvær av Wnt3a kondisjonert medium. Derricin redusert Wnt rapportøraktivitet i en konsentrasjonsavhengig måte i begge cellelinjer (Fig. 6A, C). Derricidin behandling var også i stand til å redusere Wnt rapportøraktivitet, selv om den høyeste inhibering ble bare oppnådd når cellene ble behandlet med 50 uM (fig. 6B, D). Vi observerte en liten reduksjon i Wnt reporter aktivitet etter behandling med 20 mikrometer derricidin. For å vite om derricin og derricidin handle oppstrøms eller nedstrøms til effektor protein β-catenin, vi aktivert Wnt signal ved trans de HEK293t celler med β-catenin og evaluert chalconer hemming effekter. Derricin var i stand til å inhibere β-catenin aktivering av Wnt veien, mens derricidin var ikke, noe som tyder på at derricin virker på nedstrømssiden av β-catenin mens derricidin opptrer oppstrøms (fig. 6E). Disse data viser at derricin og derricidin oppfører seg som inhibitorer av Wnt /β-catenin signalveien, men i forskjellige konsentrasjoner og i forskjellige nivåer av signalering av dette.
(A, C) Derricin hemmer Wnt-reporter aktivitet start 10 mikrometer i luciferase analyser av RKO-pBAR /
Renilla Hotell og av HEK293t. (B, D) Derricidin hemmer litt Wnt-reporter aktivitet ved 20 mikrometer i RKO-pBAR /
Renilla Hotell og HEK293t. I RKO-pBAR /
Renilla
er høyere hemming oppnås ved 50 mikrometer av derricidin (B). (A, B) 10, 20, 50 pM av hver chalconforbindelsen. (C, D) 10, 20, 30 pM av hver chalconforbindelsen. (E) HEK293T aktivering av Wnt signalisering gjennom transfeksjon av β-catenin undertrykkes ved derricin behandling, men ikke derricidin. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001
Derricin og derricidin hemme dobbel akse formasjonen i
Xenopus
embryoer og undertrykke Wnt /β-catenin luciferase reporter aktivitet
in vivo
Wnt-indusert sekundær akse formasjonen i
Xenopus
er relatert til overaktivering av Wnt /β-catenin signal under utviklingen av
Xenopus
embryoer, og dermed negative modulatorer av denne reaksjonsveien er i stand til å reversere eller redusere dobbeltakse-fenotypen [26,27]. Som våre data sterkt indikerte at disse flavonoider er hemmere av kanoniske Wnt signal, bestemte vi oss for å analysere evne derricin og derricidin å påvirke Wnt-indusert dobbel akse formasjonen i
Xenopus
embryoer. Vi co-injisert embryoer med
x
Wnt8 mRNA og derricin eller derricidin i ventral blastomeres av 4-celle-trinns
Xenopus
embryoer. Vi har observert at ca. 73% av embryoene viste en sekundær akse etter
x
Wnt8 injeksjon (fig. 7B, E, F). Men co-injeksjon av
x
Wnt8 med derricin eller derricidin redusert induksjon av ektopisk aksen (Fig. 7C, D). Ko-injeksjon med derricin var i stand til å redusere den doble akse med 43%, mens derricidin reduseres det med 41% (fig. 7E, F). I tillegg utførte vi luciferase eksperimenter ved å injisere plasmidet S01234-Luc på ventrale siden av
Xenopus
embryoer. Dette
Siamois
-reporter er i stand til å svare på den Wnt signale aktivering indusert av co-injisering av xWnt8 mRNA. Vi injisert samtidig 0,4 pmol /embryo av derricin og derricidin å teste om de kan hemme reporter aktivering. Som et resultat, både chalconer redusert reporteraktiviteten i betydelig grad (fig. 7G). Disse dataene indikerer at derricin og derricidin kan også hemme Wnt /β-catenin vei
in vivo
i
Xenopus laevis
embryo modell.
Representative bilder av embryo co- injisert med xWnt8 mRNA pluss DMSO (B) eller xWnt8 mRNA pluss derricin eller derricidin (C, D). Observer ufullstendig dobbel akse dannelse eller sekundær akse ablasjon i embryoer injisert med chalconer. (E-F) Grafer viser prosenter av embryo fenotyper. Observer at samtidig injeksjon av chalconer med xWnt8 mRNA redusert andelen embryoer med dobbel akse, og økt andelen av normale embryoer, med en akse. (G)
Xenopus
embryoer injisert med S01234 reporter +
Renilla
, xwnt8 (10pg) med DMSO eller chalconer (0,4 pmol /embryo). Aktiveringen av reporter ble forhindret av chalcon injeksjon. Pilspisser: sement kjertel; pil: ufullstendig dobbel akse; A-P: anterior-posterior aksen
Diskusjoner
flavonoid forbruk har lenge vært assosiert med forebygging, kontroll og behandling av ulike kreft hos mennesker [28].. I forhold til kolorektal kreft, har mange flavonoider vært forbundet med kontroll og forhindring av denne sykdom [9,16-18]. Chalconer, for eksempel, kan gi fordeler som antitumormidler, sammenlignet med andre flavonoider, fordi de har liten interaksjon med DNA, og således en lav risiko for mutagenese [29]. I denne studien viste vi at to flavonoider (fig. 1), fra den chalcon underklassen, har potent anti-proliferative effekter i kolorektal tumorcellelinjer, HCT116 og DLD-1. Derricin og derricidin begge sterkt inhiberte totalt celletall og levedyktigheten til disse cellene
in vitro plakater (fig. 2) og også redusert HCT116 og DLD-1 celleproliferasjon i lignende nivåer etter 24 timer (fig. 3). Vi har også analysert derricin og derricidin effekter i IEC-18, et ikke-transformert epitelcellelinje. Cellelevedyktigheten ble bare svekket ved høyere konsentrasjoner, forskjellig fra det som skjer i HCT116 og DLD-1-celler. Videre 30 pm fra begge chalconer hadde en litt bevirke i IEC-18 celleproliferasjon, mens en reduksjon på omtrent 50% ble observert i HCT116 og DLD-1-celler. Disse resultatene tyder på en mulig effekt mer begrenset til CRC-celler.
Derricin og derricidin effekter er relatert til modulering av cellesyklusutvikling, hovedsakelig ved å endre prosentandelen av celler i G2 /M og S faser av cellesyklusen i HCT116 og G0 /G1 i DLD-1 (fig. 4). Interessant, derricin og derricidin cellesyklusstans i forskjellige faser av cellesyklusen i hver cellelinje. Disse effekter kan være forbundet med en spesifikk flavonoid effekt i modulering av forskjellige cellesyklusregulerende proteiner, og forskjeller i bakgrunnen av muterte gener i hver cellelinje som kan forklare disse forskjellige effekter [30]. I tillegg derricin og derricidin ikke hadde noen signifikant effekt i IEC-18, et ikke-tumorcellelinje. Disse resultatene kan korreleres med andre rapporter om viktige cytotoksiske virkninger av disse flavonoider [31,32]. Annet chalconer besitter apoptotiske og antiproliferative effekter [33,34,35].
Nyere studier har bedret forståelse av virkningsmekanismer av flavonoider. For eksempel, mange flavonoider er modulatorer av ulike signalveier som Wnt /β-catenin, som vanligvis forbindes med kolorektal tumorprogresjon [1,2,3,5,36]. I denne studien ble det observert at antitumor-virkningene av derricin og derricidin kan relateres til Wnt sti-modulasjon, fordi de betydelig redusert nukleær lokalisering av β-catenin og redusert Wnt-reporter aktivering i HCT116-celler (Fig. 5). For bedre å forstå effekten på Wnt signal i disse chalconer, utførte vi gen-reporter analyser i RKO-pBAR /
Renilla Hotell og HEK293T cellelinjer, som er klassisk brukes til å undersøke denne veien [21,26]. Derricin inhiberte sterkt Wnt signalering ved en konsentrasjon på 10 uM, mens derricidin nådde liknende hemmende nivåer bare 50 uM i begge cellelinjer (Fig. 6A, C). Også derricin og derricidin hemme Wnt signalisering gjennom ulike mekanismer, ettersom derricin er i stand til å motvirke β-catenin Wnt signaleringsaktivering, mens derricidin er ikke (fig. 6E). Denne forskjellen i konsentrasjonsrelaterte effekt av de to chalconer kan være relatert til deres kjemiske struktur og /eller til den måte at de vekselvirker med wnt komponenter eller cellekamre, som har dyptgående virkninger på deres potens og selektivitet.
