Abstract
NPRL2, en av tumorsuppressorgener som befinner seg i en 120 kb homozygot delesjon region av humant kromosom båndet 3p21.3, har en høy grad av aminosyresekvenshomologi med det nitrogen permease regulatoren 2 (Npr2) gjær genet, og mutasjoner av
NPRL2
i gjærceller er assosiert med resistens mot cisplatin-mediert celledreping. Tidligere viste vi at restaureringen av NPRL2 i NPRL2-negative og cisplatin-resistente celler resensitize lungekreftceller til cisplatin behandling
in vitro og in vivo
. I denne studien, viser vi at sensibilisering av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler til cisplatin ved NPRL2 oppnås gjennom regulering av sentrale komponenter i DNA-skader sjekkpunkt veien. NPRL2 kan fosforylere ataksi telangiectasia mutert (ATM) kinase aktiveres av cisplatin og fremme nedstrøms γ-H2AX formasjon
in vitro Hotell og
in vivo
, som oppstår under apoptose samtidig med den første opptreden av høy- høymolekylvekt DNA-fragmenter. Dessuten, denne kombinasjonen behandling resulterer i høyere Chk1 og Chk2 kinase aktivitet enn gjør behandling med cisplatin alene og kan aktivere Chk2 i pleural metastaser tumor xenograft i mus. Aktivert Chk1 og Chk2 øke uttrykket av cellesyklus sjekkpunkt proteiner, inkludert Cdc25A og Cdc25C, som fører til høyere nivåer av G2 /M arrest i tumorceller behandlet med NPRL2 og cisplatin enn i tumorceller behandlet med cisplatin bare. Våre resultater tyder derfor på at ektopisk uttrykk for NPRL2 aktiverer DNA skader sjekkpunkt sti i cisplatin bestandige og NPRL2-negative celler; derav, kan kombinasjonen av NPRL2 og cisplatin resensitize cisplatin nonresponders til cisplatin behandling gjennom aktivering av DNA-skade sjekkpunkt vei, som fører til celle arrest i G2 /M fase og induksjon av apoptose. Den direkte implikasjon av denne studien er at kombinasjonsbehandling med NPRL2 og cisplatin kan overvinne cisplatin motstand og forbedre terapeutisk effekt
Citation. Jayachandran G, Ueda K, Wang B, Roth JA, Ji L (2010)
NPRL2
sensitizes Menneskelig ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler til Cisplatin Behandling ved å regulere nøkkelkomponenter i DNA Repair Pathway. PLoS ONE 5 (8): e11994. doi: 10,1371 /journal.pone.0011994
Redaktør: Kerstin Borgmann, Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf, Tyskland
mottatt: 07.12.2009; Godkjent: 09.07.2010; Publisert: 05.08.2010
Copyright: © 2010 Jayachandran et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, SPORE P50CA70907, R01CA116322, og MMHCC U01CA10535201; tilskudd fra det amerikanske forsvarsdepartementet Lung Cancer Program PROSPECT (DAMD17-02-1-0706); The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center Support Kjerne Grant (CA-16672); og et stipend fra tobakks Settlement Funds som bevilget av Texas State Legislature. Virkemiddelapparatet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
NPRL2 /Gene 21 plakater (GenBank tiltredelse # AF040707), som er 1351 bp langt og koder for et protein med 380 aminosyrerester, er en av de tumorsuppressorgener identifisert i en 120 -kb homozygot delesjon region på menneskelig kromosom bandet 3p21.3 [1], [2]. Den hyppige og tidlig tap av heterozygositet og de overlappende homozygot delesjoner er observert i den 3p21.3 region i lunge- og brystkreft foreslå en kritisk rolle av ett eller flere gener 3p21.3 i molekyl patogenesen av disse kreftformene [1], [3] .
nitrogen-permease regulator 2 (Npr2) gjærgen (GenBank tiltredelse # P39923) ble identifisert som en ny komponent som er involvert i celledreping utløst av cisplatin. Fordi forstyrrelse av Npr2 ble vist å gi resistens mot cisplatin, ble det antatt at NPRL2 kan bruke en lignende mekanisme for å megle cytotoksisitet av kreftmedisiner [4]. Vi har nylig funnet ut at reexpression av NPRL2 i NPRL2-negative og cisplatin-resistente celler betydelig resensitized responsen av disse cellene til cisplatin behandling, noe som gjenspeiles ved redusert celle levedyktighet og økt apoptose
in vitro Hotell og
i vivo product: [5]. Men de molekylære hendelsene ansvarlige for resensibilisering til cisplatin av
NPRL2
ikke er identifisert. I denne studien forsøker vi å forstå molekylær forbindelse mellom NPRL2 og cisplatin i å overvinne medikamentresistens.
Virkningene av cisplatin blir mediert gjennom høye nivåer av DNA-skade, som fører til programmert celledød eller cellesyklus-stans [6 ]. De dobbeltkjedet DNA bryter indusert av cisplatin blir mediert gjennom en sentral DNA-skade-signalveien styres av ataxia telangiectasia mutated (ATM) kinase, så vel som en rekke andre DNA-skade-responsive kinaser [7], [8]. Fosforylering av ATM på serin-1981 har vist seg å fosforylere histone H2AX [9], og fosforylering av histone H2AX på serin-139 (γ-H2AX) er avgjørende for rekruttering av meglere som MDC1 (formidler av DNA-skader sjekkpunkt protein 1), 53BP1 (p53-binding protein 1), BRCA1 (brystkreft 1), og MRE11 (meiotisk rekombinasjon 11) -RAD50 (strålingsfølsomme 50) -NBS1 (Nijmegen skadesyndrom 1) kompleks [10] – [13]. Fosfo-ATM letter fosforyleringen av disse mediatorer, og dannelse av foci av de aktiverte molekyler som fremmer overføring av DNA-skade signal til nedstrøms mål, slik som Chk1 (sjekk punkt kinase 1), Chk2 (sjekkpunktet kinase 2), og SMC1 (strukturell vedlikehold av kromosomer 1) [14] – [16]. Chk1 og Chk2 er involvert i ulike DNA-skade reaksjoner, inkludert cellesyklus sjekkpunkt, genom vedlikehold, DNA-reparasjon, og apoptose [17].
Derfor har vi en hypotese om at sensibilisering av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler til cisplatin hos NPRL2 kan være på grunn av den direkte regulering av hovedkomponentene i den DNA-skade sjekkpunkt pathway. For å teste denne hypotese, analyserte vi effektene av ektopisk ekspresjon av NPRL2 i nærvær eller fravær av DNA-ødeleggende middel cisplatin på tumorcellevekst og apoptose i et panel av NSCLC-cellelinjer med variert status av det endogene NPRL2 gen og protein ekspresjon og cisplatin følsomhet. Vi viser at reexpression av NPRL2 i NPRL2-negative og cisplatin-resistente celler aktiveres betydelig de viktigste komponentene, inkludert ATM, chk, og H2AX, og resensitizes lungekreft celler til cisplatin behandling
in vitro Hotell og
i vivo
, som fører til cellesyklusarrest i G2 /M fase og induksjon av apoptose. Funnene i denne studien gir også eksperimentell støtte for vår hypotese om at NPRL2 kan fungere ikke bare som en prognostisk biomarkør for følsomhet for cisplatin, men også som et terapeutisk middel for resensitizing nonresponding kreftceller til cisplatin.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
Den menneskelige NSCLC cellelinjer H1299 [5] og H322 [5], med ulike 3p21.3 status beskrevet tidligere [18], [19], var brukes til
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter. H1299 og H322 er cisplatin-resistente (50% inhiberende konsentrasjon [IC
50] og IC
20 verdier for cisplatin i H1299 var 7,6 og 3,0 pM, henholdsvis, og i H322 var 13,1 og 5,0 uM, henholdsvis, så vurdert av XTT analyse) og uttrykker ikke NPRL2 protein (vurdert av Western blotting) [5]. Den cisplatin-sensitive NSCLC cellelinje H1437 og cisplatin-resistente cellelinje H1437R har blitt beskrevet tidligere [5].
Antistoffer, reagenser, og dosering
Anti-ATM (5C2), anti- Chk1 (G-4), anti-Chk2 (H-300), anti-Cdc25A (F-6), anti-cyklin B1 (GNS1), og anti-caspase-2 (H-19) ble anskaffet fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California). Anti-fosfor-Chk1 (Ser345), anti-fosfor-Chk2 (Thr68), anti-fosfor-Chk1 (Ser345), anti-NBS1, anti-fosfor-NBS1 (Ser343), anti-SMC1, anti-fosfor-Cdc25C ( Ser216), ble anti-fosfor-Cdc2 (Tyr15), anti-caspase-3, og anti-caspase-9 kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-ATM Protein Kinase pS1981 var fra Rockland immunochemicals (Gilberts, PA), anti-fosfor-histon H2AX (Ser139) var fra Upstate Bioteknologi (Lake Placid, New York), anti-fosfor-SMC1 var fra Novus Biologicals (Littleton, CO) og anti-caspase-8 og anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) var fra BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA).
For alle Western blotting, anti-β-aktin (Sigma , St. Louis, MO) ble anvendt som kontroll lasting. Cisplatin ble kjøpt fra Bristol-Myers Squibb Company (Princeton, NJ). DOTAP ble anvendt for å transfektere de plasmidvektorer til H1299 og H322-celler. Cisplatin behandlingen ble alltid administrert til cellene på IC
20 dosering (5). DOTAP: kolesterol (DOTAP: Chol). (20 mM) i 5% dekstrose i vann, anvendes for
in vivo
forsøk ble syntetisert ved vårt laboratorium med bruk av standardprosedyrer som er beskrevet tidligere [5]
Konstruksjon av plasmidvektorer som uttrykker NPRL2
NPRL2 cDNA ble skåret ut fra plasmidet Pad-RAP-NPRL2 [2] inneholdende human NPRL2 cDNA og ble ligert inn i multicloning side pdCpG-KGB2 ekspresjonsvektor. Kloningsstrategien er tidligere beskrevet [5]. Tom vektor (pdCpG-KGB2), og en plasmid vektor som uttrykker lacZ-genet ble anvendt som negative kontroller. Vi hadde tidligere bekreftet at transfeksjon av denne NPRL2 vektor kan faktisk uttrykke eksogene NPRL2 protein
in vitro Hotell og
in vivo product: [5] ved hjelp av anti-NPRL2 antistoff kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA ).
immunfluorescens farging og flowcytometrisk analyse for γ-H2AX
immunfluorescens farging ble utført i celler dyrket i kammer lysbilder. Ved angitte tidspunkter ble H1299-celler behandlet med NPRL2 med eller uten cisplatin fiksert i 10% formalin og inkubert med anti-fosfo-histon H2AX (Ser139) (1:100) antistoffer i 5% fosfat-bufret saltvann (PBS) med bovin serum albumin i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble cellene inkubert med esel-anti-muse-IgG-fluorescein-isotiocyanat (FITC) (Santa Cruz Biotechnology) fortynnet 1:100 i PBS i 45 minutter, og prøvene ble montert med Vectashield monteringsmedium med 4 «, 6-diamidino- 2-fenylindol (DAPI) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) for å counterstain kjernene. Umiddelbart, ble platene undersøkt med bruk av et fluorescens mikroskop. Også, etter inkubering med FITC-antistoff, ble cellene høstet, og FITC-positive celler ble tellet ved flowcytometrisk analyse.
Chk1 og Chk2 kinase aktivitetsanalyse
Chk1 og Chk2 kinaseaktivitet i H1299-celler behandlet med NPRL2 med eller uten en IC
20 verdi av cisplatin ble vurdert under anvendelse av en K-LISA Checkpoint aktivitet Kit (EMD Biosciences, San Diego, CA), som er en enzymkoblet immunosorbent analyse (ELISA) -basert aktivitetsanalyse. Kort fortalt ble H1299 cellene sådd ut i 60 mm-retter på 4 × 10
5 celler per tallerken og dagen etter ble behandlet med 4 mikrogram tom vektor eller NPRL2 med eller uten 3,0 mikrometer cisplatin. Etter 72 timers inkubering, ble cellelysater fremstilt ved hjelp av radioimmunopresipitasjonsanalyse analyse (RIPA) /PBS-buffer (1% NP-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS]). Cellelysater (0,5 ml med total proteinkonsentrasjon på 2 mg /ml) ble forhånds fjernet ved tilsetning av 15 ul protein A /G-Protein Plus agarosekuler (Santa Cruz Biotechnology) og inkubert i 15 minutter ved 4 ° C. Etter sentrifugering ble de forhåndserte lysater overført til et friskt rør med 20 pl Chk1 eller Chk2-antistoff og rotert i en time ved 4 ° C. Deretter ble 50 ul protein A /G-protein Plus agarosekuler tilsatt og rotert i 90 minutter ved 4 ° C. Agarosekulene ble vasket med RIPA /PBS-buffer, og en K-LISA Checkpoint aktivitet Kit ble anvendt i henhold til produsentens instruksjoner. Aktivitet ble bestemt ved å lese av absorbans ved to bølgelengder av 450 og 570 nm med bruk av en konvensjonell ELISA plateleser.
Generering av stabile kloner av lungekreftcellelinjer med short interfering RNA-mediert Chk2 genet Slå
for å generere cellelinjer med stabil knockdown av Chk2 uttrykk, vi først screenet fire korte interfererende RNA (siRNAs) klonet inn dobbel (U6-H1) promoter ekspresjonsvektorer kjøpt fra System biovitenskap (Mountain View, California). Kort fortalt ble vektoren fordøyd med BbsI og bundet med herdet Chk2 siRNA designet basert på web-baserte verktøy. Alle sense oligonukleotider hadde AAAG ved 5′-enden, og alle antisense oligonukleotider hadde AAAA-sekvensen ved 5′-enden. Vi har også tatt med en mutant som kontroll. Sekvensene var som følger: CHK2Si1: 5’aaagGAACCTGAGGACCAAG3 «; CHK2ASi1: 5’aaaaCTTGGTCC TCAGGTTC3 «; CHK2Si2: 5’aaagCGCCGTCCTTTGAATA 3 «; CHK2ASi2: 5’aaaaTATTC AAAGGACGGCG3 «; CHK2Si3: 5’aaagAACGGTATTATACAC CHK2ASi3: 5’aaaaGTG TATAATACCGTT 3 «; CHK2Si4: 5’aaagAGTTTCAAGATCTTCTGTC 3 «; CHK2ASi4: 5’a aaaGACAGAAGATCTTGAAACT 3 «; CHK2Simta: 5’aaagGCTAGCTAGTCGATC 3 «; CHK2Simtb: 5’aaaaGATCGACTAGCTAGC3 «. Stabile kloner ble utvalgt med bruk av puromycin (1 pg /ml); og etter at de ble etablert, ble de undersøkt for uttrykk nivåer av Chk2 protein i forhold til å kontrollere. Den klone med best lyddemping effekt (CHK2Si1 og CHK2ASi1) ble valgt for funksjonelle studier.
Forbigående stanse av NPRL2 genuttrykk i lunge kreft cellelinjer.
For transient knockdown av NPRL2 uttrykk, vi brukte syntetiske doble strandet sirnas å målrette NPRL2 koding mRNA sekvens og de tilsvarende egge sirnas ble brukt som uspesifikke kontroller. En SMART-pool av fire On-target NPRL2 spesifikke sirnas ble brukt i denne studien: målet sekvenser var 5’GCAUCGAACACAAGAAGUA 3 «, 5’GCAAGACAGGCAUGAGCUA 3», 5’GUACUACGGCGUUGUGACA 3 «, og 5’GAC CCAAGAUCACCUAUCA 3». Disse sirnas ble kjøpt fra Dharmacon (Lafayette, CO). H1299 celler ble ko-transfektert med NPRL2 uttrykker plasmid og NPRL2-sirnas, og tom plasmid vektor og egge sirnas ble brukt som kontroller, henholdsvis. Celler ble først transfektert med NPRL2 plasmidvektor ved hjelp av Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) med 2,5 ug av DNA for 2 x 10
5 celler per brønn i en 6-brønns plate. Seks timer etter transfeksjon plasmid ble cellekulturmediet erstattet med friskt en uten antibiotika og Cellene ble så transfektert med sirnas ved hjelp DharmaFECT transfeksjon reagens med 50 uM av siRNA kompleksbundet med 5 ul DharmaFECTper godt i det ovenfor angitte 6-brønns plate. Celler ble samlet opp 24, 48, og 72 timer etter transfeksjon for fremstilling av råprotein lysatene for Western blot-analyse.
Immunoutfelling-Western blot-analyser
H1299-celler ble behandlet med 4 ug av tom vektor eller NPRL2 med eller uten 3,0 mM cisplatin. Etter 72 timers inkubering, ble cellelysater fremstilt ved anvendelse av RIPA /PBS-buffer (1% NP-40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS). Etter blokkering med 1 ug av normal IgG og 20 ul protein A /protein-G-Plus-agarosekuler (Santa Cruz Biotechnology), ble protein immunutfelt fra 500 ug-ekstrakter ved anvendelse av 2 ug anti-Cdc2 eller anti-cyklin B1-antistoff (i Santa Cruz Biotechnology) og 30 ul protein A /G-protein Plus agaroseperler i 5 timer ved 4 ° C. Agarose ble oppsamlet ved sentrifugering og deretter vasket fire ganger med iskald PBS-buffer. Deretter ble immunopresipitatene resuspendert i 1 x SDS-prøvebuffer og oppvarmet med 50 mM DTT ved 95 ° C i 5 min; Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [20].
Analyse av cellecykluskinetikken
Endringer i cellecykluskinetikken i tumorceller behandlet med NPRL2 med eller uten cisplatin ble analysert ved strømningscytometri (med bruk av en fluorescens-aktivert cellesorterer [FACS]) ved anvendelse av en APO-BrdU KIT (BD Biosciences Pharmingen). I korthet ble cellene sådd ut i 60 mm-retter på 4 × 10
5 celler per tallerken; den følgende dag ble cellene behandlet med 4 ug av tom vektor eller NPRL2-uttrykkende vektor med eller uten cisplatin. På utpekte tidspunkter ble cellene høstet og fiksert i 1% paraformaldehyde. Etter inkorporering av 5-brom-2′-deoksyuridin 5′-trifosfater (BrdUTPs), ble celler visualisert under anvendelse av FITC-merket anti-BrdU-antistoff. Mengden av totalt cellulært DNA ble oppnådd ved å merke celler med PI /RNase-buffer. Celler ble bearbeidet for FACS-analyse ved terminal deoxynucleotidyltransferase-mediert deoksyuridin 5-trifosfat (dUTP) nick-endemerking (TUNEL-farging) for å bestemme cellesykluskinetikk, som tidligere beskrevet [20].
Dyreforsøk
Alle dyr ble opprettholdt og eksperimenter utført i henhold til National Institutes of Health og institusjonelle retningslinjer som er fastsatt for dyre Kjerne Facility ved The University of Texas MD Anderson Cancer Center. Dyrene som brukes i denne studien var kvinnelige
Nu /nu
mus (4-6 uker gamle) som ble kjøpt fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Før tumorcelle inokulering, ble musene underkastet 3,5 Gy av total kroppsbestråling fra en cesium-137 strålingskilde for fullstendig å gjengi immunsystemet hos nakne mus fra avvisning av tumor xenografting. For å evaluere effekten av systemisk administrering av NPRL2 og cisplatin i en ortotopisk modell av pleural formidling, mottok musene en intrathoracic injeksjon (27-gauge nål) av en suspensjon av H322-celler ved en tetthet på 2 x 10
6 celler per 100 pl. Musene ble tilfeldig delt inn i følgende 4 grupper: A, ble behandlet med LacZ; B, behandlet med LacZ og cisplatin; C, behandlet med NPRL2; og D, behandlet med NPRL2 og cisplatin. . Hver behandlingsgruppe besto av 2 mus
På dag 26, vi administrert forskjellige nanopartikler (DOTAP: Chol-DNA-kompleks) intravenøst i halevenen til alle mus i en dose på 25 ug av plasmid-DNA (LacZ eller NPRL2 plasmid) og 10 nmol av DOTAP: Chol hver i 100 ul av 5% dekstrose i vann per mus. I gruppe B og D, injiserte vi cisplatin (2,5 mg /kg kroppsvekt) intraperitonealt sammen med nanopartikler. For å estimere γ-H2AX og fosfo-Chk2 (Thr68) ekspresjon i tumorer, ble musene sscrificed 48 timer senere, og pleural tumorer (større enn 5 mm) av hver gruppe ble tilfeldig høstet og flash-frosset. γ-H2AX-ekspresjon ble estimert ved hjelp av anti-fosfo-histon H2AX (Ser139) (1:100) antistoff og esel anti-mus-IgG-FITC. Prøvene ble deretter montert med Vectashield med DAPI til counterstain kjernene. Umiddelbart, ble platene undersøkt med bruk av et fluorescens mikroskop. Også fosfor-Chk2 uttrykk ble analysert ved anti-fosfor-Chk2 (Thr68) antistoff (1:100) ved hjelp av en Vectastain Elite ABC kit (Vector Laboratories) og ble deretter mikroskopisk undersøkt.
Statistiske analyser
Alle eksperimenter ble gjentatt minst to ganger med like eller triplikate prøver. ANOVA og Fisher test ble brukt for å sammenligne verdiene av test- og kontrollprøver.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statview 5.0-programvaren (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA) ble brukt for alle statistiske analyser.
Resultater
Induksjon av caspase aktiviteter i respons på behandling med NPRL2 og cisplatin
NPRL2 sensitizes cisplatin-resistente celler (H1437R) til cisplatin-indusert apoptose (figur 1A). Økt apoptose ble påvist i alle de tre NPRL2-negative, cisplatin-resistente cellelinjer som ble behandlet med tvungen ekspresjon av NPRL2 og cisplatin. Som vist i figur 1A, ble apoptose indusert på 33,4%, 42,0% og 21,8% av H1437R, H1299, og H322-celler, henholdsvis, etter kombinerte behandlinger. Vi har også brukt Western blotting for å bestemme aktivering av kaspaser i H1299 celler behandlet med tom vektor, tom vektor og cisplatin, NPRL2, eller NPRL2 og cisplatin (figur 1B). Caspase-3, -8, -9 og ble aktivert bare i H1299 celler behandlet med NPRL2 og cisplatin, som vist av spaltningsproduktene. Aktivering av kaspase-2 ble påvist i celler behandlet med cisplatin eller NPRL2 alene, så vel som kombinasjonen.
(A) Induksjon av apoptose i H1299 celler behandlet NPRL2 i nærvær eller fravær av cisplatin (CDDP) ved flow cytometri analyse med TUNEL farging. PBS behandlede og tom vektor (EV) behandlede celler ble anvendt som mock og negative kontroller, respektivt. Feilfelt angir sikkerhetsdatablad av gjennomsnittet i tre individuelle eksperimenter (*,
P
0,05; **
P
0,0005). (B), aktivering av caspase kaskader i H1299 celler ved Western blot analyse. Flere caspases i H1299 celler ble undersøkt ved Western blotting 72 timer etter behandling med tom vektor (EV) (med eller uten cisplatin) eller med NPRL2 (med eller uten cisplatin). I celler behandlet med NPRL2 og cisplatin, caspaser-3, -2, -8 og -9 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) ble spaltet. Også caspase-2 ble aktivert ved behandling med bare NPRL2.
Aktivering av ATM og NBS1 av NPRL2
Vi brukte Western blotting-analyse for å vurdere aktivering av ATM i H1299 celler i som reaksjon på aktivering av ektopisk NPRL2 i nærvær eller fravær av cisplatin (figur 2A). I H1299-celler transfektert med NPRL2, vi har oppdaget et lavt nivå av fosfor-ATM (Ser1981) som var blitt aktivert ved ATM-kinase; etter behandling med NPRL2 og cisplatin, er fosfor-ATM nivå markert økt på en tidsavhengig måte. I H1299 celler behandlet med tom vektorkontroll og cisplatin, vi har oppdaget ingen endring i fosfor-ATM-ekspresjon sammenlignet med den ubehandlede kontroll. Vi undersøkte også ekspresjonen av fosfo-NBS1 (Ser343) (figur 2A), som blir fosforylert av aktivert ATM og rekruttert til områder av DNA-skade for å fremme overføring av en serie av DNA-skade signaler til nedstrøms mål. Selv om fosfo-NBS1 ikke ble påvist i H1299 celler behandlet med tom vektor og cisplatin, ble det detektert i H1299 celler behandlet med NPRL2, og betydelig økt på en tidsavhengig måte etter behandling med NPRL2 og cisplatin.
( A), Effekter av ektopisk uttrykk for NPRL2 på uttrykk og fosforylering av minibank og NBS1 proteins.H1229 celler behandlet med en tom vektor (EV) vektor og IC
20 dose av cisplatin (3,0 mm), NPRL2, eller NPRL2 og IC
20 dose av cisplatin ble høstet ved 24, 48 og 72 timer etter behandling, og analysert for ekspresjon av ataxia telangiectasia mutated (ATM) kinase, fosfo-ATM (Ser1981), NBS1, og fosfo-NBS1 (Ser343). β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Økninger i fosfo-ATM og fosfo-NBS1 ble observert i celler behandlet med NPRL2 eller NPRL2 og cisplatin på en tidsavhengig måte, men ikke i celler behandlet med kontroll tom vektor og cisplatin. (B), Effekter av NPRL2-spesifikke siRNA (Si) på ekspresjon av NPRL2 og ATM-proteiner i nærvær og fravær av cisplatin (CDDP). Det omkastede siRNA (Sc) ble anvendt som et ikke-spesifikt kontroll.
Spesifisiteten til den NPRL2-mediert aktivering av ATM-signalveien ble ytterligere bekreftet ved eksperimenter ved bruk av genspesifikke sirnas til knockdown NPRL2 ekspresjon i nærvær og fravær av cisplatin i disse H1299 celler (figur 2B). Ektopisk aktivering av NPRL2 i NPRL2-manglende H1299-celler aktivert ATM, som antydet med oppregulert fosfo-ATM-ekspresjon ved 24 timer og 48 timer etter transfeksjon i både nærvær og fravær av cisplatin. Knockdown av NPRL2 uttrykk ved NPRL2 spesifikke sirnas redusert eller svekket NPRL2-mediert oppregulering av fosfor-ATM uttrykk, sammenlignet med de som ble behandlet egge sirnas styrer på samme tidspunkt.
NPRL2 forbedrer uttrykk for γH2AX
in vitro Hotell og
in vivo
Vi brukte Western blotting for en tid kurs evaluering av γ-H2AX protein uttrykk (figur 3A). I H1299 celler behandlet med tom vektor og cisplatin eller NPRL2, γ-H2AX proteinnivåene øker, og var den samme ved 24 og 48 timer etter behandling. Imidlertid, ved 72 timer, de γ-H2AX proteinnivåer i celler behandlet med tom vektor og cisplatin betydelig redusert, mens nivåene i celler behandlet med NPRL2 vært omtrent det samme som de på den 24-h og 48 h-tidspunkter. I celler behandlet med en kombinasjon av NPRL2 og cisplatin, γ-H2AX proteinnivåene øker i en tidsavhengig måte.
H1229 celler behandlet med en tom vektor og IC
20 dose av cisplatin (3,0 pM) , NPRL2, eller NPRL2 og IC
20 dose av cisplatin ble høstet ved 24, 48 og 72 timer etter behandling. (A) Western blot viser bemerkelsesverdig forbedret ekspresjon av γ-H2AX i celler behandlet med NPRL2 og cisplatin, sammenlignet med celler behandlet med tom vektor og cisplatin. (B) γ-H2AX ekspresjon ble undersøkt ved 48 timer etter behandling ved immunofluorescens-farging og strømningscytometrisk analyse. γ-H2AX ekspresjon ble påvist i celler behandlet med tom vektor og cisplatin eller NPRL2 men ikke i celler behandlet med tom vektor bare, og dette uttrykket ble dramatisk forbedret i celler behandlet med NPRL2 og cisplatin. Forstørrelse: × 800. Bety fluoresceinisotiocyanat (FITC) intensitet ble også undersøkt ved 24, 48 og 72 timer etter behandling. På disse tre tidspunkter, γ-H2AX ekspresjon i celler behandlet med NPRL2 og cisplatin var signifikant høyere enn i celler i alle de andre behandlinger (
P
0,02 eller
P
0,0005 ). Barer, SDS av gjennomsnittet i to individuelle eksperimenter. (C) γ-H2AX-ekspresjon ble analysert ved hjelp av immunofluorescens farging i en ortotopisk modell av H322 pleural formidling, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Pleural tumorceller fra mus behandlet med LacZ og cisplatin eller NPRL2 ble svakt farget; i motsetning til dette ble γ-H2AX hyperexpressed i celler behandlet med NPRL2 + cisplatin. Forstørrelse:. × 400
Deretter immunfluorescens farging og flowcytometrisk analyse for γ-H2AX uttrykk ved 48 timer etter behandlingen ble utført (figur 3B). Ekspresjon av γ-H2AX proteinekspresjon i kjernen av celler behandlet med både NPRL2 og cisplatin ble forbedret sammenlignet med det i alle andre grupper. Videre er den midlere FITC intensiteten av NPRL2 og cisplatin behandling var signifikant forhøyet sammenlignet med den for alle andre behandlinger (
P
0,02). I løpet av tidsforløpet
γ-H2AX protein ekspresjon var deretter målt i en human NSCLC H322 ortotopisk pleuralt tumor xenograft i mus. Den H322-cellelinjen er NPRL2-negative og cisplatin-resistente. På dag 26 etter intrathoracic injeksjon av H322-celler, vi administrert NPRL2 eller LacZ nanopartikler i halevenen, med eller uten intraperitoneal injeksjon cisplatin. Pleural tumorer fra mus som var behandlet med LacZ sammen med cisplatin eller NPRL2 svakt farget for γ-H2AX (figur 3C). Svulster som behandles med NPRL2 og cisplatin viste høye nivåer av γ-H2AX (Figur 3C).
Aktivering av Chk1 og Chk2 av NPRL2 og cisplatin
in vitro Hotell og
in vivo
Vi undersøkte fosforylering av Chk1 på Ser-345 og Chk2 på Thr-68 ved Western blotting (figur 4A). I H1299 celler behandlet med tom vektor og cisplatin eller NPRL2, økt fosforylert Chk1 på en tidsavhengig måte. I celler behandlet med NPRL2 og cisplatin, ble Chk1 uttrykk sterkt forbedret. Selv om fosforylert Chk2 ikke ble detektert i H1299 celler behandlet med tom vektor og cisplatin, det tydelig øket i en tidsavhengig måte i celler behandlet med NPRL2 eller NPRL2 med cisplatin. Vi evaluerte fosfo-Chk2 proteinekspresjon i ortotopiske tumorxenografter ved immunhistokjemisk farging av tumorceller fra hver gruppe (figur 4B). Tumorceller fra mus som ble behandlet med LacZ eller LacZ og cisplatin hadde meget lavt nivå farging. For tumorer behandlet med NPRL2, ble fosfo-Chk2 ekspresjon detektert ved et lavt nivå (figur 4B). Behandling med kombinasjons NPRL2 og cisplatin indusert høy fosfor-Chk2 uttrykk.
(A) H1229 celler behandlet med tom vektor og IC
20 av cisplatin (3,0 mm), NPRL2, eller NPRL2 + med IC
20 dose av cisplatin ble høstet ved 24, 48 og 72 timer etter behandling, og analysert for ekspresjon av Chk1, P-Chk1 (Ser345), Chk2, og P-Chk2 (Thr68). I celler behandlet med tom vektor og IC
20 dose av cisplatin eller NPRL2, økt P-Chk1 på en tidsavhengig måte. I motsetning til hos pasienter behandlet med NPRL2 og IC
20 dose av cisplatin, P-Chk1 ble dramatisk forbedret. Selv om P-Chk2 ikke ble påvist i H1299 celler behandlet med tom vektor og IC
20 dose av cisplatin, ble det klart økt i en tidsavhengig måte hos pasienter behandlet med NPRL2 eller NPRL2 + IC
20 dose av cisplatin. (B) P-Chk2 uttrykk ble immunohistochemically analysert i en orthotopic modell av H322 pleural formidling, som beskrevet i Materialer og metoder. P-Chk2 ekspresjon ble lett detektert i pleural svulstceller fra mus behandlet med NPRL2 nanopartikler, men ikke i de som ble behandlet med LacZ eller LacZ + cisplatin. I motsetning til behandling av NPRL2 nanopartikler og cisplatin indusert høy fosfor-Chk2 uttrykk i tumorceller. Forstørrelse: × 400. (C) Et kinaseaktiviteten Chk1 og Chk2 på H1299-celler behandlet med tom vektor + IC
20 dose av cisplatin, NPRL2 eller NPRL2 + IC
20 dose av cisplatin ble analysert ved anvendelse av en K-LISA Checkpoint aktivitet Kit , en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) -basert aktivitetsanalyse. Chk1 kinase aktiviteten var større i celler behandlet med NPRL2 + cisplatin enn i celler behandlet med tom vektor eller tom vektor + cisplatin (
P
0,003). Chk2 kinase aktivitet ble sterkere forbedret i celler behandlet med NPRL2 eller NPRL2 + cisplatin enn i celler behandlet med tom vektor eller tom vektor + cisplatin (
P
0,0001). Barer, SDS av gjennomsnittet i fire individuelle eksperimenter.
Vi målte også kinase aktivitet Chk2 og Chk1 i H1299 celler behandlet med NPRL2 med eller uten cisplatin med bruk av K-LISA Checkpoint Aktivitetspakke , en ELISA-basert kinase aktivitetsanalyse. Chk2 kinase aktivitet i celler behandlet med NPRL2 eller NPRL2 og cisplatin ble sterkt forbedret sammenlignet med aktivitet i celler behandlet med tom vektor med eller uten cisplatin (
P
0,0001) (Figur 4C). Chk1 kinase aktivitet i celler behandlet med NPRL2 og cisplatin var sterkere enn i celler behandlet med tom vektor med eller uten cisplatin (
P
0,003). (Figur 4C)
For ytterligere å definere natur Chk2 interaksjon med NPRL2, analyserte vi effekten av NPRL2 og Chk2 uttrykk på apoptose ved hjelp Chk2 spesifikke siRNA (figur 5A) for å slå ned Chk2 uttrykk i cisplatin-resistente H1437 celler (H1437R) (figur 5B). β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
