Abstract
Bakgrunn
Cancer stamceller (cscs) er en undergruppe av tumorceller med evne til å fornye seg selv og generere forskjellige celler som utgjør tumoren. Målet med denne studien er å evaluere den prognostiske verdien av cscs i en svært homogen befolkning på stadium II tykktarmskreft.
Metoder
Ett hundre stadium II kolon kreftpasienter som behandles av samme kirurgiske teamet mellom 1977 og 2005 ble retrospektivt analysert. Ingen av pasientene fikk adjuvant kjemoterapi. Inmunohistochemistry uttrykk for CD133, Nanog og CK20 ble scoret, med fire nivåer: 10%, 11-25%, 26-50% og 50% positivitet. Kaplan-Meier analyse og log rank test ble brukt for å sammenligne overlevelse.
Resultater
Den gjennomsnittlige pasientens alder var 68 år (pasientene var mellom 45-92 år) og median oppfølging ble 5,8 år. Det var tilbakevendende sykdom i 17 (17%); CD133 uttrykket (definert ved 10% positivitet) ble vist i 60% av tumorene, i 95% for Nanog og 78% for CK20. Ingen korrelasjon ble funnet mellom uttrykk nivåer av CD133, Nanog eller CK20 og tilbakefall overlevelse (RFS) eller total overlevelse (OS). Men en statistisk signifikant korrelasjon ble funnet mellom etablerte patologiske prognostiske faktorer og RFS og OS.
Konklusjoner
Stem Cell kvantifisering definert av CD133 og Nanog uttrykk har ingen sammenheng med RFS eller OS i denne kohorten av Stage II tykktarmskreft
Citation. Vaz MA, Martinez JC, Devesa JM, Trill JD, Abraira V, Riquelme A, et al. (2014) prognostisk verdi av stamcelle Kvantifisering i Stage II tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (2): e88480. doi: 10,1371 /journal.pone.0088480
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 07.09.2013; Godkjent: 08.01.2014; Publisert: 21 februar 2014
Copyright: © 2014 Vaz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste årsakene til. kreft død på verdensbasis, og overlevelse er påvirket av lokale residiv samt utvikling av metastatisk sykdom.
kreft stamcelle teori er basert på forutsetningen om eksistensen av en liten bestand av kreft-initiere celler, som er utelukkende ansvarlig for vekst og vedlikehold av hele tumoren. Disse cellene har lav proliferativ rente, høy selvfornyelse kapasitet og tilbøyelighet til å differensiere i aktive prolifererende kreftceller, og de er motstandsdyktig mot cellegift og stråling. Disse cellene har blitt rapportert i ulike kreftformer.
Nyere forskningsresultater tyder på at kreftstamcelle modell gjelder også for tykktarmskreft. Ricci-Vitiani og O’Brien rapportert at CD133 positive celler i tykktarmskreft vise egenskapene til kreft initiere celler med selvfornyelse og høy tumorogene potensial. Disse cscs uttrykke pluripotency markører som CD133 og Nanog og uttrykker ikke markører for differensiering som cytokeratin20 (CK20) [1], [2], [3].
Potensialet prognostisk verdi av cscs i kolorektal kreft har blitt undersøkt med motstridende resultater. Men noen av disse seriene var basert på heterogene situasjoner, som involverer rektal og tykktarmskreft og ulike kreft stadier (I-IV). Målet med denne studien er å evaluere den prognostiske verdien av cscs i en svært homogen befolkning på stadium II tykktarmskreft.
Materialer og metoder
Til sammen 100 patologisk bekreftet prøver ble innhentet fra tykktarm kreftpasienter med TNM stadium II, som ble behandlet kirurgisk mellom 1977 og 2005 ved Ramon y Cajal universitetssykehus. For å redusere effekten av adjuvant behandling på prognose ingen av de inkluderte pasientene mottok adjuvant kjemoterapi. Alle pasientene ble fulgt opp for tilbakefall overlevelse og total overlevelse. Den oppfølgingsperioden ble beregnet fra datoen for operasjonen til 2010. Tilbakefall ble definert som re-utseende av den opprinnelige svulsten; og både metastase eller lokalt tilbakefall ble ansett for å være bevis på tumor tilbakefall. Total overlevelse ble definert som tiden fra kirurgi til døden eller på det punktet når pasienten sist ble registrert å være levende. I denne studien kjente prognostiske kliniske faktorer ble også registrert. Høyrisikopasienter ble ansett for å være de som har minst en av følgende funksjoner: inntil 12 lymfeknutene til stede i de kirurgiske prøven, T4 tumor, lymphovascular invasjon og dårlig differensierte tumorer. Den TNM-klassifikasjon ble brukt for patologisk iscenesettelse og Verdens helseorganisasjon klassifiseringen ble brukt for patologiske gradering. Forskningen har etisk komité godkjenning (Ramon y Cajal Universitetssykehus). Skriftlig informert samtykke ble innhentet for bruk av prøven i forskning.
histologisk undersøkelse
Prøvene ble hentet fra patologi filer av Ramon y Cajal universitetssykehus, Madrid, Spania og histologisk anmeldt. Parafinblokker ble hentet for å bygge vev arrays som inneholder 1,5 mm diameter vev sylindere fra tykktarmskreft og kontrollprøver. Hvert vev matrise parafinblokk inneholdt minst 2 prøver av hvert tilfelle for å få en krysskontroll av signal uttrykk. De mest representative områder av hver tumor ble valgt for studien. Reaktiv lymfoid vev (mandlene) ble anvendt som negative kontroller for ekspresjon og innlemmet ved tre eksemplarer i hvert vev matrise. Histopatologiske funksjoner ble uavhengig vurdert. Dette ble etterfulgt av felles observasjon på en multihode mikroskop, hvor avvik ble løst.
Immunohistochemistry (IHC)
Anti-CD133 Rabbit monoklonalt antistoff (Cell Signaling Technology) og geitepolyklonalt maur menneskelig Nanog ( Novus Biologicals), ble brukt til å identifisere stamcellemarkører. Anti-Cytokeratin20 (CK 20) Mus monoklonalt antistoff (Dako, Danmark), ble benyttet for å evaluere differensierte epitelceller. Immunhistokjemisk farging ble utført ved å følge Dako Fast En Vision kanin /mus-metoden (Dako, Danmark). Som en positiv kontroll av mønster ekspresjon og signal spesifisitet, anvendte vi føtale humane hjerne vevssnitt, inkludert hjernen ventrikulære neuro epitel. Dette var det første stedet hvor CD133 uttrykk ble oppdaget i den apikale grensen til neuroephitelial celler [4]. Senere, utgivelsen som membran partikler CD133 positiv, ble observert i ventrikulære væske og ulike menneskelige kroppsvæsker, inkludert gut [5]. Inkubering med et ubeslektet antistoff ble anvendt som en kontroll av antigenisk bevaring og utvinning. Inkubasjon utelate første antistoff ble brukt som en negativ kontroll med en ikke-spesifikk deteksjon system farging.
Immunhistokjemisk undersøkelse
Immunohistochemistry undersøkelse ble gjort fra parafin vevssnitt som inkluderte de mest representative tumorområder . CD133, Nanog og CK20 ble analysert. Svulstene fikk en semi-kvantitativ ranger med fire nivåer: 10%, 11-25%, 26-50% og 50% positivitet. Vi definerte en prøve å være positiv hvis det var . 10% positive celler
Statistical Analysis
Kaplan-Meier analyse ble brukt for å beregne kreftspesifikk overlevelse og gruppene ble sammenlignet med log-rank test. Statistiske prosedyrer ble utført ved hjelp av SPSS versjon 15.0, og p 0,05 var considerer statistisk signifikant. Alle analysene ble utført ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap (SPSS) Software.
Resultater
Clinicopathological Funn
clinicopathological funnene er oppført i tabell 1. Median alder for pasientene var 68 år gammel (pasienter varierer fra 45 til 92 år), 53% var menn og 47% var kvinner.
Kjente høyrisiko clinicopathological funn for tilbakefall ble registrert, definert av færre enn 12 lymfeknuter stede i operasjons prøven, T4 svulster, lymphovascular invasjon og dårlig differensierte svulster, og pasientene ble kategorisert i kategorien høy risiko hvis det var en eller flere av disse risikofaktorene eller i lav risiko kategorien dersom det var ingen risikofaktorer. Femtito prosent var høy risiko og 48% var lave pasienter risiko. Trettifem prosent av pasientene hadde 12 lymfeknutene i kirurgiske prøven. Kun 4% var T4, 9% av pasienten hadde dårlig differensiert histologi og 11% hadde lymphovascular invasjon. På tidspunktet for siste oppfølging 17% av pasientene hadde tilbakevendende sykdom og 61% var i live; 36% var døde, 16% av tykktarmskreft og 20% av andre årsaker.
Den CD133 Antigen Beliggenhet i Colon Cancer
Den positive inmunohistochemical reaktivitet mønster for CD133 observert i periventrikulær neuroepithelial celler (kontroll tilfeller) (fig. 1), er i hold til det som ble observert i tidligere studier [5], og fungerer som en positiv kontroll for spesifisiteten av signalet. Den CD133-antigenet har tidligere vært vist å være plassert i apikal plasmamembranfremspring av kulturer kreftcellelinjen Caco-2 [5].
Vi observerte en polar farging av CD133 begrenset til den apikale celle luminal overflaten av kolorektal kreft kjertler. Vanligvis flere CD133-positive celler ble gruppert sammen. CD133 uttrykk tendens til å bli uttalt nær invasiv margin av svulstene.
CD133 protein uttrykk ble observert i den apikale grensen av tykktarm kreft celler og kjertler, ofte Shedding CD133 positiv rusk inn i luminal kjertler (fig. 2 ). Sporadiske grupper av neoplastiske celler viste positiv hele cytoplasma uttrykk (Fig. 3).
Ingen CD133 positivt signal ble funnet i noen av vev mandel prøver, og heller ikke i slimhinnen av dem, anvendt som negativ kontroll. Denne regelen ut muligheten for falsk positivitet, eller ikke-spesifikk binding av CD133 antistoff som brukes, på slimhinne /luminal mellomrom.
Ved å se på rad vevssnitt, vi sammenlignet CD133 og CK20 protein uttrykk (Fig. 4 ). Felt som inneholder CD133-positive celler viste vanligvis svak eller ingen CK20 protein uttrykk, mens områder med høy CK20 uttrykk var vanligvis CD133 negative. Men grupper av neoplastiske celler som uttrykker samtidig CD133 og CK20 ble vist i tillegg (Fig. 5).
Immunhistokjemisk CD133 Expression
CD133 uttrykk ble påvist i 100% av pasientene . Førti prosent av pasientene hadde 10% positivitet; 22% av pasientene hadde 11-25% positivitet; 6% av pasientene hadde 26-50% positivitet og 22% av pasientene hadde . 50% positivitet
Alle 100 pasienter ble fulgt opp for å overleve for å analysere CD133 uttrykk som en prognostisk faktor. Median oppfølgingstid var 5,8 år. Av de 100 pasientene døde 16,3% av kreft og 20,4% av andre årsaker. Det var 7 tilfeller av lokalt tilbakefall, 11 tilfeller av fjernmetastaser.
gjentakelse frie overlevelseskurver var ikke forskjellig mellom de ulike nivåer av CD133 positivitet uttrykk. Kaplan-Meier kurve for total overlevelse viste ingen statistisk signifikante forskjeller mellom de ulike gruppene (fig. 6).
Nanog Expression
Nanog kjernekraft og cytoplasmisk ekspresjon ble påvist i 99% av pasientene . Fem pasienter hadde 10% positivitet; 9 pasienter hadde 11-25% positivitet; 34 pasienter hadde 26-50% positivitet og 51 pasienter hadde 50% positivitet. Positiv farging ble hovedsakelig observert på han epitelial neoplastiske celler, mange av dem tilfeldige med CD133-positive celler. Imidlertid Nanog positive /negative CD133 neoplastiske celler ble vist i tillegg. Videre Nanog uttrykk ble også observert i neoplastiske stromaceller (data ikke vist).
Kaplan-Meier kurve for tilbakefall og total overlevelse viste ingen statistisk signifikante forskjeller mellom de ulike nivåer av uttrykk (Fig. 7).
CK20 Expression
CK20 uttrykk ble påvist i 78% av pasientene. Tjueto prosent av pasientene hadde 10% positivitet; 29% av pasientene hadde 11-25% positivitet; 26% av pasientene hadde 26-50% positivitet og 23% av pasientene hadde . 50% positivitet
Kaplan-Meier kurve for tilbakefall og overlevelse viste ingen statistisk signifikante forskjeller mellom de ulike grupper av uttrykk
.
forholdet mellom høyrisiko clinicopathological kjent faktorer for pasienter, definert som å ha minst en av de følgende: inntil 12 lymfeknuter som er tilstede i den kirurgiske prøven, T4 svulster, lymphovascular invasjon og dårlig differensierte tumorer, og gjentakelse og overlevelse analysert. En statistisk signifikant korrelasjon ble funnet mellom kjente kliniske faktorer og RFS og OS (p = 0,034) (fig. 8).
Diskusjoner
CD133 er epitop av en glycosilated form human prominin-1, som er et medlem av pentaspan transmembran-glykoprotein [1], og ekspresjon av CD133 er blitt rapportert å være lokalisert i normal neonatale og voksne forløper celle, så vel som kreftceller initiere [2], [3]. Bemerkelsesverdig, er prominin-en spesifikt knyttet plasma membran fremspring [4]. Faktisk, i løpet neurogenesis, partikler uttrykker CD133 har vært vist i nevralrøret lumina, der utgivelsen av CD133 uttrykker membran partikler synes å være en utbredt aktivitet [6]. Videre menneske CD133 stamcelle antigen er også uttrykt av forskjellige humane epitelceller inkludert gut, og målrettet mot plasma membran fremspring [5].
CD133 er i dag ansett som en nyttig markør for å identifisere cscs i tykk- og endetarmskreft. Det er av interesse med hensyn til om CD133-positive celler kan betraktes som en prognostisk faktor. Denne studien har immunohistochemically analysert CD133 uttrykk og vurderes å overleve i en stor serie med stadium II tykktarmskreft og vi fant ut at CD133 uttrykk var ikke en uavhengig risikofaktor forbundet med tilbakefall eller pasientens overlevelse.
Forholdet mellom CD133 uttrykk og prognose i kolorektal karsinom ble undersøkt tidligere. Horst
et al
rapportert at CD133 uttrykk er en uavhengig prognostisk markør [7] mens denne type korrelasjon ikke ble observert av Kojima
et al product: [8]. Men noen av disse seriene var basert på heterogene situasjoner, som involverer rektal og tykktarmskreft og ulike kreft stadier (I-IV). Li
et al
analysert en homogen IIIB gruppe (104 pasienter) og viste at CD133 positive kreftceller har bidratt til utviklingen av tykktarmskreft [9]. Nian-Hua Zang
et al
analysert en gruppe stadium II og III tykktarmskreft grunnlegge en negativ korrelasjon overlevelse hos pasienter med samtidig uttrykk con CDXCR4 og CD133 [10].
Avviket mellom de forskjellige undersøkelser kan være avledet fra utilstrekkelig mengde pasient og den blandede tumor (trinn i til IV og tykktarms- og endetarmskreft).
på den annen side, er det usannsynlig at cscs kan karakteriseres ved kun en markør . Stamcelle-lignende egenskaper har nylig blitt rapportert i CD133-negative celler, så vel. Derfor kan de CD133 positive tumorceller ikke representerer hele kreft-initiering av befolkningen. En kombinasjon av celleoverflatemarkører er behov for definisjonen av tykktarmskreftstamceller. Imidlertid er kreft stilk cellepopulasjon heterogen. Derfor er nivåene av ekspresjon av de forskjellige kreftstamcelle markører er variabel, som et resultat av den biologiske funksjonen mangfoldet av hver av dem.
Nanog, en homeodomain transkripsjonsfaktor, er en viktig regulator for fremme av selv -renewal av embryonale stamceller og hemming av deres differensiering. Tidligere studier indikerte at Nanog er uttrykt i tykktarm kreft celler, og antydet at deres uttrykk bidrar til spredning av tykktarmskreftceller [11]. Videre har flere studier vist at Nanog regulerer forskjellige funksjoner av kreftutvikling, som for eksempel tumorcelleproliferasjon, medikament-motstand og kreftcelle kommunikasjon med den omkringliggende stroma, som fører til cellen motilitet, epitelial-mesenchymale overgang og immunsvik [12].
Vi bestemte oss for å analysere Nanog i denne kohort av pasienter. Nanog og CD133 ekspresjon ble observert i den samme undergruppe av neoplastiske celler. Imidlertid Nanog nivåer av ekspresjon var høyere enn de av CD133, som bestemt ved Nanog positive /negative CD133 neoplastiske celler, som ble vist i tillegg. I tillegg ble Nanog uttrykk også observert i stromaceller, sannsynligvis relatert med mikromiljøet kommunikasjonsfunksjonen.
Vi fant ingen sammenheng mellom CD133 eller Nanog uttrykk og overlevelse (tilbakefall overlevelse og total overlevelse).
Derfor CD133 positive cellene selv kanskje ikke har biologiske evnen forbundet med malignt potensial i tykk- og endetarmskreft.
Tidligere studier med cellesuspensjoner for tykktarmskreft prøver viste at CD133-positive celler var CK20 negative [3]. I vår kohort var 78% av prøvene CK20 positive (definert av 10% positivitet), og heller ingen sammenheng ble funnet med overlevelse
Flere faktorer kan forklare avvikene med tidligere rapporter: a.) Blandet svulst stadier hvor vi analysere en meget homogen ett, b) forskjellige antistoffer anvendt for påvisning av CD-133-molekylet. Faktisk kan forskjellige resultater oppnås ved bruk av forskjellige antistoffer [13], [14] c) forskjellige kriterier som brukes for å identifisere positiv farging og forskjellige cut-off som brukes til å diskriminere positive og negative tumorer. I vår studie har vi etablert fire nivåer av positivitet: 10%, 11-25%, 26-50% og 50%. Andre positiv hvis 50% positivitet, (Horst
et al
), 10% (Kojima
et al
) eller 5% (Li
et al
), d) utilstrekkelig pasientmateriale, kan dette forklare de negative resultater for korrelasjon på en slik kohort med lav tilbakefalls forventning, resulterer kun i et 17% av tilfellene. Likevel kan vi demonstrere en sammenheng med kjente clinicopathologic faktorer og overlevelse.
I tillegg observerte vi et høyt nivå av CD133 og Nanog positivitet i denne gruppen av pasienter i en mer innledende fasen, 60% CD133 positivitet. Videre, i 22% var høyere enn 50%. Vi har også funnet 94% Nanog positivitet og 51% av dem var høyere enn 50%. Disse resultatene går imot med de som finnes av Li
et al, etter hvor opptil 40% av tilfellene i stadium IIIB hadde mindre enn 5% positivitet
Denne uventede oppførselen CD133 uttrykk funnet i. vår studie, høyere i lavere stadium svulster enn i mer avanserte lesjoner, har blitt observert i andre rapporter [15]. Denne fordelingen er i overensstemmelse med tidligere funn i en musemodell for colon carcinogenesis [16] og i humane primære coloncancere [16]. I mus tykktarmskreftutvikling en betydelig økt uttrykk av CD133 har blitt observert, vurdert av immunhistokjemi, i tidlige neoplastiske lesjoner som hadde tendens til å avta med tumor utvikling [17] og en økt CD133 uttrykk ble rapportert i Dukes A i forhold til Dukes B og C tykktarm kreft [16]. Tidligere studier har rapportert at intensiteten av CD133 er cellesyklusavhengig og økt CD133-positive celler er korrelert med øket DNA-innhold, og alle disse resultatene er i overensstemmelse med den foreslåtte proteinets evne til å spesifikt identifisere tumor initiering av celler som er i forbindelse med den vekst av både primær og metastatisk sykdom [18] og dermed hovedsakelig involvert i de mest aktive faser av svulst utvikling.
Dette forskjellig CD133 uttrykk gjennom ulike stadier har også blitt foreslått av Shmelkov
et al
, som foreslått at i løpet av metastase, CD133 positive tumorceller generere CD133-negative celler, som er mer aggressive og også i stand til å initiere tumorer i nakne mus. Forfatterne rapporterte at 40% av metastatiske svulster i sin studie var CD133 negative [19].
I konklusjonen i denne studien av 100 stadium II tykktarmskreftpasienter, Stem Cell kvantifisering definert av CD133 og Nanog uttrykk har ingen sammenheng med RFS eller OS. Imidlertid ble en sammenheng med etablerte prognostiske patologiske faktorer funnet. Derfor våre resultater tyder på at cscs ikke kan spille en viktig rolle i tidlige faser av tykktarmskreft.
Takk
Vi takker legene Y Castro og ME Fernandez-Santos PhD, for å lese manuskriptet og gi nyttige råd og ideer. MA Gonzalez-Nicolas BSc En Acosta BSc bidratt med sine utmerkede teknisk bistand i å utføre farging eksperimenter på fosterets hjerne prøver for studiet av CD133 uttrykk, samt for nyttige kommentarer og nøyaktig tolkning.
