Abstract
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet, og ca 85% av tilfellene er ikke-små- celle lungekreft (NSCLC). Viktigere, nytt fremskritt i kreft forskning tyder på at å endre kreftcelle bioenergi kan gi en effektiv måte å målrette slike avanserte kreftceller som har fått mutasjoner i flere cellulære regulatorer. Denne studien tar sikte på å identifisere bioenergetiske forandringer i lungecancerceller ved direkte måling og sammenligning av nøkkel metabolske aktiviteter i et par av cellelinjer som representerer normale og NSCLC-celler som er utviklet fra den samme pasient. Vi fant at utbredelsen av oksygenforbruk og heme biosyntese ble intensivert i NSCLC celler. I tillegg er NSCLC-celler oppviste vesentlig økte nivåer i en rekke proteiner som fremmer heme syntese, opptak og funksjon. Disse proteinene inkluderer hastighetsbegrensende heme biosyntetiske enzymet ALAS, transportørproteiner HRG1 og HCP1 som er involvert i heme opptak, og ulike typer oksygen utnytte hemoproteins som cytoglobin og cytokrom. Flere typer menneskelige tumorxenotransplantater vises også økte nivåer av slike proteiner. Videre har vi funnet at å senke heme biosyntese og opptak, slik som å senke mitokondriell respirasjon, effektivt redusert oksygenforbruk, kreftcelle proliferasjon, migrering og kolonidannelse. I motsetning til dette, senking heme nedbrytningen ikke har en virkning på lungekreftceller. Disse resultatene viser at økt heme fluks og funksjon er en nøkkelfunksjon i NSCLC celler. Videre økt produksjon og levering av heme og oksygen utnytte hemoproteins i kreftceller vil føre til intensivert oksygenforbruk og cellenes energiproduksjon ved mitokondrie respirasjon, som ville drivstoff kreftcelle spredning og progresjon. Resultatene viser at inhibering av heme og respiratorisk funksjon effektivt kan stoppe progresjonen av lungekreftceller. Derfor forstå heme funksjon kan positivt påvirke forskningen på kreft biologi og therapeutics lunge
Citation. Hooda J, Cadinu D, Alam MM, Shah A, Cao TM, Sullivan LA, et al. (2013) Forbedret Heme Funksjon og mitokondrie respirasjon fremme utviklingen av lungekreft celler. PLoS ONE 8 (5): e63402. doi: 10,1371 /journal.pone.0063402
Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA
mottatt: 02.02.2013; Godkjent: 31 mars 2013; Publisert: 21. mai, 2013
Copyright: © 2013 Hooda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Cecil H. og Ida Grønne midler (LZ) og NCI SPORE P50CA70907 tilskuddet (RB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP har en økt etterspørsel etter næring, som gir celleenergi og metabolske byggeklosser. Økt metabolsk etterspørsel i tumorceller følger ofte endret metabolisme. På 1920-tallet, Otto Warburg vist at tumorcellene metaboliserer glukose og laktat generere på et høyere nivå til tross for tilstedeværelsen av nok oksygen, et fenomen som kalles den Warburg-effekten [1], [2]. Nyere undersøkelser har avdekket molekylære hendelser som ligger til grunn for mange metabolske endringer hos kreftceller [3] – [5]. For eksempel Anastasiou et al. [5] viste nylig at enzymet pyruvatkinase M2 (PKM2), som er den dominerende pyruvat kinase funnet i kreftceller, er avgjørende for å opprettholde cellulær redoks homeostase. Videre har nylige studier antyder at metabolske enzymer kan virke som tumor-suppressorer (f.eks fumarat hydratase og suksinat-dehydrogenase), eller onkogener (f.eks mutant isocitrat dehydrogenase 1 og 2) [6] – [8]. Disse nyere studier bekreftet at endret metabolisme er faktisk et kjennetegn på kreft, og foreslo at endringene i metabolismen i kreftceller er mye mer komplisert enn som ble foreslått i utgangspunktet.
Nyere studier vist at økt glycolytic flux i kreftceller er ikke avhengig av redusert oksygenforbruk eller mitokondriell respirasjon [9] – [11]. For eksempel, to separate studier [12], [13] har vist at mitokondriell respirasjon forsterkes i humane brystcancerceller. En annen studie viste at kreftceller kan opprettholde oksidativ fosforylering ved en redusert, men likevel betydelig hastighet, selv ved 1% oksygennivå [14]. Disse resultatene markere at mitokondrie respirasjon og funksjon er avgjørende for kreft celle metabolisme og bioenergi. Spesielt er heme en sentral faktor på mitokondriefunksjon og oksygen metabolisme [15], [16]. Heme spiller avgjørende roller i nesten alle prosesser som er involvert i oksygen metabolisme. Heme fungerer som en protese gruppe i hemoglobin, myoglobin og andre globins som transport eller lagre oksygen, i mitokondrie respiratoriske kjedekomplekser, i cytokrom P450s og andre oxygenases som bruker oksygen for biosyntetiske og nedbrytningsreaksjoner, og i andre enzymer som bruker eller avgifte oksygen slik som peroxidases og katalaser [15], [17]. Likeledes krever heme biosyntese oksygen som substrat, selv om Km av heme biosyntetiske enzymer for oksygen er meget lav [18]. Derfor er heme og oksygen tett knyttet sammen og avhengige av hverandre.
Her undersøker vi funksjonen til heme og mitokondrier i lungekreft utvikling. Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet i USA og over hele verden, og ca 85% av tilfellene er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [19], [20]. De fleste pasienter har lokalt avansert stadium III /IV tumorer ved presentasjonen [21]. Utnyttelse av metabolske sårbarheter kan gi effektive alternative strategier for å bekjempe kreft progresjon lunge. Vi preges derfor og sammenlignet oksygen metabolisme og heme funksjon i HBEC30KT og HCC4017 celler [22], [23]. Dette paret av cellelinjer representerer normale nonmalignant HBEC (HBEC30KT) og NSCLC (HCC4017) celler utviklet fra samme pasient. Vi sammenlignet metabolske og molekylære profiler av denne matchende par av cellelinjer dyrket under identiske betingelser. Vi var interessert i å avgjøre om og i hvilken grad oksygen metabolisme og heme nivåer endres, og hvis slike endringer bidra til opprettholdelse og spredning av lungekreft celler. Våre data indikerer at oksygenforbruk og heme syntese blir intensivert i betydelig grad i lungekreftceller, sammenlignet med normale celler. I tillegg er nivåene av proteiner involvert i intracellulær heme syntese og opptaket vesentlig øket i lungekreftceller. Videre er nivået av oksygen-anvendelse hemoproteins, slik som cytoglobin, ble dramatisk økt i kreftceller. Inhibering av heme eller mitokondriefunksjon fortrinnsvis undertrykkes oksygenforbruk, cancer celleproliferasjon, kolonidannelse og migrasjon. Disse resultatene viser at økt syntese av heme og hemoproteins i lungekreftceller resulterer i forsterket oksygenforbruk og mitokondriell respirasjon som brensel kreft celle utvikling.
Materialer og metoder
Lung Cell vedlikehold, behandling og Cell count
HBEC30KT og HCC4017 cellelinjer som representerer normale og NSCLC celler [22], [23] ble gitt av Dr. John Minna laboratorium (UTSW) som en gave. De ble utviklet fra den samme pasient, og ble opprettholdt i ACL4 supplert med 2% FBS under 5% CO
2 ved 37 ° C [23]. For behandling med inhibitoren av heme syntese, succinyl aceton, ble cellene dyrket i medium inneholdende heme-utarmet serum. Heme utarmet serum ble fremstilt som tidligere beskrevet [24]. For å måle effekten av reagensene på lunge celleproliferasjon, ble cellene sådd ut i 48-brønns plate ved en densitet på 10
3 celler /brønn. Etter dyrking i 24 timer ble cellene behandlet med 0,5 mM succinyl aceton eller med 10 uM karbonyl cyanid 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). Hver 24 timer etter behandling, antall levende celler ble talt ved hjelp av trypanblått flekker og en hemocytometer.
Måling av glukoseforbruk, oksygenforbruk og Heme Synthesis
For å måle glukose forbruk, celler (~90% konfluens) ble inkubert i 24 timer med friskt medium. Glukosenivået i kulturmediet ble målt ved anvendelse av glukose (GO) Assay kit (Sigma). Oksygenforbruk ble målt som tidligere beskrevet [25]. Kort sagt ble celler med omtrent 80% sammenflyting trypsinisert og resuspendert i frisk, luftmettet medium. For hver måling, 10
6-celler (i 350 ul) ble innført i kammeret av et Oxygraph system (Hansatech Instruments), med en Clark-elektrode plassert på bunnen av luftkammeret. Under målingene ble termostatstyrt kammer ved 37 ° C med et sirkulerende vannbad. En elektromagnetisk rørestav ble anvendt for å blande innholdet i kammeret. Heme syntesehastigheten ble målt som beskrevet [24]. I korthet ble cellene behandlet med 0,5 mM succinyl aceton, eller 10 uM CCCP i 48 timer, og ble inkubert med 0,3 uCi [4-
14C] 5-aminolevulinsyre (PerkinElmer Life Sciences og analytiske) i 24 timer. Heme ble ekstrahert fra disse celler ved hjelp av aceton-saltsyre og dietyleter, og den mengde av radiomerket heme ble målt, som beskrevet [26]. Inkorporering av radioaktivitet inn i det ekstraherte heme tillater måling av heme biosyntese. Mengden av radiomerket heme ble målt ved scintillasjonstelling.
Real-time PCR kvantifisering og Påvisning av mtDNA
Oligonukleotidprimere for måling av transkripsjonsnivåer av gener ble konstruert ved å bruke Primer3 program ( https://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). β-aktin ble benyttet som en kontroll for den relative kvantifisering av transkripter. Total RNA ble ekstrahert fra ubehandlede celler eller behandlet med 0,5 mM succinyl aceton i heme-utarmet medium ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen). RNA ble renset ved bruk av RNeasy-sett (Qiagen). Revers transkripsjon og PCR ble utført i et enkelt trinn ved hjelp av LightCycler RNA Master SYBR grønn I-sett (Roche Applied Science) i henhold til fremstillingen protokoll. PCR ble utført ved anvendelse av en Roche LightCycler. Beregningene er utført ved hjelp av Roche LightCycler programvare. Primer sekvenser for real-time PCR var som følger: β-actin: fremover 5’CACAGGGGAGGTGATAGCAT -3 «, omvendt 5’CACGAAGGCTCATCATTCAA -3». ALAS1: videre 5′-CACACACCCCAGATGATGAA -3 «, omvendt 5’CCTGCAGAAGTTGCACTCAG -3». ALAS2: fremover 5’TGTCACCACCTATGCCTGAG -3 «, omvendt 5’GGCACACAACAAAGCAGAAG -3»
mtDNA ble målt og sammenlignet ved å tallfeste nivået av mitokondrie 16S rRNA-genet og atom GAPDH-genet, ved. ved hjelp av real-time PCR, som beskrevet tidligere [27]. Primersekvenser som ble brukt var som følger (5′-3 «): GAPDH: forover TTCAACAGCGACACCCACT, revers CCAGCCACTACCAGGAAAT. 16S rRNA: forover CCAAACCCACTCCACCTTAC, revers TCATCTTTCCCTTGCGGTA. Real-time PCR amplifisering ble utført ved hjelp av LightCycler Faststart DNA Master
PLUS SYBR Grønn Jeg kit (Roche Applied Science), i henhold til produksjon protokoll. Real-time PCR-amplifikasjon for hver prøve ble utført i tripletter. Data ble oppsamlet og analysert ved hjelp av LightCycler Software. Forholdet av mitokondriell (16 rRNA) vs. nukleær DNA (GAPDH) ble beregnet.
Fremstilling av proteinekstrakter, Western blotting og Immunofluorescence Mikros
HBEC30KT og HCC4017 celler ble behandlet, oppsamlet, og lysert ved hjelp av RIPA-buffer (Cell Signaling Technology) inneholdende protease inhibitor cocktail. Humane tumorxenografter ble opprettholdt, og lysater fra humane tumorxenografter ble fremstilt som beskrevet [28]. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av BCA analysen kit (Thermo Scientific). 50 ug proteiner fra hver behandling tilstand ble underkastet elektroforese på 9% SDS-polyakrylamid-geler, og deretter overført til Immuno-Blot PVDF-membran (Bio-Rad). Membranene ble probet med polyklonale antistoffer, etterfulgt av deteksjon med en kjemiluminescens Western blotting-sett (Roche Diagnostics). Signalene ble påvist ved hjelp av en Carestream bilde stasjon 4000mm Pro, og kvantifisering ble utført ved hjelp av Carestream molekylær avbildning programvareversjon 5.0.5.30 (Carestream Health, Inc.). Immunfluorescens farging ble utført ved å følge fremgangsmåten gitt av antistoffet produsenten. FITC og DAPI fluorescerende bildene ble tatt ved hjelp av en flerkanals Zeiss Axio Observer.Z1 fluorescerende mikroskop. Polyklonale anti-ALAS1, anti-HRG1, anti-cytokrom c, anti-cytoglobin, anti-CYP1B1, anti-Cox-2 og anti-HCP1 ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. Monoklonale anti-β-actin antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling Technology.
kolonidannelse og cellevandring Assays
For kolonidannelsesbestemmelsen ble HCC4017 cellene tellet og sådd ut ved en tetthet på 1000 celler per brønn på 6-brønners plater. Celler ble behandlet med eller uten 0,5 mM succinyl aceton, succinyl aceton + heme (10 uM), 10 uM karbonyl cyanid m-klorfenyl hydrazon (CCCP), eller 10 uM Tin protoporfyrin IX (SNPP). Medium ble oppdatert hver fjerde dag. Etter 10-12 dager ble cellene fiksert i 70% etanol, farget med 0,5% krystallfiolett. Bildene ble kjøpt ved hjelp av HP Scanjet 8270.
En in vitro scratch analyse ble brukt for å undersøke effekten av heme og heme mangel på HCC4017 celle migrasjon, som beskrevet [29]. I korthet HCC4017-celler ble behandlet med eller uten 0,5 mM succinyl aceton, succinyl aceton + heme (10 uM), eller 10 uM Tin protoporfyrin IX (SNPP) i 6 dager. Deretter ble cellene trypsinert og sådd ut på kulturskåler ved 95% konfluens. Monolagene ble skrapet med en 200 ul steril pipette og deretter vasket flere ganger med PBS for å fjerne celleavfall. Cellene ble så opprettholdt i de tilsvarende media, og migrering av cellene ble overvåket ved bruk av et mikroskop. Representative bildene ble tatt langs bunnen på ulike tidspunkter. Hver behandling ble utført i tre paralleller.
Resultater
NSCLC Cells Vis intensivert priser av oksygenforbruk
Vi målte og sammenlignet priser av glukose og oksygenforbruk i et matchet par de normalt, nonmalignant bronkial epitel (HBEC30KT) og NSCLC (HCC4017) celler [22], [23]. Tabell 1 viser at utbredelsen av både glukose og oksygenforbruk i HCC4017 celler ble forhøyet, med heving av oksygenforbruket nærmer seg 2,5 ganger (tabell 1). Men forholdet mellom mitokondrie DNA for å nukleært DNA, målt som beskrevet [30], var ikke forskjellig mellom de cellelinjer. Disse dataene antyder at mens mitokondrienes funksjon ikke blir forstyrret, er mitokondrielle respirasjonen vesentlig forbedret i NSCLC celler.
Den Valuta Heme biosyntese og uttrykket nivåer av Heme Biosyntetiske Enzymer er betydelig økt i lungekreftceller
Heme fungerer som en protese gruppe i mange proteiner og enzymer som transportere, lagre og bruke oksygen og kan direkte regulere mange prosesser som er involvert i oksygen metabolisme [15], [16]. Derfor tenkte vi at økt oksygenforbruk hos NSCLC celler kan skyldes økte nivåer av heme og hemoproteins. For å teste denne muligheten, må vi først målt og sammenlignet nivåene av heme-syntesen i NSCLC og normale celler. Vi fant at frekvensen av heme-syntesen ble økt betydelig de NSCLC HCC4017 cellene, i forhold til de normale HBEC30KT celler (Figur 1a). Den potent inhibitor av heme syntese, succinyl aceton (SA) [24], [31], hemmet heme syntese i NSCLC og normale celler, som forventet. Succinyl aceton har tidligere vist seg å være en spesifikk og potent inhibitor av heme-syntese i forskjellige celler som strekker seg fra HeLa-celler, PC12-celler til primærmuse neuronale celler [32] – [37]. Interessant, mitokondriene uncoupler CCCP (karbonyl cyanid meta-chlorophenylhydrazone) også reduserte frekvensen av heme syntese, om enn i mindre grad (figur 1A). CCCP frakobler oksidativ fosforylering med ATP generasjon i mitokondriene [38]. På grunn av at frekvensen av oksygenforbruk er meget høy, sammenlignet med hva som er nødvendig for heme biosyntese (tabell 1), er mengden av oksygen som brukes til heme biosyntese er ubetydelig [18].
normale HBEC30KT lunge epithelial (HBEC ) og NSCLC HCC4017 (HCC) celler ble dyrket, ble RNA og proteiner ut. Transkripsjonsnivåer ble påvist ved hjelp av kvantitativ sanntids RT-PCR, og proteinnivåer ble påvist ved hjelp av Western blotting. (A) Nivåene av heme biosyntese hos normale og NSCLC-celler. (B) Utskriften nivået av heme biosyntetiske enzymet ALAS1 i normale og NSCLC celler. (C) Utskriften nivået av heme biosyntetiske enzymet ALAS2 i normale og NSCLC celler. (D) Proteininnholdet av hem-biosyntetiske enzym ALAS1 i normale og NSCLC-celler. Proteininnholdet av β-aktin i prøvene ble anvendt for normalisering. For statistisk analyse, ble nivåene i kreftceller sammenlignet med nivåene i normale celler, ved hjelp Welch to-utvalgs t-test. *, P-verdi 0,05; **, P-verdi. 0,005
Deretter målte vi uttrykket nivået av ALAS1 (5-aminolevulinsyre syntase 1), som er det hastighetsbegrensende enzym for heme-syntesen i nonerythorid celler, inkludert lungeceller [39]. Vi opprinnelig målte ALAS1 transkripsjonsnivåer i NSCLC og normale celler ved hjelp av real time RT-PCR. Figur 1B viser at karakternivået til nonerythroid ALAS1 genet ble faktisk økt i kreftcellene. Som forventet fra tidligere studier [[40], [41] og referanser deri], inhibering av ALAS aktivitet ved succinyl aceton skyldes induksjon av ALAS1 i både kreft og normale celler, selv om graden av induksjon viste seg å være større i kreftceller. Erythroid-spesifikke ALAS2 genet er ikke tenkt å være uttrykt i normale lungeceller; Men data fra Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) foreslo at ALAS2 er uttrykt i 16% av lungekreft vev. Derfor har vi også målt ALAS2 karakternivået i lungeceller (figur 1C). Faktisk ble ALAS2 karakternivået økt i HCC4017 celler med nesten fem ganger. Succinvll aceton ikke har en målbar effekt på ALAS2 nivå, som forventet, fordi uttrykk for ALAS2, i motsetning ALAS1, er ikke regulert av heme nivå [40]. Vi bekreftet ytterligere økning av ALAS proteinnivå i kreft sammenlignet med normale celler. Figur 1D viser at ALAS1 proteinnivået ble betydelig forbedret i kreftcellene, og det ble ytterligere økt med succinyl aceton. Dette er i overensstemmelse med tidligere studier som viser at heme kan negativt regulere ALAS1 transkripsjonelt og posttranscriptionally [40], [41]. Vi var ikke i stand til å påvise ALAS2 protein, kanskje på grunn av det lave nivå i lungeceller. Selv om karakternivå oppdages i lungekreftceller, synes nivået å være betydelig lavere sammenlignet med ALAS1.
nivåene av heme opptak Proteiner HCP1 og HRG1 og Oksygen-bruk Hemoproteins er forhøyet hos lungekreftceller
for ytterligere å fastslå funksjonen av heme i NSCLC celler, vi sammenlignet nivåene av to heme transportører HCP1 (heme bærerprotein 1) og HRG1 (heme responsive gen 1) [42], [43]. De er uttrykt og involvert i heme opptak i en rekke ikke-polariserte celler [43] – [46]. Vi har funnet at nivåene av HCP1 og HRG1 ble dramatisk økt i HCC4017 celler, sammenlignet med normale celler (figur 2A og amp; 2B). Hemming av heme-syntesen av succinvll aceton påvirket ikke HCP1 og HRG1 nivåer, i samsvar med tidligere resultater i pattedyrceller [44].
Den normale HBEC30KT lunge epitel (HBEC) og NSCLC HCC4017 (HCC) celler ble dyrket og behandles som angitt. Proteinekstrakter ble fremstilt og ble påvist nivåene av HCP1 og HRG1 ved Western blotting. Proteininnholdet av β-aktin i prøvene ble anvendt for normalisering. (A) Proteininnholdet av heme transporter HCP1 i normale og NSCLC-celler. (B) Proteininnholdet av heme transporter HRG1 i normale og NSCLC-celler. For statistisk analyse, ble nivåene i kreftceller sammenlignet med nivåene i normale celler, ved hjelp Welch to-utvalgs t-test. **, P-verdi. 0,005
Økningen i heme opptak proteiner HCP1 og HRG1 kan gi ytterligere heme for produksjon av hemoproteins. Vi oppdaget derfor nivåer av flere hemoproteins som er involvert i transport og utnyttelse av oksygen. Cytoglobin er en hemoprotein uttrykt i fibroblaster og sannsynligvis letter oksygen transport og utnyttelse [47], [48]. I normale lunge epitelceller ble cytoglobin ikke oppdaget, men ble uttrykt robust i HCC4017 celler (figur 3A). Likeledes nivåene av tre andre hemoproteins involvert i oksygen utnyttelse, cytokrom c, CYP1B1 og Cox-2, ble også betydelig forbedret (Figur 3B-3D). Øyensynlig, mens nivåene av cytoglobin og cytokrom c ble redusert når intracellulær heme tilførsel ble senket ved å dyrke celler i heme-utarmet medium og ved behandling med hem-syntese inhibitor succinyl aceton, påvirket av heme nivåer, nivåer av CYP1B1 og Cox-2- var det ikke. Dette kan skyldes ulike mekanismer som styrer reguleringen av disse proteinene. Kanskje heme direkte regulerer ekspresjonen av cytoglobin og cytokrom c, mens en heme-uavhengig mekanisme bidrar til den økte nivåer av CYP1B1 og Cox-2 i kreftceller. Alternativt kan heme regulere ekspresjonen av CYP1B1 og Cox-2, men hem-regulerende konsentrasjon kan være mye lavere enn det for ekspresjon av cytoglobin og cytokrom c. Derfor kan den nedre heme nivå i succinvll aceton behandlede celler redusere nivåene av cytoglobin og cytokrom c, men ikke CYP1B1 og Cox-2.
Den normale HBEC30KT lunge epitel (HBEC) og NSCLC HCC4017 (HCC) cellene ble dyrket og behandlet som angitt. Proteinekstrakter ble fremstilt og ble påvist nivåene av hemoproteins ved Western blotting. Proteininnholdet av β-aktin ble benyttet for normalisering. (A) Proteininnholdet av cytoglobin i normale og NSCLC-celler. (B) Proteininnholdet av cytokrom c i normale og NSCLC-celler. (C) Proteininnholdet av CYP1B1 i normale og NSCLC-celler. (D) Proteininnholdet av COX-2 i normale og NSCLC-celler. For statistisk analyse, ble nivåene i kreftceller sammenlignet med nivåene i normale celler, ved hjelp Welch to-utvalgs t-test. *, P-verdi 0,05; **, P-verdi. 0,005
Effekten av å redusere intracellulær heme forsyningen på disse proteinene kan også observeres ved hjelp av immunfluorescens farging. For eksempel, viser figur 4A at ALAS1 oppviste en mitokondriell lokaliseringsmønster, særlig når nivået ble forbedret i celler behandlet med succinyl aceton. Når bakgrunnen fluorescens var lav i panelet SA (figur 4A), FITC fluorescens klart colocalized med fluorescens fra MitoTracker, og mitokondrie mønsteret var mye klarere. Mønsteret i panelet Ingen er mindre klart, sannsynligvis på grunn av bakgrunnen fluorescens forårsaket av lavere nivå av ALAS1 og bakgrunn antistoff farging. Figur 4B viser at cytokrom c oppviste en mitokondriell lokalisering mønster, men nivået ble redusert i celler behandlet med succinyl aceton, og dens lokalisering mitokondrielle ble også svekket. Resultatene fra indirekte immunfluorescens farging er i overensstemmelse med resultatene fra Western blotting. Sammen viser disse resultatene at forbedret heme syntese og opptak er assosiert med økt produksjon av en rekke oksygen anvendelse hemoproteins i kreftceller.
NSCLC HCC4017 (HCC) celler ble dyrket i vanlig medium (ingen) eller i heme- utarmet medium inneholdende 0,5 mM succinyl aceton (SA). Celler ble farget først med anti-ALAS1 eller anti-cytokrom c-antistoffer, og deretter med FITC-konjugert geit anti-kanin sekundært antistoff, MitoTracker, samt DAPI. FITC, MitoTracker og DAPI fluorescerende bildene ble tatt og er vist her. Målestokken viser 10 mikrometer.
nivåene av Heme Biosyntetiske Enzyme ALAS, Heme opptak Proteiner HCP1 og HRG1, og Oksygen-bruk Hemoproteins er økt i ulike menneskerettighets tumorxenotransplantater
for å avgjøre om økningen i det hastighetsbegrensende heme biosyntetiske enzymet ALAS, heme opptak proteiner, og ulike oksygen utnytte hemoproteins oppstår i lungesvulster, vi evaluert nivåene av disse proteinene i fem forskjellige mennesker tumorxenotransplantater (figur 5). Figur 5A viser at i alle xenograft tumorer, ble ALAS1 proteinet som blir uttrykt på nivåer sammenlignbare med det i HCC4017 celler, men vesentlig høyere enn i de normale HBEC30KT-celler (se figur 1D). Likeledes, ble nivåene av heme transportører HCP1 (figur 5B) og HRG1 (figur 5C) forhøyet i de xenograft tumorer. Nivåene av heme-inneholdende, oksygenbindende proteiner cytoglobin (figur 5D) og cytokrom P450 CYP1B1 (figur 5E) ble også forbedret i tumorene. Disse resultater viser at forbedret heme syntese, opptak og syntese av oksygen anvendelse hemoproteins forekomme i forskjellige lungeceller og tumorer.
Lysater fra de angitte humane tumorxenografter ble fremstilt, og nivåene av de angitte proteiner ble detektert ved Western blotting. Proteininnholdet av β-aktin ble benyttet for normalisering. (A) Proteininnholdet av ALAS1 i HCC4017 celler og i forskjellige humane tumorxenografter. (B) Proteininnholdet av HCP1 i HCC4017 celler og i forskjellige humane tumorxenografter. (C) Proteininnholdet av HRG1 i HCC4017 celler og i forskjellige humane tumorxenografter. (D) Proteininnholdet av cytoglobin i HCC4017 celler og i forskjellige humane tumorxenografter. (E) Proteininnholdet av CYP1B1 i HCC4017 celler og i forskjellige humane tumorxenografter. For statistisk analyse, ble nivåene i HCC4017 celler og svulster sammenlignet med nivåene i normale celler, ved hjelp Welch to-utvalgs t-test. *, P-verdi 0,05; **, P-verdi. 0,005
Redusere Heme tilgjengelighet til NSCLC Cells Fortrinnsvis Undertrykker oksygenforbruk
Økt syntese av oksygen utnytte hemoproteins sannsynlig kan bidra til skjerpet oksygenforbruk i kreft celler. For å teste denne ideen, undersøkte vi effekten av tappe heme på oksygenforbruk rate i kreft og normal lungeceller. Vi fant at oksygenforbruket i NSCLC-celler ble selektivt redusert når cellene ble dyrket i heme-utarmet medium (se Figur 6, HD). I motsetning til dette ble heme uttømming i mediet ikke påvirke oksygenforbruk i normale celler. Inhibering av endogen syntese av heme succinyl aceton (HD + SA, figur 6) ytterligere redusert oksygenforbruk i kreftceller til et nivå lik nivået i celler behandlet med den mitokondrielle uncoupler CCCP. Succinyl aceton hadde en mindre effekt på de normale celler så vel (figur 6). Øyensynlig, hemming av hem oksygenase, det enzym som er involvert i heme degradering, ved Tin protoporfyrin (SNPP, figur 6) fortrinnsvis ikke påvirke kreftceller. Spesielt, disse behandlingene har de samme effekter på lungekarsinom A549-celler (ikke vist). Disse resultatene viser at god tilgang på heme er avgjørende for å opprettholde oksygenforbruk hos NSCLC celler på en høyere rente enn i normale celler. De sterkeste at forbedret heme syntese og opptak er nødvendig for økt oksygenforbruk hos NSCLC celler.
Den normale HBEC30KT lunge epitel (HBEC) og NSCLC HCC4017 (HCC) celler ble dyrket og behandlet i normal medium (Ingen) i medium med heme utarmet (HD), i medium med heme og utarmet succinyl aceton (HD + SA), og i medium med CCCP. Celler ble samlet inn og oksygen forbruk priser ble oppdaget og plottet her. De plottede verdiene var gjennomsnittsverdier fra minst tre forsøk. For statistisk analyse, ble nivåene i kreftceller sammenlignet med nivåene i normale celler, ved hjelp Welch to-utvalgs t-test. *, P-verdi 0,05; **, P-verdi. 0,005
Hemming av Heme Syntese og mitokondrienes funksjon Sterkt Undertrykker NSCLC Cell Proliferation, Colony Forming og migrasjon
For å evaluere effekten av å hemme heme syntese og mitokondrienes funksjon på kreftcelle spredning og funksjon, undersøkte vi lungekreft vekst, kolonidannelse og migrasjon. Figur 7A viser at inhibering av heme syntese avbrutt veksten av kreftceller HCC4017 mer alvorlig enn de normale HBEC30KT celler. Likeledes mitokondrie uncoupler CCCP avbrutt HCC4017 cellevekst mer alvorlig enn HBEC30KT celler (figur 7a). I motsetning til dette, har inhibering av heme nedbrytning ved SNPP ikke selektivt å påvirke HCC4017 celleproliferasjon. De samme effektene ble observert når vi målte HCC4017 kolonidannelse. Som vist i figur 7B, både succinyl aceton og CCCP fullstendig stoppet cancercellekolonidannelse. Tilsetning av heme reversert i stor grad effekten av inhibering av heme syntese. Som ventet gjorde hemming av heme nedbrytning av Tin protoporfyrin IX (SNPP) ikke vesentlig påvirke kreftcelle kolonidannelse. Videre undersøkte vi effekten av inhibering av heme biosyntese og opptak på HCC4017 cellemigrering. HCC4017 cellemigrasjon ble vesentlig hemmet i medium med heme utarmet og med succinvll aceton (figur 7C). Tilsetting av heme reverserer hemming på migrasjon. Vi har også forsøkt å undersøke effekten av å slå ned heme biosyntetiske enzymer i lungekreftceller ved hjelp av shRNAs som ble brukt til å slå ned heme-biosyntese i HeLa-celler [33]. Men vi var ikke i stand til å oppnå kloner som viser lavere nivåer av heme biosyntese, sannsynligvis fordi de HCC4017 cellene har en økt etterspørsel etter høyere nivåer av heme, senke heme biosyntese ville redusere deres overlevelse. Disse resultatene viser at inhibering av heme tilgjengelighet og funksjon reduserer kreftcelleformering, kolonidannelsen, og migrasjon betydelig.
Celler ble behandlet med succinyl aceton ble også opprettholdt i heme-utarmet medium. (A) Reduksjon av heme tilgjengelighet eller mitokondriefunksjon fortrinnsvis reduserer NSCLC cancer celleproliferasjon. % levende celler ble beregnet ved å dividere antall av behandlede celler med antall ubehandlede celler (sådd med det samme antall celler). Det viser de relative proliferative priser av behandlede celler (SA eller SNPP) vs. ubehandlede celler (ingen). (B) Redusere heme tilgjengelighet eller mitokondrienes funksjon fortrinnsvis reduserer NSCLC celle kolonidannelse. (C) Redusere heme tilgjengelighet fortrinnsvis reduserer NSCLC celle migrasjon.
