Abstract
I kreftceller, trinnvis onkogene deregulering av signalkaskader induserer endringer av cellulær morfologi og fremmer kjøp av maligne egenskaper. Her har vi identifisert et sett av 21 gener, inkludert
FGF9
, som determinanter for svulst celle morfologi av et RNA-interferens fenotypiske skjermen i SW480 tykktarmskreftceller. Ved hjelp av et panel av små molekylære hemmere, vi etablerte senere fenotypiske effekter, nedstrøms signalkaskader, og tilknyttede genekspresjonssignaturer av FGF reseptor signaler. Vi har funnet at inhibering av FGF-signaler induserer epitelial celle adhesjon og tap av motilitet i kolon kreftceller. Disse effektene formidles via mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) og Rho GTPase kaskader. Etter avtale med disse funnene, hemming av MEK1 /2 eller JNK kaskader, men ikke av PI3K-AKT signal aksen også induserte epitelceller morfologi. Til slutt fant vi ut at uttrykk for
FGF9
var sterk i en undergruppe av avanserte tykktarm kreft, og overekspresjon negativt korrelert med pasientenes overlevelse. Vår funksjonell og uttrykk analyser tyder på at FGF reseptor signaler kan bidra til tykktarmskreft progresjon
Citation. Leushacke M, Spörle R, Bernemann C, Brouwer-Lehmitz A, Fritzmann J, Theis M, et al. (2011) En RNA interferens Fenotypisk Screen Identifiserer en rolle for FGF Signaler i Colon Cancer Progresjon. PLoS ONE 6 (8): e23381. doi: 10,1371 /journal.pone.0023381
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 25 februar 2011; Godkjent: 15 juli 2011; Publisert: 11 august 2011
Copyright: © 2011 Leushacke et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Deler av arbeidet ble finansiert av den tyske Bundesministerium für Bildung und Forschung (gi NGFN2 01GR0405 til BGH, og gir PKT-01GS08111-5 og PKM-01GS08105-8 til BGH og MM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Sene trinn av tumorprogresjon kan resultere i. metastatisk spredning av kreftceller, som har mistet epiteliale egenskaper og ervervet trekkende og invasive evner. Morfologisk ligner denne fenotypisk bryteren omdannelsen av stasjonære epitelceller til trekk mesenchymale celler under embryonal utvikling, og derfor alle disse prosessene er ofte betegnet epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) [1], [2], [3], [4], [5]. Viktige trinn i utviklings og tumor-assosiert EMT er tap av E-cadherin-baserte celle adhesjon (ved epigenetisk stanse eller transcriptional undertrykkelse av
CDH1
, koding for E-cadherin), omorganisering av cytoskjelettet fører til endret celle morfologi, og induksjon av mesenchymale-spesifikk genekspresjon, slik som aktivering av
FN1
og
VIM product: [6], [7], [8], [9], [10], [11]. I embryo, oppstår EMT i en ordnet og reproduserbar måte. I tumorceller kan imidlertid EMT-lignende fenomener være forbigående, kaotisk og ufullstendig.
i embryoet blir EMT indusert ved koordinert aktivering av signalveier, mens i tumorceller fullstendig eller delvis EMT kan utløses av de kombinerte aktiviteter onkogene mutasjoner og vekstfaktor-signaler mottatt fra inne i tumorcellemikromiljøet. Likevel rollene viktige signalveier og molekyler ser ut til å bli konservert. For eksempel er β-catenin som kreves for den første embryoniske EMT som fører til dannelsen av det primitive strek og mesoderm [12], mens i colon carcinoma og andre tumorer β-catenin transduces nøkkelsignaler på invasiv foran, fører til tap av tumorcelle adhesjon, induksjon av celle-motilitet og metastase [13], [14], [15]. Flere reseptor-tyrosin-kinaser (RTK) er blitt implisert i begge, utviklingsmessige og tumor-assosiert EMT. I embryoutvikling, er avgjørende for migrering av muskel progenitorceller spredningsfaktor /hepatocytt-vekstfaktor-reseptor-MET, er epidermal vekstfaktor (EGF) reseptor som er nødvendig for epitelisk morfogenese [16], [17], [18], og den fibroblast vekstfaktor (FGF) reseptoren Fgfr1 og dens ligand Fgf8 er essensielle for cellemigrering gjennom primitive strek og mesoderm formasjon [19], [20]. I tumorer, kan unphysiological signalering gjennom RTK’er slik som MET, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) reseptoren, og de EGF og FGF-reseptorer være forbundet med progresjon og metastase [21], [22]. Viktigere, EGF og VEGF-reseptorer er mål for rasjonell behandling av avansert kreft i tykktarmen [23].
mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) veier, slik som den Jun-N-terminal-kinase (JNK) og av mitogen-aktivert protein kinase kinase /ekstracellulære regulerte kinase (MEK /ERK) trasé, integrerer signaler fra flere RTK’er å kontrollere celleproliferasjon, celle motilitet og andre cellulære egenskaper [24]. Onkogene mutasjoner i gener som koder for signal transdusere som stafett signaler fra RTK å MAPK trasé som
KRAS
eller
BRAF
kan bevisstsignalering via MEK /ERK sti i tumorer, og slike mutasjoner ugyldig terapeutisk intervensjonsstrategier på oppstrøms RTK reseptorer [25]. Begge deler, i løpet av utvikling og i tumorer, EMT signaler er ofte integrert av transkripsjonelle repressorer av
CDH1
, slik som sneglen, Snail2, Twist og andre, som således spiller en viktig rolle i kontrollen av cellemorfologi og tumorprogresjon [ ,,,0],9], [10], [26].
Her tok vi nytte av den molekylære likheten mellom utviklings og tumor-assosiert EMT å identifisere nye kandidatgener involvert i tykktarm kreft progresjon. I et RNA interferens skjermen identifiserte vi flere gener som inaktive fremmet en epitelial fenotype og E-cadherin-mediert celle adhesjon i SW480 tykktarmskreftceller. Mange av genene identifisert koden for komponenter av viktige signalveier, slik som Wnt, Hedgehog og RTK trasé, for eksempel
FGF9
,
PTCH1
,
GLI2
,
GLI3 Hotell og
TCF7L1
. Ved hjelp av identifisering av
FGF9
som bly, fant vi ut at FGFr signaler spille roller i tap av tykktarmskreft celle adhesjon og induksjon av cellemotilitet. Å formidle disse effektene, FGFr signaler modulere MEK /ERK kaskade og Rho GTPases. Våre resultater således identifisere FGFR signaler som viktige determinanter av MEK /ERK-kaskade aktivitet i SW480 kolon kreftceller, selv i nærvær av en onkogen mutasjon KRAS. Vi fant ut at
FGF9
ble uttrykt i tykktarm kreft og uttrykk nivåer korrelerer med pasientens overlevelse, noe som tyder på en funksjonell rolle i kreft.
Resultater
En RNAi forstyrrelser fenotypiske skjermen for gener som regulerer kolon tumorprogresjon
Invasive vekst og metastasering av svulster innebærer tap av epitelial celle adhesjon og gevinst på cellemotilitet. Vi antok at gener hvis produkter spiller roller i tumorprogresjon kan anrikes blant dem som er uttrykt i kaudal enden av midten av svangerskapet mus embryo, et sted hvor epitelceller gjennomgå utviklings EMT, dvs. en fenotypisk bryter til en mesenchymale tilstand av lav celleadhesjon og høy cellemotilitet. Vi brukte derfor MAMEP database (https://mamep.molgen.mpg.de) og litteratursøk å kompilere en liste av gener uttrykkes fortrinnsvis i kaudal slutten av midten av svangerskapet (E9.5) embryo, og identifisert sitt menneskelige homologer. Deretter rettet vi disse genene benytter esiRNAs [27] i SW480 human tykktarm kreft celler, som viser en mesenchymale ( «spindel-form») morfologi, er bevegelig og har liten celle adhesjon. Vi undersøkt for gener hvis inaktivering fremmes epitel ( «Cobblestone») cellemorfologi og lokalisering av epiteliale celleadhesjonsmolekyl E-cadherin til celle-celle-kontakter (fig. 1A). Ut fra 364 gener vist, stanse av 18 kandidater induserte epitel-morfologi sammenlignes med interferens med henvisning
BCL9L
, som er en transkripsjons ko-aktivator av β-catenin [28]. Vi har også funnet tre gener som inaktive fremmet en mer spindel-skjema celle morfologi. I kontrast, gjorde kontroll-transfekterte celler ikke vise konsistente morfologiske endringer (figur 1B,. For interferens effekt, se figur S1,. For en fullstendig liste over målrettede gener og positive, se tabell S1 og tabell 1, henholdsvis)
.
En Skjematisk oversikt over skjermen: gener ble valgt ved screening av MAMEP database (https://mamep.molgen.mpg.de) for gener som displayet caudally begrenset uttrykk i mus embryo og litteratursøk. Eksempel bilder av en slik genuttrykksmønster vises på toppen av flytskjema. Menneske homologer ble inaktivert av RNA interferens i SW480 celler. Positive gener ble identifisert ved deres evne til å fremme epitelial celle morfologi. B E-cadherin distribusjon og morfologi SW480 celler transfektert med esiRNA mot ildflue luciferase (
Fluc
, negativ kontroll),
BCL9L plakater (positiv kontroll) og flere positive gener. Gener som er merket med (*) induserte en mer spindel-skjema morfologi. Skala barer representerer 50 mikrometer. For en full liste av gener målrettet i skjermen, se tabell S1. For en full liste av gener som scoret positivt, se tabell 1.
Mange av de identifiserte gener spiller kjente roller i kontrollen av signalveier som regulerer embryoutvikling, orgel homeostase, og tumor progresjon. Vi fant
TCF7L1
, som koder for en transkripsjonsfaktor nedstrøms av Wnt /β-catenin signalkaskade [29], så vel som Wnt /β-catenin signaleringskomponenter
SFRP1
og
CSNK2A1
. Vi har også isolert
PTCH1
,
GLI2
, og
GLI3
, som koder for komponenter av Hedgehog signalveien [30]. Vi fant
FGF9 Hotell og
EPHA4
, koding for en RTK ligand og en RTK av Efrin familien regulerer celle adhesjon og cytoskjelettet via MAPK og Rho [31], [32]. Kandidaten genet
TAX1BP3
kan også ha roller i regulering av Rho signaler [33]. Blant flere gener involvert i regulering av transkripsjon, har vi funnet
SIX1
, som koder for en transkripsjonsfaktor homeobox implisert i celledifferensiering og tumorprogresjon [34], [35] (fig. 2).
Gene symboler positive er gitt i svarte bokstaver, tilhørende nøkkel sti komponenter er gitt i grå bokstaver, vises i fargede sirkler og bestilt av cellerommet. Blå: Wnt vei, Grønn: Hedgehog vei, Cyan: RTK veier. Gener ble tildelt trasé ved hjelp av litteratur, Gene ontologi og andre søk i databaser. Sentrale referanser er gitt i hovedteksten.
FGF signaler regulere heft og motilitet av kolon kreftceller
Siden vi identifisert
FGF9
i vår mobilskjermen og funnet uttrykk for FGF9 i tarm maligniteter av både mus og mennesker (se nedenfor), fokuserte vi på rollene til FGF signaler i colon carcinoma celler. Først fikk vi bekreftet at screening resultat ved hjelp av en uavhengig
FGF9
siRNA forberedelse, som likeledes indusert en epitelial fenotype i SW480, jeg. e. ført til et tap av spindelformede celler og en økning i membranseptum E-cadherin farging (fig. S2). I et annet tykktarmskreft cellelinje, HCT116, stanse av
FGF9
hadde tilsynelatende ingen effekt. Men når vi målrettet
FGFR3
, koding for en høy affinitet reseptor av FGF9 og andre FGF, fant vi at det fremmes epitelcelledifferensiering morfologi i HCT116 (fig. S2). Disse funnene tyder på at FGF-reseptor signaler kan vanligvis ha roller i kontrollen av tykktarmskreft cellemorfologi, og at ulike spredningsveier komponenter kan være begrensende på de forskjellige cellelinjer.
Deretter vi rettet mot FGF-reseptorer ved hjelp av de små molekyl hemmer SU5402 [36], og vurderes endringer i den cellulære fenotype. Etter avtale med våre RNA interferens data, hemming av FGF-reseptorer fremmet epitelial morfologi SW480 celler og bød E-cadherin og β-catenin til celle-celle kontakter, noe som indikerer
de-novo
montering av epiteliale adherens veikryss (Fig . 3A). Lignende effekter ble observert på morfologien av SW620-celler, som er utledet fra den samme pasient, og på HT29 og HCT116-celler, som er avledet fra andre pasienter (fig. S3).
A Fenotypisk bryter av SW480-celler på FGF reseptor hemming av SU5402. Topp til bunn: Cell morfologi i sterkt felt, farging av E-cadherin og β-catenin. Bilder ble tatt 72 timer etter start av SU5402 behandling. Nedenfor: SW480 cellene får FGF signaler, som kan bli blokkert av SU5402. B Ripe sår motilitet analyse på FGF reseptor hemming. SW480-celler ble dyrket til konfluens, og riper ble indusert 24 timer etter starten av behandlingen. Bright felt bilder av bunnen kanten ble tatt 24, 48 og 72 timer etter riper. Skala barer i A og B representerer 50 mikrometer. C, D Farging av scratch kanten. C Farging av aktin og mikrotubuli cytoskjelettet i kontroll og SU5402-behandlede celler. Grønn: aktin (phalloidin); gul: tubulin; blå: atomkjerner (DAPI); piler: områder med tett samlings heft i bevegelige kontrollceller; pilspisser: forbedret kortikale aktin flekker i SU5402-behandlede celler. D RhoA omfordeling i migrerende celler, som er redusert i inhibitor-behandlede celler. Grønn: aktin; red: RhoA; blå: kjerner. grå pilspisser markere atom RhoA. Stiplet linje markerer bunnen kant. Skala barer i C og D representerer 25 mikrometer. E Kvantifisering av spredning i kontroll og SU5402-behandlede celler. For tids løpet av spredning, ble cellene sådd ut i replikat, og dobbeltprøver ble talt bi-daglig i et Neubauer hematocytometer.
Cell heft og cellemotilitet er ofte omvendt korrelert i tumorceller. Vi har derfor også vurdert cellemotilitet. Kontroll SW480 celler raskt migrert, mens SU5402-behandlede celler kan ikke lenger lukke en ripe såret (fig. 3B). FGF reseptor-inhiberte celler på bunnen av kanten som vises øket farging av kortikal aktin og redusert antall av kontaktheft kontakter, som indikerer endret dynamikken av cytoskjelettet (Fig. 3C). Videre Rho GTPases, som er viktige effektorer av balansen mellom celle adhesjon og motilitet [37], opptrådte lokalisert til atom flekker i SW480 celler invaderer grunnen av, og ble redusert i inhibitor-behandlede SW480-celler (Fig. 3D). Celleproliferasjon ble bare mildt rammet av FGF reseptor hemming (Fig. 3E). Vi så lignende effekter på cellemorfologi og motilitet ved hjelp av et strukturelt ikke-relaterte lite molekyl inhibitor av FGF-reseptorer, PD173074 (data ikke vist). Disse resultatene indikerer at FGF reseptor-signaler kan spille viktige roller i overgangen fra en stasjonær til en trekkfugl fenotype, som er et kjennetegn på slutten av trinnene i intestinal tumor progresjon som resulterer i metastasering.
FGF signaler i tykktarm kreft celler overføres via MAPK veien og Rho
FGF-reseptor signaler er kjent for å bli overført via MAPK kaskader og via phosphoinositid-3-kinase (PI3K) /AKT signalkaskade [38]. Vi analyserte derfor aktiviteten av viktige cellulære signal transdusere etter hemming av FGF-reseptorer eller taste nedstrøms signal transdusere, det vil si U0126, hemme MEK1 /2 kinaser av den klassiske MEK /ERK MAPK-kaskaden, SP600125, en inhibitor av den alternative JNK kaskade og LY294002 , en inhibitor av PI3K signaltransduksjon. Som forventet, inhibering av MEK1 /2 avskaffet fosforylering av ERK1 /2, og hemming av PI3K avskaffet fosforylering av AKT. Ved FGF reseptor hemming, fant vi en begrenset, men reproduserbar reduksjon av ERK1 /2 fosforylering (ca 30%). I motsetning til dette ble aktiviteten av P85-PI3K ikke påvirket. Endringer i fosforylering av AKT indikert at ytterligere signaloverføringsnett er modulert direkte eller indirekte ved å hemme FGF-reseptorer eller JNK (fig. 4A, B).
A Analyse av fosfo-ERK1 /2, fosfo-P85PI3K og fosfo-AKT i SW480-celler etter behandling med DMSO (løsningsmiddelkontroll), SU5402 (inhibering FGFR), U0126 (inhibering MEK1 /2-avhengig ERK1 /2 fosforylering), SP600125 (inhibering av JNK), og Ly294002 (inhibering av PI3K-mediert AKT-fosforylering) er vist. Histone H3 er vist som lasting kontroll. Fosforylering status ble vurdert 40 minutter etter hemmer behandling. B Kvantifisering av ERK1 /2 fosforylering, gjennomsnittet av tre forsøk. C morfologi, E-cadherin immunfluorescens og cellemotilitet av SW480 celler etter 72 timer av inhibitor behandling. Hemming av den klassiske MAPK eller alternative MAPK /JNK kaskader induserte en lignende fenotype som FGFR hemming i SW480 celler, wheras hemming av PI3K eller AKT hadde ingen slik effekt. Vi fant at PI3K inhibering, men ikke AKT inhibering, inhiberer celle motilitet. Frakobling av PI3K og AKT signaler har blitt observert før i tumorer [56]. Scratch-analysen ble utført som i fig. 3B. Skala barer representerer 50 mikrometer. D Inhibering av FGF-reseptorer eller MEK1 /2 fører til redusert Rho-aktivitet. Rho GTPase lasting analyser ble utført i SW480-celler 5 min etter serumstimulering i nærvær eller fravær av SU5402 eller UO126. N.d .: ikke bestemt.
Vi neste testet fenotypiske effekter av hemming av nedstrøms kaskader. Behandling av SW480-celler med U0126 (inhibering av MEK1 /2) eller med SP600125 (inhibering av JNK) understøttet dannelse av epitel-celle adhesjon komplekser, og blokkerte celle motilitet, i likhet med effektene som ses etter hemming av FGF reseptor-signaler (Fig. 4C, fig. S4). I motsetning til fenotyper som ble observert etter behandling med LY294002 (inhibering PI3K) eller Calbiochem AKT-inhibitor var ikke sammenlignes med effektene som ses etter FGF-reseptor-inhibering (fig. 4C). En lignende korrelasjon av cellulære fenotyper ved inhibering av signaleringsknutepunkter ble observert i HCT116-celler, som imidlertid ikke viser modulering av E-cadherin lokalisering under noen betingelser (Fig. S5, se også fig. S2). Oppsummert indikerer disse resultatene at FGFR signaler modulere aktiviteten til MEK /ERK-signalkaskade i SW480-celler, og at aktiviteten av FGFR, MEK1 /2 og JNK er nødvendige for opprettholdelsen av en fenotype som favoriserer celle motilitet i løpet av celleadhesjon.
Siden vi observerte re-lokalisering av Rho i bevegelige SW480 celler (se ovenfor, fig. 3D), bestemt vi virkningen av FGFR eller MEK1 /2 signaler på Rho aktivitet, ved hjelp av Rho laste analyser. For dette, vi serum-sultet SW480 celler i 24 timer, og vurdert Rho aktivering etter serum re-stimulering. Tilsetning av serum førte til rask induksjon av aktiv Rho-GTP i kontrollceller, mens Rho-aktivering ble kompromittert i nærvær av FGF-reseptoren eller MEK1 /2-inhibitorer (fig. 4D). Dette resultatet tyder på at i SW480 celler FGF-reseptorer og MEK1 /2 spille roller i regulering av Rho GTPases, som er sentral i modulering av cytoskjelettet.
FGFr og MAPK signaler er forbundet med spesifikke genekspresjonssignaturer
for å isolere genekspresjonssignaturer relatert til FGFr signaler og cellemotilitet i tykktarm kreft celler, sammenlignet vi genuttrykk profiler av løsemiddel kontroll og inhibitor-behandlede SW480 celler. Vi først brukt funksjonell gruppering av gener deregulerte mellom kontroll (DMSO-behandlet) og SU5402-behandlede celler ved hjelp av oppfinnsomhet pathway analyse (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Blant de signalnettverk sterkest berørt, identifiserte vi en klynge av deregulerte gener relatert til cellemotilitet som fokuserer på ERK1 /2-avhengige MAPK vei, bekreftende våre tidligere resultater (Fig. S6). Antatt nettverk inneholder sentrale signal transdusere av motilitet signaler som
ERK1 Twitter /2 og
PTK2 plakater (brennvidde heft kinase), og konvergerer på transkripsjonsfaktorer
juni Twitter /
JUNB Hotell og
FOSL1
. Viktigere,
FOSL1
har tidligere blitt identifisert som en nøkkel transkripsjonsfaktor i kontrollen av tumor cellemotilitet [39].
Neste, vi sammenlignet DMSO-behandlet og PI3K-inhibitor-behandlede SW480 celler (viser mesenchymale «spindel-formen» morfologi og svak celleadhesjon) med FGFR-inhibitor-, MEK1 /2-inhibitor og JNK-inhibitor-behandlede celler (som viser epitelial «brostein» morfologi og sterk celleadhesjon, se også fig. 4C). Vi brukte selvorganiserende kart for å identifisere grupper av gener hvis uttrykk er assosiert med disse forskjellige morfologi, og identifisert 29 gener som ble assosiert med sterk celle adhesjon og 23 gener assosiert med svak celle adhesjon. Signatur gener av SW480 celler som har sterk celle adhesjon var
RAP1GAP
, som er involvert i monteringen av adherens veikryss og
CLDN1
, en komponent av adherens veikryss, som gir bevis for at epitelceller vedheft er reguleres i det minste delvis på det transkripsjonelle nivå. Vi fant også forbedret uttrykk for transkripsjonsfaktorgener
ELF3 Hotell og
HMGCS2
, som spiller funksjonelle roller i epitelial differensiering [40], [41], tumordempere
SYK
og
TFAP2C Hotell og Rho regulator
ARHGEF37
. Signatur gener av SW480 celler som har svak celle adhesjon og mesenchymale morfologi ble beriket for gener som har blitt tildelt onkogene aktivitet, nemlig
EDN1
,
IGFBP7
,
MCM5
,
MFI2 Hotell og
TNFAIP8
. Til slutt har vi også funnet
TAX1BP3
, som vi ovenfor isolert i vårt fenotypisk esiRNA skjerm, noe som tyder på en funksjonell rolle for dette gen i reguleringen av adhesjon og motilitet (Fig. 5A) [33]. Vi har observert et lignende mønster av genregulering ved FGF-reseptor-inhibering i HCT116 tykktarmskreftceller (som viste tap av spindelen formen ved
FGFR3
RNA interferens eller FGF-reseptor-inhibering, se fig. S2, S3), impliserer en konservert rollen til dette genet klynge nedstrøms av FGF-reseptorer (fig. S7).
A-B Microarray analyse av SW480 etter små molekylære hemming av FGFR, MEK1 /2, JNK eller PI3K. Gjennomsnittlig uttrykk for tredoble eksperimenter vises. Red: Høy uttrykk; Blå: lav uttrykk Hvit: Median uttrykk på tvers av alle profiler Grey: Gener med ingen eller marginal uttrykk En Klynger av gener som har aktivitet korrelerer med epiteliale og mesenkymale fenotyper. Den følgende prosedyre ble anvendt for å identifisere disse genene: For det første, gener deregulert mer enn 1.3fold (p 0,01) etter SU5402 behandling sammenlignet med kontroll (DMSO) ble isolert. For det andre, ble disse genene gruppert i selvorganiserende kart, og tre klynger som korrelerte med fenotype ble valgt. Gener ble bestilt av fold-endring uttrykk etter FGFR hemming. B Vurdering av viktige gener involvert i EMT eller stemness. C Kvantitativ Real-time PCR-analyse av
SNAI2 Hotell og
CDH1
etter SU5402 (FGFR hemmer) behandling. Expression ble normalisert til løsemiddelkontrollprøver.
Når vi vurderte uttrykk for viktige modulatorer av EMT, så vi en liten, om enn ikke signifikant, variasjon i uttrykket av
CDH1
, noe som indikerer at de mer drastiske endringer som vi ser i E-cadherin lokalisering (se fig. 1B, 3A) forekommer hovedsakelig via posttranskripsjonelt regulering. Uttrykk for
VIM Hotell og
TWIST
ble bare svakt påvirket, mens andre EMT markører ble funnet å være ikke-uttrykt. Disse dataene tyder på at SW480 celler som ikke gjennomgår en fullstendig mesenchymale-til-epitelial overgang etter FGF-reseptor eller MAPK-inhibering. Vi fikk ikke også se regulering av tarmstamcellemarkører, som nylig har blitt knyttet til EMT i tumorer (Fig. 5B) [42], [43], [44]. Regulering av transkripsjons repressor
SNAI2 Hotell og målet genet
CDH1
via ERK1 /2 signaler har blitt vist før i SW480 celler [45]. Vi vurderte derfor uttrykk for
SNAI2 Hotell og
CDH1
av QRT-PCR, som kan være mer følsomme enn rekke analyse. Vi kunne bekrefte svak aktivering av
CDH1
etter SU5402 behandling, mens
SNAI2
var uendret (Fig. 5C).
FGF9 uttrykk er korrelert med pasientens overlevelse i menneskets tykktarm kreft
for å vurdere
in vivo
betydningen av våre analyser, vi bestemt uttrykk for
FGF9
i eksemplar av mus og humane tarmsvulster. I mus intestinal adenom, fant vi økt uttrykk for
Fgf9
i et lignende mønster som Wnt målet genet
Axin2
. Når vi bestemt uttrykk for
FGF9
i menneskets tykktarm kreft, vi også funnet generalisert uttrykk i svulsten epitel i primærsvulster og lungemetastaser (Fig. 6). Siden vår skjerm, sammen med vår påfølgende funksjonell analyse av samlet FGF signaler, indikerte en mulig rolle for FGF9 signaler i tarm karsinom, vi undersøkte relative uttrykk nivåer av
FGF9
i et sett med 95 uttrykk profiler av menneskelig tykktarmskreft, som består av normal kolon (4 profiler), avansert tykktarmskreft (iscenesatt T3 /4 av International Union Against Cancer (UICC) kriterier; 41 profiler), og metastaser til lymfeknuter, lever og lunge (50 profiler) [46]. Vi fant basal uttrykk nivåer av
FGF9
i normal tykktarm vev profiler og i et flertall av tumor profiler, men høy uttrykk for
FGF9
i en undergruppe av 7 colontumorer og 5 metastaser (Fig . 7A; cut-off to ganger sammenlignet med normalt vev). Av notatet, vi også funnet økt uttrykk av
FGFR3
, koding for en høy affinitet FGF9 reseptoren, i 3 primære tumor profiler og flere metastaser (Fig. 7A). Den høye ekspresjon av
FGF9
ble holdt mellom par av primære tumorer og metastaser avledet fra tre pasienter, noe som indikerer at
FGF9
aktivering i tumoren kan vedvare over lange tidsperioder.
uttrykk av Wnt målet genet
Axin2 /AXIN2 plakater (til venstre) og
Fgf9 Twitter /
FGF9 plakater (til høyre) i mus og humane tarm maligniteter var bestemmes av RNA
in-situ
hybridisering. Øvre paneler: Adenom av kolon fra en APC
min mus. Midt paneler: primære humane tykktarmskreft. Nedre panel: lungemetastase av human colon carcinoma. Negativ kontroll hybridisering (ved hjelp av en ikke-relatert asRNA sonde av tilsvarende størrelse og CG innhold, ikke vist) produserte ikke noe signal. Skala barer representerer 500 mikrometer.
Et uttrykk for
FGF9
eller
FGFR3
i invasiv og metastatisk tykktarmskreft, som vurdert av microarray analyse (n = 95) . Expression i hver prøve er angitt med sirkel, er median uttrykk i hver gruppe gitt av rød bar. Tall i
FGF9
grafen indikerer primær tumor /metastase parene som stammer fra samme pasient. B Kaplan-Meier overlevelsesanalyse av pasienter som ble undersøkt i A (primære svulster med bare oppfølgings data, n = 39). Pasientene ble gruppert etter høy ( 2 ganger av median, angitt med grønn sirkel i figur 7A.) Og lav
FGF9 Hotell og
FGFR3
uttrykk
Vi endelig korrelert uttrykk for
FGF9
i primærsvulster (n = 39) med pasient overlevelse, ved hjelp av Kaplan-Meier analyse. Undergruppen av 7 pasienter med høyt uttrykk for
FGF9
hadde signifikant kortere overlevelse sammenlignet med pasienter med lav
FGF9
uttrykk (Fig. 7B,
p
= 0,008). Vi så et lignende resultat, når vi inkluderte pasienter med høyt uttrykk for
FGFR3
i gruppen (Fig. 7B,
p
= 0,006). Den observerte sammenheng mellom høy uttrykk for
FGF9 Hotell og kort pasient overlevelse kan indikere funksjonelle roller FGF9 i tumorprogresjon.
Diskusjoner
Her foretok vi en fokusert skjermen for å identifisere gener hvis ekspresjon er nødvendig for å opprettholde en mesenchymale, potensielt metastatiske fenotype i SW480 kolon kreftceller, og isolerte flere kandidater. Mange av disse genene kan knyttes til store signalveier eller har vært implisert i EMT og tumorprogresjon før. Vi fant HMG-box transkripsjonsfaktor genet
TCF7L1 plakater (også kjent som
TCF3
), som kan overføre Wnt /β-catenin signaler [29]. Interessant er det relaterte transkripsjonsfaktor TCF7L2 (også kjent som TCF4) som kreves for å overføre den Wnt /β-catenin signal og for å opprettholde den stamcellelinjen i tarmen [47], [48]. Familiemedlemmet
TCF7L1
er imidlertid også til uttrykk i tykktarmen krypten og tykktarmskreft (Fig. S8). Våre resultater indikerer derfor at
TCF7L1
kan ha en foreløpig uidentifisert rolle i overføring av tumorrelaterte β-catenin signaler.
Vi har også identifisert
ptch
,
GLI2 Hotell og
GLI3
, som koder for komponenter av Hedgehog signalveien. Mulige roller Hedgehog signaler i tykktarm kreft progresjon og metastasering er omstridt [49], [50]. Resultater av vår skjerm støtte en rolle Hedgehog signaler i modulering av celle adhesjon i tykktarm kreft celler.
Uventet, skjermen ga også tre gener som inaktive fremmet en mer spindel-skjema fenotype. To av disse,
BICC1 Hotell og
MAGI1
har vist seg før å være nødvendig for montering av E-cadherin-mediert celle adhesjon komplekser [51], [52]. Oppdagelsen av funksjonelle roller av disse genene i opprettholdelse av gjenværende celle-celle-kontakter i tumorceller kan tyde på en mer universell rolle for disse genene i reguleringen av celleadhesjon enn forventet før.
FGF signaler har blitt implisert i kontrollen av intestinal motilitet celle og tykktarmskreft progresjon før. For eksempel har FGF1 og FGF2 vist seg å fremme migrasjon av intestinale epitelceller [53], og spesifikke isoformer av FGFR3 kan megle vekst og migrasjon av tykktarmskreftceller [54]. I vår skjerm, identifiserte vi
FGF9
som et gen involvert i reguleringen av tykktarmskreft celle adhesjon. Ved hjelp av små molekylære inhibitorer og aktivitetsanalyser av nøkkelsignal transdusere, har vi funnet at MAPK-kaskaden og Rho GTPases er kritiske ved overføring av FGF-signaler som styrer celleadhesjon og motilitet i kolon kreftceller, mens PI3K kaskade er ikke. SW480 tykktarm kreft celler inneholder en godt karakterisert sett av mutasjoner, inkludert en aktive
KRAS plakater (G12V) mutasjon [55]. Våre data antyder derfor at onkogene mutasjoner i KRAS ikke fullt ut frikoble MAPK-aktivitet fra oppstrøms stimuli, men kan i stedet potensere RTK signaltransduksjon. I pasient, behandling suksess ved hjelp av VEGF og EGF reseptor hemmere avhenger avgjørende på fravær av nedstrøms KRAS eller BRAF mutasjoner [25].
Nyere modeller av tumorprogresjon innebærer en ukontrollert aktivering av utviklingssignalveier og embryonale genekspresjon programmer, noe som resulterer i en koordinert tap av celle adhesjon, gevinst på cellemotilitet og oppkjøpet av stamcelletrekk i metastatiske tumorceller [42], [43], [44]. Vår skjermen identifiserer flere kandidat gener som kan spille roller i disse prosessene.
