Abstract
Uttrykk av lymfoid enhancer faktor 1 (LEF1) blir ofte endret i forskjellige kreft hos mennesker. Denne studien hadde som mål å vurdere LEF1 uttrykk i tykktarm kreft vev og å utforske endret fenotyper, genekspresjon, og mulig mekanisme etter slått ned LEF1 uttrykk i tykktarm kreft cellelinjer. Totalt 106 tykktarmskreft og matchet paratumorous normalt vev ble brukt for å vurdere LEF1 uttrykk ved hjelp av immunhistokjemi og QRT-PCR. LEF1 lentivirus ble anvendt for å knockdown LEF1 uttrykket for vurdering av cellenes levedyktighet, cellesyklusfordeling, apoptose, og genekspresjon. Den nakne mus xenograft analysen ble utført for å påvise effekten av LEF1 knockdown
in vivo
. Dataene viste at nivåene av LEF1 mRNA og protein ble signifikant økt i humane tarmkreft vev sammenlignet med matchede paratumorous normale vev, og var assosiert med infiltrering dybde, lymfeknute og fjernmetastaser, avansert TNM (tumor-node-metastase) trinn, og kortere total overlevelse. Videre LEF1 knockdown redusert tumorcellelevedyktighet, invasjon kapasitet, MMP2 og MMP-9-ekspresjon, men induserte apoptose. Nude mus xenograft analysen viste at LEF1 knockdown undertrykte tumordannelse og vekst
in vivo
. I tillegg ble ekspresjon av Notch sti-relaterte proteiner RBP-jκ og Hes1 redusert i LEF1 knockdown-celler. Til sammen ble LEF1 protein overexpressed i tykktarm kreft vev og knockdown av LEF1 uttrykk hemmet tykktarmskreft vekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Disse data tyder på at satsingen på LEF1 uttrykk bør vurderes nærmere for tykktarmskreft forebygging og behandling
Citation. Wang W-J, Yao Y, Jiang L-L, Hu T-H, Ma J-Q, Liao Z-J, et al. (2013) knockdown i lymfoid Enhancer faktor 1 Hemmer Colon Cancer Progresjon
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 8 (10): e76596. doi: 10,1371 /journal.pone.0076596
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 31. mai 2013; Akseptert: 3. september 2013, Publisert: 02.10.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Natural Science Foundation National of China (No.81001090) (https://www.nsfc.gov.cn/nsfc/cen/xxgk/slzz.html).The~~number=plural finansiører hadde ingen rolle i studiedesign , datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft er en av de mest vanlige. kreft hos både menn og kvinner i verden, sto for den andre årsaken til kreftdød i USA [1,2] og den fjerde i Kina [3]. Således, forblir tykktarmskreft en stor global offentlig helseproblem, selv om det er en vesentlig verdensomspennende nedgang i kreftrelatert dødelighet av kreft i tykktarmen i løpet av de siste tiårene, på grunn av den betydelige fremskritt i tidlig diagnose og effektive behandlinger. Hittil har patogenesen og molekylære mekanismen ansvarlig for tykktarmskreft utvikling blitt grundig studert og en stor mengde kunnskap har blitt generert av molekylære endringer forbundet med kolon kreftutvikling, som innebærer aktivering av onkogener og stillhet tumorsuppressorgener [4]. Men mye mer må gjøres for presis forståelse av tykktarmskreftutvikling og utvikle nye strategier for å effektivt kontrollere sykdommen.
Med dette for øye, vår forskning fokuserer på lymfoid Enhancer bindende faktor-1 (LEF1) , et medlem av høy mobilitet gruppe (HMG) protein familien.
LEF1
koder et 48-kD kjerneprotein som uttrykkes vanligvis i pre-B og T-celler [5,6] og spiller en viktig rolle i embryogenese og kreftutvikling [7]. LEF1 er et multifunksjonelt protein som påvirker en rekke cellefunksjoner, slik som regulering av Wnt signalering for celle proliferasjon, apoptose, mobilitet, og gentranskripsjon [8,9]. Endret ekspresjon av LEF1 protein har blitt rapportert å være involvert i tumordannelse av forskjellige humane kreftformer, inkludert kreft i tykktarmen [10]. Molekylært kan LEF1 formidle ekspresjonen av Wnt aliserte gener via rekruttering av β-catenin til promotoren av målgener [11,12], men LEF1 selv mangler sin egen transkripsjonen aktivering potensial i celler. LEF1 proteinholdige β-catenin bindingsdomener kan regulere celleproliferering og invasjon av tumorceller [13]. Flere faktorer kan påvirke LEF1 uttrykk, slik som fibroblastvekstfaktor-2, PITX2, og hepatocytt-vekstfaktor [14-16].
Således, i denne studien, vi først oppdaget LEF1 ekspresjon i colon cancer vev sammenlignet med de paratumorous kolon vev og deretter undersøkt effekten av LEF1 knockdown i reguleringen av tykktarmskreft celle levedyktighet, cellesyklus distribusjon, apoptose, og genekspresjon
in vitro Hotell og i naken mus xenografter. Vi utforsket også effekten av LEF1 knockdown på regulering av Notch veien.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Studiet ble godkjent av Conduct of Human Etisk komité First Affiliated Hospital, College of Medicine av Xi’an Jiaotong University. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Dyret eksperimentelle protokollen ble godkjent av Animal Care og bruk komité Medical School of Xi’an Jiaotong University.
Pasienter og prøver
i denne studien har vi i ettertid rekrutterte 106 par av kirurgisk reseksjon tykktarmskreft og paratumorous prøver normalt vev (5 cm fra tumorlesjon) fra den første Affiliated Hospital, College of Medicine av Xi’an Jiaotong University mellom januar 2006 og mars 2007. Disse vevsprøver ble oppnådd fra 60 mannlige og 46 kvinnelige pasienter med en gjennomsnittsalder på 55,5 år (spredning fra 30 til 81 år). Clinicopathological funksjoner av disse pasientene er vist i tabell 1. Patologisk diagnose av disse prøvene ble uavhengig re-bekreftet av to patologer i en blindet mote. Alle pasientene ble ikke behandlet med noen kjemoterapi eller radioterapi før kirurgi. De siste pasient oppfølginger ble gjennomført i slutten av mai 2012. De pasientene som ble tapt for oppfølging eller død av andre enn tykktarmskreft årsaker ble ansett som sensurerte data i løpet av overlevelsesanalyse.
Clinicopathological variabler
N
LEF1 uttrykk score (gjennomsnitt ± SD)
P
verdi
Alder (år) 60414,87 ± 2.330.502≥60655.21 ± 2.65Tumor differentiationWell504.84 ± 1.940.274Moderate394. 95 ± 2.87Poor175.59 ± 3.02Infiltration depthT
1 + T
2404,12 ± 1.980.002T
3 + T
4665,66 ± 2.56Lymph metastaser N
0464,06 ± 2,12 0,001 N
1 til 3605,85 ± 2.74Distant metastasisM
0864,69 ± 2.040.004M
1206,31 ± 2.77TNM stageI81.39 ± 3,23 0.001II334.14 ± 2.40III455.33 ± 2.25IV207.12 ± 2.69Table 1 . Association of LEF1 uttrykk med clinicopathological faktorer fra pasientene.
CSV ned CSV
Histopatologi og immunhistokjemi
parafininnstøpte seksjoner (5 mikrometer) ble deparaffinized og rehydrert gjennom en serie av gradert alkoholer. For immunhistokjemi, ble et primært antistoff mot LEF1 (C12A5, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ble brukt ved en fortynning på 1: 100, og inkubert over natten ved 4 ° C. Snittene ble inkubert med en isotype-matchet kontrollantistoff som en negativ kontroll. Deretter ble seksjonene farget med en biotin-konjugert sekundært antistoff, og fargen ble utviklet ved bruk av 0,05% 3 «, 3»-diaminobenzidin tetrahydroklorid, etterfulgt av kontra med hematoksylin. Seksjonene ble endelig gjennomgått og scoret under en Olympus mikroskop (BX41, Tokyo, Japan), ifølge en tidligere studie ved hjelp multiplisere intensitet og omfanget av farging poengsum [17]. Den fargeintensitet ble scoret som 0 (ingen flekker), en (svak flekker), 2 (middels flekker), eller 3 (sterk farging). Graden av farging ble evaluert ved å plassere prøvene skårer basert på prosentandelen av positivt fargede celler som følger: 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) og 4 (76-100%). Antall positive celler ble vurdert ved å telle 10 tilfeldige felt ved x 400 forstørrelse. Sluttresultatet ble varierte fra 0 til 12. En score på 0-2 ble definert som negative uttrykk, score 3-5 som «svak uttrykk», score 6-9 som «moderat uttrykk» og score 10-12 som «sterkt uttrykk «. For hensikten med videre analyse prøvene med 0-5 ble definert som betydelig redusert flekker eller tap av LEF1 uttrykk, mens prøvene med score 6-12 ble gruppert og definert som positivt uttrykk.
Sanntids revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon
Total cellulær RNA ble isolert fra vev og cellelinjer ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Disse RNA-prøvene ble deretter reverstranskribert inn i cDNA ved anvendelse av et RT-PCR Kit (Takara, Dalian, Kina). Real-time PCR ble deretter utført i iQ5 Multi-farge Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) med SYBR Premiks Ex Taq TM II (Takara). Primersekvensene for å forsterke LEF1 var: 5′-AGCGAATGTCGTTGCTGAGTGTA-3 «og 5′-CTCTTGCAGACCAGCCTGGATAA-3». Et husholdningsgenet GAPDH ble benyttet som intern kontroll, og primersekvensene var 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 «og 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3». Dataene ble kjøpt som en terskel syklus (A C
t) verdi. De A C
t-verdier ble bestemt ved å subtrahere den gjennomsnittlige innvendige husholdningsgenet C
t-verdi fra gjennomsnitts målgenet C
t-verdi. Siden forsterkning effektiviteten av målgener og intern kontroll genet var lik, ble den relative genuttrykket beregnes ved hjelp av to
-ΔΔCt metode. Hver måling ble utført i tre eksemplarer.
Bygging av lentivirus vektor som bærer LEF1 shRNA
En LEF1 shRNA lentivirus vektor (U6-vshRNA-CMV-PUR-GFP-GV248-shLEF1) ble utformet, syntetisert og konstruert av Genechem Co (Shanghai, Kina). De følgende target-sekvenser i det humane LEF1-genet ble valgt ut, dvs. rettet mot en, GCTGACATCAAGTCTTCCTTG; målrette 2, GTGAAGAGCAGGCTAAATATT; målrette 3, GCTGGTCTGCAAGAGACAATT; og målrette 4, GCTCA TTCCCAACGTGCAAAG. Mål 3 ble valgt for de etterfølgende eksperimenter. Den lentivirus vektor U6-vshRNA-SHNC, som koder for et tilfeldig RNAi sekvens, ble brukt som en negativ kontroll.
Cellelinjer, kultur, genet transfeksjon og behandlinger
Menneskelig tykktarm kreft cellelinjer, Caco
2, colo205, HCT116, HT29, og Lovo ble hentet fra, Shanghai Institutes (Shanghai, Kina) Cell Resource Center for Biological Sciences og dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) (HyClone, Logan, UT, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen), penicillin (100 IU /ml), og streptomycin (0,1 mg /ml) i 5% CO
2 ved 37 ° C. En human koloncancer cellelinje SW480 ble dyrket i RPMI1640 medium (HyClone, Logan, UT, USA) supplert med 10% FBS, penicillin (100 IU /ml), og streptomycin (0,1 mg /ml) i 5% CO
2 ved 37 ° C, mens en annen human koloncancer cellelinje SW620, ble dyrket i L-15 medium (Invitrogen) supplert med 10% FBS, penicillin (100 IU /ml), og streptomycin (0,1 mg /ml) i 5 % CO
2 ved 37 ° C. SW480 og SW620-celler ble infisert med lentivirus vektorer ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 10 og 100, henholdsvis, og deretter velges i puromycin-inneholdende vekstmedium. Etter 7 dagers kultur, ble puromycin-resistente kolonier plukket opp, ekspandert og analysert separat
γ-sekretase inhibitor DAPT (100 uM; Sigma-Aldrich, USA). Ble anvendt for farmakologiske inhiberings-analyser, som kan effektivt blokk Notch intracellulært domene (NiCd) å gå inn i cellekjernen. I korte trekk, ble disse cellene sådd ut i seks-brønns plater og behandlet med 2 ml medium inneholdende 1% FBS og DAPT. Kontrollceller ble behandlet med like mengder av dimetylsulfoksyd (DMSO). Etter 48 timer med inkubasjon ble celleekstrakter fremstilt for Western blot som beskrevet nedenfor.
Protein ekstraksjon og Western blot
Protein ble ekstrahert fra vev og celler, og disse protein lysater ble separert ved 6% -12% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese; separerte proteiner ble deretter elektronisk blottet på polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Danvers, MA). Membranene ble deretter blokkert og deretter inkubert med følgende primære antistoffer: anti-LEF1 antistoff (1: 800, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-MMP2 (1: 500; Cell Signalering Technology, Danvers, MA), anti -MMP7 (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-MMP9 (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-NICD (1: 800; Cell Signalering Technology), anti- RBP-jκ (1: 100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-Hes1 (01:50; Santa Cruz Biotechnology), eller anti-β-aktin-antistoff (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology). Til slutt ble blottene visualisert ved et ECL deteksjonssystem (Millipore) med en pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology). Western blot ble gjentatt tre ganger for hvert protein prøve.
Celleviabilitet MTT analyse
Cells (5 × 10
3 per brønn) ble sådd med 200 ul vekstmedium i en 96 -Vel plate og vokst opp til 7 dager. På slutten av forsøkene, 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT, 0,5 mg /ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ble tilsatt til hver brønn. Cellene ble deretter dyrket ved 37 ° C i 4 timer, og 150 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn og blandet ved rysting ved romtemperatur i 10 min. Etter dette ble absorpsjonshastigheten målt ved en bølgelengde på 490 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Hvert forsøk ble utført i triplikat og gjentas minst tre ganger.
Strømningscytometri cellesyklus og apoptose assays
For cellesyklusanalyse,-celler (5 x 10
5) ble dyrket og oppsamlet, vasket to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS), og fiksert med iskald 70% etanol i 24 timer ved 4 ° C. De faste celler ble farget med 150 ul propidiumjodid og 150 ul RNase A (Sigma-Aldrich) sekvensielt. Etter inkubering i 30 minutter ved 37 ° C, ble prøvene undersøkt ved hjelp av et strømningscytometer (FACS-kaliber, Franklin Lakes, NJ), og celle quest programvare ble benyttet for å analysere dataene. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger.
For apoptose-analyse ble celler (5 x 10
5 per brønn) ble dyrket i seks-brønns plater, oppsamlet, og vasket to ganger med iskald PBS. Neste, 500 mL av bindingsbuffer, 5 ul Annexin V-APC, og 5 pl 7-AAD (keygen Biotech, Nanjing, Kina) ble sekvensielt tilsatt til prøvene. Etter blanding og inkubering i 15 minutter ved 37 ° C, ble prøvene kjørt på flowcytometri umiddelbart. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger.
tumorcelle-invasjon Matrigel assay
invasjon kapasitet for tykktarmskreftceller ble vurdert ved hjelp av en Millicell invasjon kammer (Millipore, Billerica, MA, USA) . De 8 mikrometer pore innsatser ble belagt med Matrigel (Becton og Dickinson Company, Franklin Lakes, NJ, USA). Celler (5 x 10
4) ble gjenoppslemmet med 200 ul serumfritt medium med 5 ug /ml mitomycin C (Sigma-Aldrich) i toppkammeret, og den nederste kammeret ble fylt med normal kulturmedium. Etter inkubering i 24 timer ble de ikke-invaderende celler på den øvre overflaten fjernes med en bomullspinne og de invaderende celler på bunnflaten av filteret ble fiksert i metanol, farget med 0,1% krystallfiolett og tellet under et mikroskop ved hjelp av 10 tilfeldig utvalgte felt i en forstørrelse på 200x
Nude musetumorcelle xenograft analysen
Mann BALB /c naken mus (alderen mellom 4 og 6 uker,. Shanghai Experimental Animal Center, Shanghai, Kina) ble subkutant inokulert med 1 × 10
7 celler og holder til i et patogen fritt anlegg av Animal Center of Xi’an Jiaotong University. Tumorvolumet ble bestemt ved lengden (L) og bredden (B), målt med en glidende kaliper og beregnet som L x W
2 x 0,5. Musene ble avlivet 45 dager etter subkutan injeksjon av tumorceller. Tumor bærende nakne mus ble observert av IVIS Imaging System (IVIS spekteret, Xenogen, CA, USA) før de ble ofret.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 17.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL). Beskrivende data ble analysert med Pearsons kji-kvadrat test (to-sidig). Måledata ble analysert med Student
t
-test eller analyse av varians (ANOVA). En
P
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
LEF1 uttrykk i menneskelige kolon kreft vev og cellelinjer
I denne studien vi først bestemt uttrykk for LEF1 protein i menneske tykktarm kreft vev og cellelinjer ved hjelp av immunhistokjemi. Resultatene viste at 71 av 106 tykktarm vev og 23 av 106 paratumours normale tykktarm vev uttrykte LEF1 protein, noe som indikerer at tykktarmskreft vev uttrykt høyere nivåer av LEF1 enn de i paratumours normale tykktarm vev (
P
0,05; figur 1A). Selvfølgelig ble LEF1 uttrykk observert i kjernen i tykktarm kreft vev og paratumours normale kolon vev (Figur 1a). Videre ekspresjon av LEF1 protein ble assosiert med infiltrering dybde, lymfeknute og fjernmetastaser, og avansert TNM (tumor-node-metastase) stadier av tykktarmskreft (
P
0,01; Tabell 1). Overlevelse analyse (5-års oppfølging av 106 tykktarmskreftpasienter) viste at median overlevelse av pasienter med LEF1 uttrykt svulsten var 48,5 måneder, noe som var vesentlig dårligere enn de med LEF1-negative tumorer (mer enn 60 måneder) (
P
0,05, figur 1B)
(A) Immunohistochemistry farging av LEF1 på paratumorous kolon vev (a) og tykktarmskreft vev (BD) (skala bar, 25 pm). ( a) negativ uttrykk, (b) svak ekspresjon, (c) moderat ekspresjon, (d) sterk ekspresjon. (B) Kaplan-Meier kurve for sammenslutning av LEF1 protein uttrykk med total overlevelse av pasienter. (C) QRT-PCR ble brukt til å oppdage de relative uttrykk nivåer av LEF1 mRNA (cc vev: tykktarmskreft vev, normalt vev: paratumorous kolon vev). Kolonner, mener (n = 106); barer, SD; ***
P
0,001 sammenlignet med paratumorous kolon vev.
P
verdi ble fastsatt av Student
t
-test. (D) Western blot analyse av LEF1 uttrykk i syv kolorektal kreftceller (Caco
2, colo205, HCT116, HT29, Lovo, SW480, og SW620). β-actin ble brukt som intern kontroll.
På samme måte, real-time PCR-analyse viste at nivåene av LEF1 mRNA ble betydelig økt i disse 106 par av tykktarm kreft vev sammenlignet med de paratumours normale kolon vev (
P
0,05, figur 1C). Videre LEF1 uttrykk ble sterkt uttrykt i tykktarm kreft cellelinjer SW480 og SW620 (figur 1D). Derfor valgte vi disse to cellelinjene til knockdown LEF1 uttrykk for videre studier.
Stall knockdown av LEF1 uttrykk i tykktarm kreft celler
For å undersøke hvilken rolle LEF1 på tykktarm kreft celler, vi utnyttet et lentivirus bærer LEF1 shRNA å infisere SW480 og SW620 for knockdown av LEF1 uttrykk. Mål 3 ble brukt for å etablere stabile LEF1 knockdown cellelinjer. Vi lykkes oppnådd stabil LEF1 knockdown celler betegnes shLEF1 og SHNC (med negativ kontroll vektor). Real-time PCR-analyse viste at uttrykket av LEF1 mRNA ble hemmet opp til 70% i shLEF1 celler sammenlignet med SHNC celler (
P
0,05, figur 2A). Tilsvarende nivåene av LEF1 protein ble også slått ned betydelig i shLEF1 celler enn i SHNC celler (figur 2B).
(A) QRT-PCR analyse av LEF1 uttrykk etter smitte av ulike LEF1 shRNA uttrykk lentivirus vektorer, *
P
0,05 i forhold til den overordnede cellen. (B) Western blot-analyse av LEF1 proteinekspresjon. β-aktin ble benyttet som intern kontroll. 1-4 (forskjellige mål posisjons vektorer) og SHNC (negativ kontroll). Mål 3 ble brukt til å etablere stabile LEF1 knockdown cellelinjer.
knockdown av LEF1 uttrykk hemmet levedyktighet av tykktarmskreftceller
in vitro Hotell og tumordannelse og vekst
in vivo
Stabil LEF1 shRNA transfektanter ble sådd og dyrket i puromycin-holdige vekstmedium for vurdering av cellen levedyktighet. Våre data viste at SW480-shLEF1 celler og SW620-shLEF1 cellene vokste mye langsommere enn SW480-SHNC celler og SW620-SHNC celler, henholdsvis (
P
0,01; figur 3A). Cellesyklusfordelingen detekteres av et strømningscytometer viste en langvarig og tydelig forsinkelse av G0 /G1 fase progresjon til S-fasen i shLEF1 celler sammenlignet med SHNC celler (
P
0,01; figur 3B og 3C). Videre har vi videre analysert hvorvidt den reduserte tumorcellelevedyktighet er på grunn av induksjon av apoptose, og fant at SW480 og SW620-celler med stabil transfeksjon LEF1 shRNA hadde signifikant mer apoptose sammenlignet med kontrollceller (figur 3D og 3E).
(A) MTT-analyse. **
P
0,01 sammenlignet med tilsvarende SHNC celler. (B og C) strømningscytometrisk cellesyklusfordeling. Kolonner, mener (n = 3); barer, SD; **
P
0,01 sammenlignet med tilsvarende SHNC celler. (D og E) flowcytometrisk apoptose analysen. Celle spontan apoptose ble bestemt ved flow-cytometri. Kolonner, mener (n = 3); barer, SD; ***
P
0,001 sammenlignet med kontroll SHNC cellene
Videre har vi utført en naken mus xenograft analyse for å vurdere rollen LEF1 knockdown
in vivo.
. Førti fem dager etter tumorcelle injeksjon, LEF1 knockdown-tumorxenotransplantater viste en reduksjon av tumorvekst sammenlignet med kontroll-SHNC tumorxenotransplantater. I tillegg
in vivo
avbildning viste at begge typer mus ikke har observerbare kreftmetastaser til fjerne organer (Figur 4A). De gjennomsnittlige volumer av tumormasse avledet fra SW480-shLEF1 celler og SW620-celler shLEF1 var mye mindre enn de til tumorxenografter avledet fra SW480-SHNC celler og SW620-celler SHNC henholdsvis (
P
0,001 Figur 4B). Den tumorvekt viste også at knockdown av LEF1 ekspresjon hemmet veksten av tykktarmskreftceller i nakne mus (figur 4C), fordi vekten av tumorer masse i SW480 og SW620-celler som uttrykker shLEF1 var betydelig lettere enn de i kontrollmusene. Disse funnene antydet at LEF1 knockdown hemmet dannelse og vekst av tumorxenotransplantater in vivo.
(A)
I
vivo
bildeanalyse. Vekst av tumorer dannet av shLEF1 celler og kontroll SHNC celler i hårløse mus ble fotografert av IVIS. (B) Tumorvolumet ble målt hver 3. dag fra dag 9 etter inokulering ved å måle tumor lengde og bredde. Kolonner, mener (n = 6); barer, SD; ***
P
0,001 sammenlignet med kontroll SHNC celler. (C) Tumorvekt ble sammenlignet på dag 45 etter tumorcelle inokulering. Kolonner, mener (n = 6); barer, SD; ***
P
. 0.001 sammenlignet med kontrollgruppen SHNC
knockdown av LEF1 uttrykk redusert invasjon av tykktarmskreftceller og uttrykk av MMP-2 og MMP-9
Etter det fant vi ut effekten av LEF1 knockdown på regulering av tykktarm kreft celle invasjon hjelp av Matrigel invasjonen analysen. Vi behandlet cellene med mitomycin C for å eliminere påvirkning av øket proliferasjon. Resultatene viste at antallet invaderende SW480-shLEF1 celler og SW620-celler shLEF1 var mye lavere enn den for SW480-SHNC celler og SW620-celler SHNC (
P
0,01; figur 5A og 5B). Videre knockdown av LEF1 uttrykk kan i betydelig grad redusere nivåene av MMP-2 og MMP-9-protein, men ikke MMP-7-protein i shLEF1 celler sammenlignet med SHNC tarmkreftceller (figur 5C).
( A og B) Tumor celle invasjon assay. Representative fargebilder, × 200. Kvantitativ analyse av invadert tumorceller mellom LEF1 knockdown og kontrollcellene. Kolonner, mener (n = 3); barer, SD; **
P
0,01 sammenlignet med kontroll SHNC cellene. (C) Western blot-analyse for å MMP2, MMP-7 og MMP-9-proteinet. β-actin ble brukt som intern kontroll.
knockdown av LEF1 uttrykk hemmet RBP-jκ aktivitet
Til dags dato, har flere studier har rapportert at Wnt og Notch sti i fellesskap kontrollerer celleproliferasjon og tumorgenese i tarmen [18]. For å avsløre mulige konvergerende poeng og for å avklare potensialet mekanismen som LEF1 regulerer spredning og tumorigenesis, vi har oppdaget uttrykk for Notch intracellulære domenet (NiCd) /RBP-jκ /Hes1 pathway gener i disse tykktarmskreftceller. Vi fant ingen signifikant forskjell i nivåer NiCd uttrykk i tykktarm kreft celler med ulike behandlinger; imidlertid, ble nivåene av RBP-jκ og Hes1 proteiner redusert i SW480-shLEF1 celler og SW620-shLEF1-celler sammenlignet med kontrollceller (figur 6A).
(A) Western blot-analyse NiCd, RBP-jκ og Hes1 uttrykk. (B) Western blot-analyse av LEF1 uttrykk etter å ha blitt behandlet med Notch-reaksjonsveiinhibitor DAPT (100 uM). β-actin ble brukt som intern kontroll.
Våre upubliserte data viste en økt aktivitet av full-lengde LEF1 promoter på kotransfeksjonen NiCd cDNA i SW480, HepG2, HEK293, A549, og HeLa-celler ; dermed utnyttet vi DAPT, en hemmer av Notch vei, for å blokkere NICD uttrykk i SW480 og SW620 celler. Våre data viste at NICD downregulation påvirket uttrykk for Hes1 og LEF1 proteiner (Figur 6b), noe som tyder på en gjensidig regulering mellom LEF1 og Notch sti.
Diskusjoner
I denne studien, må vi først analysert ekspresjon av LEF1 mRNA og protein i koloncancer vevsprøver og deretter undersøkt effekten av LEF1 knockdown på regulering av endrede tumorcellelevedyktighet, cellesyklusfordeling, apoptose, og genekspresjon
in vitro
og på nakne mus xenograft . Vi fant at nivåene av LEF1 mRNA og protein var signifikant økt i tykktarm kreft vev og i forbindelse med infiltrasjon dybde, lymfeknute og fjernmetastaser og kortere total overlevelse. LEF1 knockdown redusert tumorcellelevedyktighet, invasjon kapasitet, og ekspresjon av MMP2 og MMP-9, men induserte apoptose i tykktarmskreftceller. LEF1 knockdown undertrykket tumordannelse og vekst i nakne mus. Dessuten ble uttrykket av RBP-jκ og Hes1 redusert i LEF1 knockdown celler. Disse dataene tyder på at LEF1 kunne bli ytterligere vurdert som et mål for tykktarmskreft forebygging og behandling.
Tidligere studier viste at uttrykket og aktivering av LEF1 protein bidratt til kreftutvikling [10,13,19]. Faktisk vår nåværende studie analysert uttrykk for LEF1 mRNA og protein i tykktarmskreft og paratumorous tykktarm vev og fant at LEF1 ble overuttrykt i tykktarm kreft vev. Nivåene av LEF1 uttrykk var assosiert med infiltrasjon dybde, lymfeknute, og fjernmetastaser, og avanserte TNM stadier av tykktarm kreft samt dårlig generell overlevelse hos pasienter med tykktarmskreft. De sistnevnte data var forskjellige fra de data som rapporteres av Kriegl, L et al [20], men var lik en annen tidligere studie [21]. Disse dataene antyder at LEF1 kan være en nyttig markør for prediksjon av tykktarmskreft progresjon.
For ytterligere å forstå hvilken rolle LEF-en i tykktarmskreft, vi slått ned LEF1 uttrykk i to tykktarm kreft cellelinjer, SW480 og SW620. Vi utforsket videre rolle LEF1 i veksten av tykktarmskreft. Cellecyklus uorden ble definert som en induser som fører til ukontrollert celleproliferasjon og kreft progresjon fulgt av tumorgenese, for eksempel, Shtutman et al identifisert som cyklin D1 var en av de β-catenin /LEF1 komplekse målgener [22], som var ansvarlig for tumorcelle-proliferasjon og tumorprogresjon. I samsvar med denne studien, våre nåværende data viste at nedregulering av LEF1 betydelig hemmet tykktarmskreft celleproliferasjon
in vitro
ved å øke sub-G1 apoptotiske befolkningen, forlenge G0 /G1 fase, og reduserer G2 /S fase i LEF1-slått ned SW480 og SW620 celler
in vitro Hotell og i nakne mus xenografter, som bekreftet to andre tidligere studier i menneskelig livmor og tykktarm kreft [9,23].
Videre vår nåværende studien viste at LEF1 overekspresjon i primær CRC vev var assosiert med fjernmetastaser fra CRC pasienter, som er konsistent med flere tidligere studier som dokumenterer at LEF1 ble karakterisert som en biomarkør for tykktarmskreft å spre seg til leveren [21]. Ja, våre nåværende
in vitro
data bekreftet at knockdown av LEF1 uttrykk hemmet invasjon evne SW480 og SW620 celler sammenlignet med kontrollgruppen shRNA-transfekterte celler. På molekylært nivå, er MMP2, MMP7 og MMP9 assosiert med cellemigrasjon prosessen, å påvirke kreftutvikling og progresjon [24,25]. Vi fant at knockdown av LEF1 uttrykk trykkes MMP2 og MMP-9-ekspresjon, men ikke MMP-7, noe som indikerer at den selektive modulering av MMP’er ved LEF1 kunne ha den biologiske betydning i tykktarmskreft progresjon. I motsetning til dette LEF1 var i stand til å regulere MMP-7-ekspresjon og aktivitet i brystkreftceller [26], mens en annen tidligere studie viste at sirkulerende MMP-2 og MMP-9 kan brukes til å potensielt klassifisere pasienter inn i lav risiko, høy risiko, godartet sykdom, og brystkreft [24]. Men vår naken mus xenograft analysen ikke viser noen metastase i både LSF-en knockdown og kontroll tumorxenotransplantater; således blir ytterligere studier strengt nødvendig.
I tillegg er det hakk veien ofte aktivert i forskjellige humane kreftformer, så som kreft i hjernen, brystkjertler, cervix, lunge, hode og nakke, tykktarm, nyre, bukspyttkjertel, og akutt myeloid [27,28]. Inhibering av Notch spredningsveier indusert tumorceller til apoptose og redusert tumorcelleformering in colorectal cancer [29]. En nylig publikasjon viste at Wnt pathway var i stand til å regulere Notch veien [30]. Den krysstale mellom Notch og Wnt trasé kan være delvis mediert av den konkrete reguleringen av GSK-3β avhengig Notch fosforylering. Fosforylering av Notch-proteiner har blitt indirekte korrelert med Notch-aktivering og nukleær translokasjon, så vel som cellulær transformasjon. I tillegg Jagged1, en av Notch ligander, kan aktiveres av p-catenin i løpet av ektopisk hårsekken dannelse i voksen epidermis [31].
