Abstract
mucinous adenokarsinom (MAC) representerer en distinkt histopatologisk enhet av tykktarmskreft (CRC), som er forbundet med sykdom progresjon og dårlig prognose. Her fant vi at uttrykket nivåer av MIR-205 og MIR-373 ble spesielt oppregulert bare hos pasienter med mucinkjertler tykktarm kreft, men ikke i barnekonvensjonen som mangler mucinkjertler komponenter. For å undersøke effekten av MIR-205 og MIR-373 på intestinal epitelceller (IEC) biologi ved gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter i en proof-of-concept tilnærming, valgte vi tidligere etablert
in vitro
menneskelige Caco-2-baserte modeller for differensiert, ikke-invasiv (uttrykker TLR4 villtype, kalt Caco-2 [WT]) versus udifferensiert, invasiv (uttrykker TLR4 mutant D299G, betegnes Caco-2 [D299G]) IEC. Enterocyte lignende Caco-2 [WT] viste lave nivåer av MIR-205 og Mir-373 uttrykk, mens begge mirnas var signifikant oppregulert i kolorektal kreft-lignende Caco-2 [D299G], og dermed ligner miRNA uttrykket mønster av paret normal versus tumorprøver fra MAC pasienter. Ved hjelp av stabil transfeksjon, genererte vi MIR-205- eller MIR-373-uttrykke og MIR-205- eller MIR-373-hemmende subkloner av disse IEC linjer. Vi fant at innføringen av MIR-205 inn Caco-2 [WT] førte til utvidelse av slim-sekresjon slimcellelignende celler, som var forbundet med induksjon av KLF4, MUC2 og TGFβ1 uttrykk. Aktivering av MIR-205 i Caco-2 [WT] indusert chemoresistance, mens hemming av MIR-205 i Caco-2 [D299G] forfremmet kjemosensitivitet. Caco-2 [WT] overekspresjon MIR-373 viste mitotiske abnormiteter og gjennomgikk morfologiske endringer (tap av epitel polaritet, cytoskeletal omorganisering, og junctional avbrudd) assosiert med epitelial-mesenchymale overgang og progresjon til betennelse-assosiert kolon karsinom, som korrelert med induksjon av fosforylert STAT3 og N-cadherin uttrykk. Funksjonelt, innføring av MIR-373 inn Caco-2 [WT] mediert tap av celle-celle adhesjon og økt spredning og invasjon. Omvendt, hemming av MIR-373 lov mesenchymale IEC å gjenvinne epiteliale egenskaper som korrelerte med fravær av neoplastiske progresjon. Bruke xenograft i mus viste MIR-373-mediert akselerasjon av ondartet tarmtumorvekst. I konklusjonen, våre resultater gir første bevis for at MIR-205 og MIR-373 kan forskjellig bidra til aggressiv fenotype av MAC i CRC
Citation. Eyking A, Reis H, Frank M, Gerken G, Schmid KW , Cario E (2016) MiR-205 og MiR-373 er forbundet med aggressiv Menneskelig mucinous tykktarmskreft. PLoS ONE 11 (6): e0156871. doi: 10,1371 /journal.pone.0156871
Redaktør: Aamir Ahmad, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 12 april 2016; Godkjent: 20 mai 2016; Publisert: 06.06.2016
Copyright: © 2016 Eyking et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:. Denne studien ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant CA226 /4-3 EC) og egenutført finansiering (Interne Forschungsförderung Essen EC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Colorectal karsinom (CRC) er en av de vanligste kreftformene, og en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [1]. Innenfor den heterogene CRC-spektrum, mucinous adenokarsinom (MAC) representerer en distinkt histologisk subtype som er kjennetegnet ved rikelig produksjon av ekstracellulær mucin (mer enn 50% av tumorvolumet) [2]. Vanligvis er colonic slimcelleavledet mucin MUC2 uttrykt ved høye nivåer i MAC [3]. Slim hypersekresjon har vært knyttet til endringer i tarmbakterieflora og induksjon av inflammatoriske responser som kan fremme svulst utvikling [4]. Mens prevalens varierer fra 4% til 11% av alle CRC tilfeller, avhengig av geografisk plassering [5], er MAC langt oftere diagnostisert hos pasienter med CRC i Ulcerøs kolitt (UC) [6]. Det antas at kronisk betennelse i UC kan lette avvik mucin differensiering i CRC patogenesen [7], men de signalveier er ennå ikke forstått.
Klinisk har MAC blitt assosiert med mer avanserte stadier tumor ved diagnose, dårlig behandlingstiltak og redusert overlevelse i flere serier [8-11]. Til tross for nylige fremskritt i individualisert terapi og forvaltningsstrategier for pasienter med MAC, prognose i metastatisk setting synes å være enda verre enn for pasienter med andre subtyper av CRC [12]. Økende bevis tyder på at MAC kan representere en genetisk og fenotypisk annen sykdom enhet fra andre typer kolon adenokarsinom (AC) [13-15], men de spesifikke molekylære mekanismer som kan drive tumorprogresjon og metastatisk transformasjon i mucinous kreftutvikling er i stor grad ukjent.
microRNAs (mirnas) representerer en svært konservert klasse 19-25 nukleotid lange enkeltrådet ikke-kodende RNA som regulerer mange biologiske prosesser, inkludert kreft patogenesen [16]. Endring av diverse miRNA profiler har vist seg å korrelere med tykktarmskreft progresjon ved modulering av genekspresjon translatorisk og /eller transkripsjonelt i komplekse signaliseringsnettverk [17,18]. Imidlertid kan miRNA uttrykket signaturer varierer betydelig mellom CRC populasjoner [19], potensielt reflekterer fenotypiske variasjonen skyldes ulike histologiske subtype utdelinger i heterogene CRC kohorter [20]. Det er så langt uklart om enkelte mirnas kan utløse den biologiske oppførsel av MAC. Nylig har uavhengige rapporter løst rapportert MIR-205 og MIR-373 for å bli assosiert med CRC [21-23], men enkeltsaker ble ikke klassifisert i histologiske subtyper.
MIR-205 samhandler med medlemmer av MiR -200 familien (MIR-200a /-200b) [24], og representerer en epitelial-spesifikk miRNA [25], i alt vesentlig er involvert i normale cellefunksjoner, for eksempel regenerering og stamcelle utvidelse [26]. MIR-373 tilhører MIR-520 /-373 familien, som består av tre ulike miRNA klynger (MIR-302 /-367, MIR-371 /-372 /-373, og MIR-520) [27]. MIR-373, først identifisert som en embryonisk stamcelle-spesifikk miRNA [28], direkte kan regulere aktiviteten av Wnt /β-catenin veien [29]. Både MIR-205 og MIR-373 ser ut til å utøve en mitogen effekt på tumordannelse, avhengig av cellen eller vev opprinnelsesland. De målrette flere gener eller proteiner direkte eller indirekte [27,30] og kan dermed fungere enten som onkogener ved å tilrettelegge startfasen eller som tumor suppressors ved å hemme invasjon. Signalering via MIR-205 og MIR-373 kan favorisere epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) og kreft celle migrasjon i visse kreft enheter [24,31-33]. Men de mulige roller MIR-205 og MIR-373 i CRC patogenesen er fortsatt så langt ukjent.
Her viser vi at uttrykket nivåer av MIR-205 og MIR-373 er spesielt oppregulert bare i mucinous CRC. Funksjonelt, dirigerer MIR-205 tarm epitelceller skjebne avgjørelse mot en mucin produserende slimcellelignende avstamning og MIR-373 driver betennelse-assosiert tumor progresjon ved å redusere celle-celle adhesjon og økende invasjon. Derfor gir vi første bevis på at forskjellige signaleffekter av MIR-205 og MIR-373 kan forskjellig bidrar til den unike fenotype av MAC i CRC.
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
En detaljert liste over alle antistoffer er gitt i S1 tabell. Metotreksat (MTX) ble hentet fra Pfizer og Matrigel
® fra Corning.
Menneskelig tykktarmskreft prøver
Vi utførte en retrospektiv, single-center kohortstudie blant pasienter med diagnosen CRC ved hjelp av formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) materiale arkivert fra juli 2003 til november 2013 ved institutt for patologi, Universitetssykehuset i Essen, Tyskland. Denne studien arbeidet etter Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av den lokale etiske komité ( «Ethik-Kommision der medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen»; # 13-5602-BO, anonym analyse av historisk samling). Tabell 1 viser de histopatologiske trekk ved de 51 pasientene. Bare matchet tilstøtende ikke-neoplastisk, normalt vev (R
0) og tumor blokk par for hvert tilfelle ble inkludert. Alle tumor og sammenkoblede tumorfrie vev ble patologisk vurdering, klassifisert som kolorektal adenokarsinom (AC) og oppdelt i 1. konvensjonelle (definert som: 50% kjertel-formasjon, ingen slimstoffproduksjon), 2. mucinous (mer enn 50% ekstracellulært mucin), eller 3. kronisk UC-forbundet (noen histologisk variant). Subtype mest ofte observert hos UC-assosiert CRC var MAC (mer enn 50% ekstracellulært mucin) eller med vekselstrøm mucinous komponent ( 50% av lesjon bestående av mucin) (
n
= 10), mens resten var signet celle (
n
= 1) eller kjertel dannende AC (
n
= 2). Ingen av de konvensjonelle tumorer ble gradert som dårlig differensiert, sammenlignet med nesten to-tredjedel av mucinous (60%;
p
0,0001; Fisher eksakte test) eller mer enn en tredjedel av UC-assosierte (38%;
p
0,01; Fisher eksakt test) svulster. Alle prøvene (tumor vs R
0) fra UC pasienter viste mild til moderat betennelse.
Cellelinjer
Den menneskelige intestinal epitelceller (IEC) linje Caco-2 representerer en mye brukt modell for å studere molekylære hendelser som er involvert i differensiering og kreft progresjon skritt [34]. Generering og fenotyper av humane IEC linjer avledet fra Caco-2 (oppnådd fra ATCC cat # HTB-37; mye 1.537.739) stabilt transfektert med TLR4-WT eller TLR4-D299G ekspresjonskonstruksjoner har nylig blitt beskrevet i detalj [35]. Caco-2-TLR4-WT oppviser typiske morfologiske og funksjonelle egenskaper til den normale, modne enterocyte, og ble navngitt Caco-2
WT. Veksten mønster av Caco-2
WT er ikke-invasiv og IEC begynne å polar mot samløpet, kan sammenlignes med foreldre Caco-2. I motsetning til Caco-2-TLR4-D299G innta en aggressiv fenotype av kolon karsinom celler [35], og ble betegnet Caco-2
D299G. Den akselererende vekst av Caco-2
D299G er meget inngripende og IEC forbli i en udifferensiert tilstand til tross for samløpet. De beskrevne fenotyper ble tidligere er gjengitt i 3 kloner av Caco-2
WT og 3 kloner av Caco-2
D299G [35].
Flere cellelinjer avledet fra humane pasienter med kolorektal adenokarsinom ble kjøpt fra ATCC: LS 174T (cat # CL-188, mye 3.752.718), HT-29 (cat # HTB-38, mye 1.467.609), HCT-116 (cat # CCL-247, mye 60286831) og SW480 (katt # CCL- 228 [36]), som alle variabelt uttrykke MUC2 [37-39]. Caco-2, HT-29 og HCT 116 ble dyrket i høy glukose (4,5 g /L) DMEM (Life), SW480 i Leibovitz L-15 (Life) og LS 174T i EMEM (ATCC). Alle media ble supplert med 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Liv eller PAA) og 10% FBS (Thermo; mye RYF35911), med unntak av Caco-2, som fikk 20% FBS. Alle cellelinjer ble rutinemessig testet negativt for mycoplasma (MycoAlert
™; Lonza).
Plasmid konstruerer og stabil transfeksjon
kloner av EGFP-merket miExpress
™ forløper mirnas fra Mir -205 (cat # HmiR0026-MR04) og Mir-373 (cat # HmiR0347-MR04) og tilsvarende forløper miRNA egge kontroll klone (MIR-c) for vektor pEZX-MR04 (cat # CmiR0001-MR04) samt kloner av mCherry -tagged miArrest
™ miRNA hemmere av MIR-205 (α-MIR-205, cat # HmiR-AN1314-AM02), MIR-373 (α-MIR-373, cat # HmiR-AN0461-AM02) og tilsvarende miRNA inhibitor egge kontroll klon (α-MIR-c) for vektor pEZX-AM02 (cat # CmiR-AN0001-AM02) ble oppnådd fra GeneCopoeia (Rockville, USA). Plasmider (EndoFree Maxi, Qiagen) av mirnas ble stabilt transfektert inn enterocyte lignende Caco-2
WT og miRNA hemmere inn karsinom-lignende Caco-2
D299G, henholdsvis. Transfeksjon ble utført på en Poly-D-lysin belagt 12-brønns plate ved hjelp av 1 ug plasmid /brønn (Lipofectamine LTX, Thermo Fisher). Stabile subkloner ble valgt med 1 ug /ml blasticidin og 1-3μg /ml puromycin (InvivoGen). 14-34 subkloner per plasmid ble utvidet og screenet for EGFP /mCherry uttrykk av fluorescerende mikroskopi. Blant de 2-7 øvrige kandidater per plasmid, ble enkelte subkloner valgt basert på beste uttrykk nivåer av modne MIR-205 og MIR-373 ved hjelp av qPCR analyse.
Før eksperimenter, celler (0,7-3 x 10
5/2 ml) ble dyrket i 8 dager, med mindre annet er angitt. Kondisjonert medium fra Caco-2
D299G ble konsentrert ved hjelp Amicon Ultra-4 (3kDa) sentrifugalfilter Units (Millipore) og inkubert med Caco-2
WT 18 timer.
CD-en
nu /nu
xenograft modell
Dame CD-en
nu /nu
mus (Charles River) ble plassert under strenge patogenfrie forhold på Central Animal Facility, Universitetssykehuset Essen, Tyskland. Protokoller holdt den tyske loven om bruk av levende dyr og studien ble godkjent av Nordrhein-Westfalen State Agency for Natur, miljø og forbrukervern. Xenografting eksperimenter ble utført, som tidligere beskrevet [35]. Under isofluran-indusert anestesi, CD-en
nu /nu
mus (
n
= 4) i alderen ca 7 uker ble injisert
s
.
c
. inn i flankene med suspensjoner av 1 x 10
6 enkle celler i 200 ul av høy konsentrasjon Matrigel
® /PBS (1: 1). Mus ble injisert
i
.
p
. (0,5 mg i 500 ul) hver 5
th dag med polyklonale anti-asialo GM1 antistoff for å eliminere natural killer celle aktivitet. Svulster ble målt med digitale calipers og tumor volum (
V
) ble beregnet ved hjelp av formelen:
V
= 0,4 x
en
x
b
2 [
en
: lengde;
b
: bredde]. Alle mus ble avlivet ved cervikal dislokasjon. Svulster ble skåret etter 11 eller 23 dager fra drepte mus, delt i to, formalinfiksert og parafininnebygd, og tverrsnitt (5 nm) ble farget. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere dyrs lidelse og for å redusere antall dyr som brukes.
RNA /miRNA utvinning og realtime qPCR uttrykk analyse
Celleprøver ble frosset i hydroksy-benzotrizol (RNA) eller Qiazol ( miRNA) ved -80 ° C. Total RNA fra celler ble ekstrahert (RiboPure Kit, Thermo Fisher Scientific) og renset (RNeasy Kit, Qiagen). miRNA ble isolert ved hjelp av miRNeasy Kit (Qiagen). FFPE- vevsprøver ble kuttet i 10 nm-tykke seksjoner etter macrodissection (for å berike for region-of-interesse innhold etter behov). miRNA ble ekstrahert fra en til seks sekvensielle seksjoner fra samme parafinblokk ved hjelp av miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) med deparaffinization oppløsning (Qiagen) ifølge produsentens anvisninger. miRNA (1 ug) ble transkribert til cDNA ved hjelp av miScript II RT Kit (Qiagen). Realtime qPCR analyse ble utført ved hjelp av ett-trinns QuantiFast SYBR Grønn RT-PCR kit (Qiagen) på «Mastercycler ep realplex
2″ (Eppendorf) realtime forsterkning system. QuantiTect Primer Analyser (Qiagen) ble anvendt som den genspesifikke primer-par. miRNA uttrykket nivåer ble analysert ved hjelp miScript Primer Analyser (Qiagen) med miScript SYBR Grønn PCR Kit (Qiagen) på «Mastercycler ep realplex
2″ real-time system. Kopier antall individuelle transkripsjoner var knyttet til GAPDH (mRNA) eller RNU6 (miRNA) som endogene kontroller (x /100.000 eksemplarer) og normalisert som angitt.
Protein analyse av immunblot
Proteiner ble isolert fra dyrkede celler i iskald lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-X (Thermo Fisher Scientific) supplert med PhosSTOP fosfatase /komplett mini-protease-inhibitor blanding tabletter og 1 mM PMSF ( Roche)). Immunoblotting ble utført som beskrevet tidligere [36]. For å bekrefte lik protein lasting, ble geler farget med SimplyBlue (Thermo Fisher Scientific) og blotter ble reprobed med anti-GAPDH. Representative blotter på minst 2 uavhengige eksperimenter er vist.
ELISA
Konsentrasjoner av CHI3L1 og TFPI i cellekultursupernatanter ble bestemt ved hjelp av Human Chitinase-3-lignende en og Tissue Factor Pathway Inhibitor Quantikine ELISA kits (R E flekken og periodisk-syre Schiff (PAS) reaksjon etter standard protokoller
immunfluorescens
Celler ble dyrket på Poly-D-lysin 8-brønn kammer lysbilder… Avhengig av primære antistoffer (S2 tabell) ble cellene fiksert med paraformaldehyd (elektronmikroskopi Sciences) eller aceton (100%). Cellene ble blokkert i 60 min ved romtemperatur og inkubert med primære eller fluorescensmerkede antistoffer i et fuktet kammer o /n ved 4 ° C. AlexaFluor
® 647-konjugert geit-anti-kanin-antistoff ble anvendt som sekundært antistoff, om nødvendig. Kontrolleksperimenter ble utført med isotype kontroll IgG (Santa Cruz). Etter montering med Vectashield monteringsmedium med eller uten DAPI (Vector Laboratories), ble immunfluorescens farging vurdert ved hjelp av optisk snitting med konfokal (Axiovert 100M med LSM510) eller strukturelle belysning (Axio Observer.Z1 med ApoTome) mikroskoper (Zeiss). Den flerspors alternativet og sekvensiell skanning for hver kanal ble brukt til å eliminere krysstale av chromophores.
Immunohistochemistry.
xenograft FFPE-seksjoner ble farget i henhold til produsentens instruksjoner (cellesignalisering) .
TEM.
Cellene ble dyrket i 8 dager på innsatser (0.4μm pore størrelse), festes med iskald 2% glutaraldehyd og videre behandlet av TEM Kjerne Facility, Heinrich-Heine University, Düsseldorf, Tyskland. I korte trekk ble cellene post-fiksert i osmiumtetroxid i Millonig`s fosfatbuffer, i kontrast til uranylacetate, dehydrert med økende konsentrasjoner av etanol og innleiret i Spurr. Seksjoner ble kuttet på en ultramicrotome og mikro-tegnes med en transmisjonselektronmikroskop (Hitachi-H600) på 75kV (5000X forstørrelse).
Analyse av celle adhesjon, invasjon, spredning og chemoresistance
Cell vedheft.
Redusert inter klebrighet kan tillate kreft invasjon og metastasering av celledissosiasjon fra kreft reir. Differensierte epitelceller, som danner tette celle-celle og celle-substrat foreninger, er trypsin-resistente, mens mesenchymalceller, som mangler disse vedheft mekanismer, er trypsin-sensitive [40]. For å teste om MIR-205 og MIR-373 kan redusere vedheft, vi brukte differensial trypsinering analysen. For vurdering av celleadhesjon ved differensiell trypsinering ble cellene dyrket på poly-D-lysin 8-brønners kammerobjektglass i 3 dager, vasket en gang og deretter inkubert med 0,05% trypsin /0,02% EDTA (PAN-Biotech) etter 2 min. Enzymatiske reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av hele kulturmediet. Gjenværende cellene ble fiksert med 3,7% paraformaldehyde i 15 minutter og farget med Mayers hemalum løsning (Merck).
Invasion.
Når kreftceller er i stand til å distansere seg fra den primære svulsten, de kan invadere omkringliggende vev. For tumorcelle invasjon [35], celler (1,3 x 10
5/2 ml) ble dyrket på BD BioCoat Matrigel
®-precoated seks-brønns transwells i 25 dager. Celler invaderende membranen ble metanolfiksert og farget med 0,26% krystallfiolett (Sigma).
spredning og chemoresistance.
Klinisk legemiddelresistens av svulster kan tillate sykdomsprogresjon. Vi undersøkte basal celle spredning og følsomhet for rutine kjemoterapi (MTX) av Cell Titer 96
® AQ
ueous One Solution (MTS-basert) Cell Proliferation Assay fra Promega.
Bildeanalyse
For histopatologi, immunhistokjemi, cytologi (celle adhesjon og invasjon analyser), ble høyoppløselige bilder tatt ved hjelp av Aperio ScanScope system (Aperios Technologies) og visualisert ved hjelp av image omfang (versjon 11.2.0.780, ImageScope). For immunfluorescens mikros kjøpte bildene ble behandlet ved hjelp LSM510 v3.2 eller ZEN Blå 2012 (Carl Zeiss) programvare. I alle forsøkene ble minst 4 individuelle områder av bildefangst valgt tilfeldig for hver prøve. Morfologiske resultater ble betraktet som signifikant bare hvis minst 70% av de skannede snitt per felt utstilt observerte effekten.
Statistisk analyse
Fisher eksakte test ble brukt for krysstabeller for å sammenligne pasient proporsjoner. Den Wilcoxon signed-rank test ble brukt for å sammenligne miRNA uttrykket mellom matchet par av humane tumorer og normalt vev i samme kreftgruppen. Den uparet t-test ble anvendt for å sammenligne miRNA uttrykk mellom ulike kreft undergrupper og i alle andre eksperimenter, hvis ikke annet er angitt. Alle testene ble tosidige (GraphPad Prism programvare versjon 5.04) og en
p
verdien av 0,05 ble ansett som signifikant. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.
Resultater
Expression nivåer av MIR-205 og MIR-373 er økt i mucin produserende humane tykktarm kreft
Vi undersøkte rollen MIR-205 og MIR-373 i patofysiologien av ulike histologiske subtyper av tykktarmskreft ved å vurdere deres uttrykk, sammen med den andre miRNAs, i prøver av konvensjonelle, mucinous og UC-assosiert menneskelige kolon adenokarsinom. Bare matchet tumorvev med tilstøtende ikke-neoplastiske, normale kirurgiske marginer (R
0) for hver pasient ble undersøkt. Expression nivåer av MIR-205 og MIR-373 ble spesielt økt i de to undergrupper av colonic adenokarsinom forbundet med mucin produksjon (mucinkjertler og kroniske UC-relaterte kolorektal kreft) i forhold til tilstøtende normal tarmslimhinnen (Fig 1A og 1B). Av notatet uttrykk for MIR-205 var noe høyere i UC-assosiert kreft sammenlignet med (ikke-UC) mucinous kreft. Ingen signifikante forskjeller i MIR-205 og MIR-373 ekspresjon ble påvist i sammenkoblet colonic tumorvev og tilsvarende normal slimhinne fra pasienter med konvensjonelle kolon adenokarsinom (non-mucinous). Begge mirnas var like uttrykt ved lave nivåer over kreftfrie colonic vev mellom de tre undergrupper av pasienter. I kontrast, MIR-1, MIR-10a og MIR-133a ble nedregulert i menneskelige CRC tumorvev, uavhengig av histologisk subtype (S1 A, S2A og S3A figurene).
Expression nivåer av (A) speil 205 og (B) MIR-373 er betydelig oppregulert i menneskelig mucinous (
n
= 20) og kronisk UC (
n
= 13) CRC kreft områder sammenlignet med matchet R
0 marginer, som bestemmes av qPCR. I kontrast er ingen signifikante forskjeller i MIR-205 og Mir-373 uttrykk observert mellom paret vanlig CRC (
n
= 18) svulstvev og tilsvarende normal slimhinne. (C) Mens enterocyte lignende Caco-2
WT viser lave nivåer av MIR-205 og Mir-373 uttrykk, både mirnas er betydelig oppregulert i kolon karsinom-lignende Caco-2
D299G celler, som vurdert av qPCR . (D) Transfeksjon effektiviteten av MIR-205 /MIR-373 forløpere eller hemmere er bekreftet av qPCR i nylig generert (se Materialer og Metoder) Caco-2
WT /MIR-205, Caco-2
WT /MIR -373, Caco-2
D299G /a-MIR-205 og Caco-2
D299G /α-MIR-373 kloner (n = 3 per klone). Resultatene er vist i forhold til RNU6 miRNA uttrykk. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (ns: ikke signifikant, *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0.001, ****
p
0,0001, A, B: Wilcoxon signed-rank test for sammenligning mellom matchet grupper (R
0 vs. svulst), ellers uparet t-test; C, D:. uparet t-test)
Klinisk mucinkjertler tykktarm kreft vises en mer progressiv tumorstadium distribusjon ved førstegangsdiagnose sammenlignet med konvensjonell eller UC-assosiert CRC (tabell 1). Avansert sykdom med fjerne organ metastaser ved diagnosetidspunktet ble hyppigere observert i CRC pasienter med mucinous subtype enn hos pasienter med konvensjonelle eller kroniske UC svulster. Vi har imidlertid ikke identifisere noen sammenhenger mellom MIR-205 og Mir-373 uttrykk nivåer og kreft etapper (inkludert histologisk grad) i noen subtype.
Uttrykk av MIR-205 og MIR-373 er oppregulert i colon carcinoma celler
in vitro
Neste, vi forsøkte å fastslå effekten av MIR-205 og MIR-373 på cellebiologi og funksjon i normal og neoplastisk tarmepitelet
in vitro
. Vi har tidligere etablert to
in vitro
modeller av menneske polarisert, enterocyte-lignende (Caco-2
WT) og udifferensiert, tykktarmskreft-lignende (Caco-2
D299G) celler [35 ], som beskrevet i
Materialer og metoder
. Ved hjelp av sanntids qPCR, fant vi (figur 1C) som Caco-2
WT viste lave nivåer av MIR-205 og Mir-373 uttrykk, mens begge mirnas var signifikant oppregulert i Caco-2
D299G. Videre MIR-1, MIR-10a og MIR-133a ble markert redusert i Caco-2
D299G forhold til Caco-2
WT (S1B, S2B og S3b figurene). Vi har også undersøkt andre CRC linjer, men de klarte ikke å avsløre miRNA uttrykk mønstre som ligner på de som ble observert i menneskets tarmvevet (S4 fig). Vi bestemte oss for å fortsette å bruke disse IEC underlinjer (Caco-2
WT og Caco-2
D299G), fordi de ideelt sett speiler våre miRNA uttrykk resultatene av sammenkoblede normale og mucinkjertler kolorektal adenokarsinom prøver fra pasienter.
Bruke stabil transfeksjon med miRNA forløpere eller hemmere, vi generert (se Materialer og Metoder) MIR-205-uttrykke og MIR-373-uttrykke Caco-2
WT kloner (Caco-2
WT /MIR-205; Caco-2
WT /MIR-373) samt MIR-205-hemmende og MIR-373-hemmende Caco-2
D299G kloner (Caco-2
D299G /α-MIR-205; Caco -2
D299G /α-MIR-373). Som negative kontroller, eggevektor uttrykke kloner ble brukt (Caco-2
WT /MIR-c; Caco-2
D299G /α-MIR-c). Den overuttrykt pre-MIR-205 og pre-MIR-373 ble vellykket behandlet for å øke uttrykket av modne MIR-205 og MIR-373 i Caco-2
WT, henholdsvis som bekreftes av qPCR analyse (figur 1D). Overekspresjon av Mir-205- og MIR-373- hemmere førte til redusert uttrykk av moden MIR-205 og MIR-373 i Caco-2
D299G.
MIR-205 induserer økt slimstoffproduksjon, mens MIR-373 bevirker dedifferentiation
Som vist i figur 2A-2D, styre klon Caco-2
WT /mir-c viste en søyleformet monolag av normal, polarisert IEC med vanlig mucin produksjon, mens kontrollgruppen klone Caco-2
D299G /α-MIR-c viste en flat monolag av neoplastisk, udifferensierte celler med mindre mucin produksjon. Stabil overekspresjon av MIR-205 i Caco-2
WT indusert dannelse av sekretoriske celler som inneholder store blemmer med bleke LUCENT innholdet opptar nesten hele cytoplasma (figur 2A). Mucin produksjon ble oppdaget av PAS (figur 2B) og TEM viste store blemmer i den apikale cytoplasma med mindre elektron-tett materiale (Fig 2C), som tyder på slimet stoffer. Immunofluorescensanalyse bekreftet økt produksjon av MUC2 i Caco-2
WT /MIR-205 (figur 2D). I kontrast, overekspresjon av MIR-373 i Caco-2
WT indusert trekk ved dårlig differensierte, heterogene celler som vokser i flate ark, som lignet neoplastiske Caco-2
D299G /α-MIR-c (Fig 2A-2D ). Undertrykkelse av MIR-373 reversert noen av de neoplastiske egenskapene til Caco-2
D299G. Stabilt hemming av MIR-373 i Caco-2
D299G førte til organisering av polariserte epitelceller, som lignet differensiert Caco-2
WT /MIR-c (Fig 2A-2D).
( AD) Caco-2
WT overekspresjon MIR-205 eller MIR-373 skjerm betydelige morfologiske forandringer i forhold til å kontrollere Caco-2
WT /MIR-c. I kontrast, undertrykkelse av MIR-373 reverserer noen av de neoplastiske egenskapene til Caco-2
D299G. Representative bilder (
n
≥ 2 prøver /klone) viser (A) H E farging (bar, 200 um), (B) PAS (bar, 200 um), (C) TEM (bar, 5 um) og (D) immunfluorescens farging med anti-MUC2 (AlexaFluor
® 647, gul) og DAPI (blå), vurdert av optisk snitting mikroskopi (bar, 50 pm), vises. Svart stjerne indikerer vesikkel (C); hvite piler indikerer slim (B) eller MUC2 (D) -positive strukturer.
MIR-205 og MIR-373 forstyrre tarm epitelial barriereintegritet
For ytterligere å forstå de morfologiske forandringer indusert av MIR-205 og MIR-373, utførte vi en serie med immunfluorescens farging eksperimenter for å vurdere virkningene på strukturelle organiseringen av aktin cytoskjelettet (figur 3A), fordeling av barriere-forbundet tight junctional ZO-1 (figur 3B) og fosfo p-catenin (figur 3C) og dannelsen av den mitotiske spindel (figur 3D). Overekspresjon av MIR-205 i Caco-2
WT mediert forstyrrelse av aktin-baserte cytoskjelettet og redusert ekspresjon av ZO-1 i cellemembranen, men endret ikke mitotiske figurer. Overekspresjon av MIR-373 i Caco-2
WT forårsaket avbrudd og uregelmessig omfordeling av aktin filamenter, stram junctional ZO-1 og fosforylert β-catenin til cytoplasma, noe som tyder på nedsatt tarm epitelial barriere og gjerde funksjon. Videre forstørrede kjerner av Caco-2
WT /MIR-373 avdekket grove forstyrrelser av den mitotiske spindel, kan sammenlignes Caco-2
D299G /α-MIR-c. I motsetning til inhibering av MIR-373 i Caco-2
D299G fremmes epitelial innstramming av apikale polarisering av aktin filamenter og re-etablering av ZO-1- og fosfo-β-CATENIN- forbundet barriereintegritet, og dermed redusere mesenchymale fenotype av dårlig differensiert Caco-2
D299G. Bemerkelsesverdig, Caco-2
D299G /α-MIR-373 viste normale mitotiske meta, kan sammenlignes Caco-2
WT /MIR-c. Men hemming av MIR-205 i Caco-2
D299G ikke endre fibroblast-lignende utseende med aktin cytoskeletal uorden, cytoplasma omfordeling av ZO-1 og avvikende mitotiske tall.
Uttrykk av MIR-205 og MIR-373 differensielt (A) forandrer aktin cytoskeletal arkitektur påvirkninger (B) ZO-1 og (C) fosfor-β-catenin -associated barriereintegritet, og (D) induserer dannelse av flerkjernede celler med multipolar spindler. Representative bilder (
n
≥ 2 prøver /klone) av immunfluorescens farging med (A) phalloidin (AlexaFluor
® 647;
hvit
, gul bar, 20.29μm [3-dimensjonal avstand ], hvit bar, 100 um), (B) anti-ZO-1 (AlexaFluor
® 647;
hvit
, bar, 50 pm) og DAPI (
blå
), (C ) fosfor-β-catenin (AlexaFluor
® 647;
grønn
, bar, 50 pm) og DAPI (
rød
) og (D) anti-fosfor-histon H3 (PacificBlue <
