Abstract
Endring av kreftcelle mot mesenchymale fenotype har blitt vist å forsterke tumor aggressivitet ved å øke kreftcelle metastasering. Heri, rapporterer vi effekten av triklosan, et mye brukt antibakterielt middel som finnes i mange daglige produkter, i å forbedre epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) i aggressive anoikis resistente menneskelige H460 lungekreftceller. EMT har lenge vært kjent for å øke egenskaper i cellene for å øke migreringen, invasjon, og overlevelse i sirkulasjonssystemet. Denne studien viser at behandling av kreft celler med triklosan på fysiologisk relaterte konsentrasjoner betydelig økt kolonien antall kreftceller vurderes av svulstdannelse analysen. Dessuten ble det observert at mesenchymale-lignende morfologi, og reduksjon i celle-til-celle-adhesjon i triklosan-behandlede celler. Viktigere, western blot analyse viste at triklosan-behandlede celler utviste redusert E-cadherin, mens nivåene av EMT markører, nemlig N-cadherin, vimentin, snegl og slug ble funnet å være signifikant oppregulert. Videre EMT indusert av triclosan behandling ble fulgt av aktivering av fokal adhesjonskinase /ATP-avhengige tyrosin kinase (FAK /Akt) og Ras-beslektede C3 botulinumtoksin substrat 1 (Rac1), som forbedret evne til celler til å migrere og invadere . I konklusjonen, vi demonstrert for første gang at triklosan kan potensere kreftceller overlevelse i frittliggende tilstand og motilitet via prosessen med EMT. Som nevnt evner er nødvendig for å lykkes i metastase, denne studien gir romanen toksikologisk informasjon og oppfordrer bevissthet om triklosan bruk hos kreftpasienter
Citation. Winitthana T, Lawanprasert S, Chanvorachote P (2014) Triklosan forsterker epitel-To-Mesenchymale Overgang i Anoikis-Resistant humane lungekreftceller. PLoS ONE 9 (10): e110851. doi: 10,1371 /journal.pone.0110851
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 21 juli 2014; Godkjent: 24 september 2014; Publisert: 16 oktober 2014
Copyright: © 2014 Winitthana et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Thailand forskningsfond (til PC) (https://www.trf.or.th), Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund of Chulalongkorn University ( RES560530132-HR), den 90. årsdagen for Chulalongkorn University Fund (Ratchadapiseksomphot Endowment Fund), og Chulalongkorn University Graduate Scholarship for å minnes den 72. årsdagen for Hans Majestet kong Bhumibol Adulyadej (https://www.grad.chula.ac.th/eng /stipend). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den kjente bredspektret anti-bakterielle middel triklosan (2,4,4 «triklor-2′-hydroksydifenyleter, TCS) (figur 1A) har blitt kommersielt benyttet i en rekke produkter for å hemme veksten av bakterier, sopp, mugg og [1], [2]. TCS har blitt brukt under regulering av Food and Drug Administration (i kosmetikk, deodorant, hånd såper, tannkrem) samt Environmental Protection Agency (i materialer konserveringsmiddel innlemmet i husholdningenes plast og tekstiler) [2], [3]. Anvendte konsentrasjoner av TCS i forskjellige produkter kan variere; imidlertid nivåene i de fleste personlig pleie produkter spenner 0,1 til 2% [1], [3]. Det faktum at signifikante nivåer av TCS kan påvises i plasma hos TCS-eksponerte human ved en konsentrasjon i området fra 0,02 og 20 pg /ml (0,069 og 69 uM) fører til mulig oppfatning at dette middel kan muligens påvirke human fysiologi [4 ].
(A) Den kjemiske strukturen til TCS. (B) Flercellede aggregering av anoikis resistente H460 celler. Scale bar er 1000 mikrometer. (C-D) Etter behandling med TCS (0-10 uM) i 24 timer ble den prosentandel av cellenes levedyktighet bestemt ved MTT-analysen, og andelen av apoptotiske celler ble påvist ved farging Hoechst33342, respektivt. Verdier er gjennomsnitt av de tre uavhengige triplikatprøvene ± SE. *
P
0,05 versus ikke-behandlet kontroll. (E) Etter den angitte behandling, atom morfologien til cellene ble påvist ved Hoechst33342 /PI co-farging assay og visualisert under et fluorescensmikroskop. Scale bar er 50 mikrometer. (F) Celler ble behandlet med TCS (0 til 7,5 pM) i 24, 48 eller 72 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. Dataene representerer hjelp av de tre uavhengige triplikate prøver ± SE. *
P
0,05 versus ikke-behandlet kontroll ved hver angitt tid. (G-H) Celler ble behandlet med TCS (0 til 7,5 pM) i 48 timer. Cellesyklus av TCS-behandlede celler ble bestemt ved PI farging og flowcytometri. *
P
. 0,05 versus ikke-behandlet kontroll
Med fokus på kreft, up-to-date informasjon har påpekt at TCS har ubetydelige effekter på kreftutvikling og direkte genmutasjon [2], [5], [6]. Men med tanke på at TCS er et stoff som folk kan bli utsatt for i en lang periode i livet, er det viktig å forstå de mulige virkningene av denne agenten ikke bare på kreftutvikling, men også den mulige innvirkning på kreftcelle atferd. Nylige studier har antydet at overgangen av cellulær fenotype fra epitelial til mesenchymale heter epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) er en kritisk faktor i å tilrettelegge metastasering av mange kreftformer [7] – [9]. EMT har fått stor oppmerksomhet i kreftrelatert forskning og EMT har blitt anerkjent som et kjennetegn på kreft stemness samt aggressivitet [10]. EMT prosess har ført til endring av celle oppførsel som, i de fleste tilfeller forbedrer evnen til å metastasere, inkludert forsterkes migrering av celler fra den primære tumor, og økt resistens mot apoptose [11] – [13].
de fleste bevis har antydet at under populasjon av kreftceller som oppviser anoikis motstandsdyktig egenskapen er de fleste av cellene som gjennomgår vellykket metastase [14] – [18]. Anoikis resistente celler er også kjent som sirkulerende tumorceller (CTCs) [19]. I klinisk praksis har CTCs vært ansett for å være en potensiell biomarkør som gjenspeiler kreft aggressivitet av mange typer av kreft inkludert bryst, prostata, kolorektal, blære, mage, lever og lunge-kreft [20] – [24]. Tilstedeværelsen og mengden av CTCs i perifert blod har vist seg å korrelere godt med dårlig prognose i kreftpasienter [19], [20]. Befolkningen i CTCs vise heterogene celle fenotyper inkludert epitel, mesenchymale, og disse fenotyper i en overgangstilstand fra epitelial til mesenchymale [20], [24] – [27]. Som prosessen med EMT resulterte i mesenkymale fenotyper med økning metastase potenser inkludert anoikis motstand og invasiv evne celler [14], [20], [23] faktorer eller stimuli som letter dette EMT i CTCs kan endre fenotyper av CTCs befolkningen og påvirker metastase potensialene av cellene. Som CTCs er funnet i den systemiske sirkulasjon [19], [24], [28], cellene sannsynligvis vil bli utsatt for flere kjemikalier som finnes i blodet. Basert på et slikt problem, er flere forbindelser er undersøkt og rapportert å ha en EMT-induserende egenskap, for eksempel TGF-β [29], [30], epidermal vekstfaktor [31], [32], celecoxib [33] gefitinib [ ,,,0],34] og seksverdig krom [35].
Selv om nærværet av visse konsentrasjoner av TCS har blitt rapportert i humane kretsløp, er den informasjon angående effekten av et slikt middel på EMT fremgangs CTCs fremdeles i stor grad ukjent. Denne studien tar sikte på å undersøke effektene samt mulige effekter av denne forbindelsen på aggressive populasjon av lungekreft celler. Bedre forståelser hentet fra denne studien kan bidra til tryggere bruk av TCS og gi ny vurdering tilnærminger for kreftrelatert toksisitet.
Materialer og metoder
1. Celler og reagenser
NCI-H460 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Kreftcellene ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Life Technologies, MD, USA) i 37 ° C med 5% CO
2 fuktet inkubator. Triklosan ble hentet fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). TCS ble fortynnet med sterilt medium for å oppnå arbeidskonsentrasjon med 0,1% DMSO i den endelige oppløsning. Når det gjelder de kilder til reagenser, Hoechst33342, propidiumjodid (PI), phalloidin tetramethylrhodamine B isotiocyanat, ble bovint serumalbumin (BSA) og dimetylsulfoksyd (DMSO) levert fra Sigma (St. Louis, MO, USA). 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble kjøpt fra Gibco (Life Technologies, MD, USA). Matrigel ble hentet fra BD Biosciences, Inc. (Woburn, MA, USA). BCA assay kit og Supersignal vest pico kjemiluminescens ble hentet fra Thermo Scientific, Inc. (Rockford, IL, USA). Rabbit monoklonale antistoffer for E-cadherin, N-cadherin, vimentin, slug, snegle, Akt, fosforylert Akt (S473), brennvidde heft kinase (FAK), fosforylert FAK (Y397), β-aktin, konjugert anti-kanin IgG og peroksidasekonjugert anti-muse-IgG ble erholdt fra Cell Signaling (Denvers, MA, USA). Mus monoklonale antistoffer for Aktiv Rac1-GTP og Active Rho-GTP ble oppnådd fra NewEast Biosciences (Malvern, PA, USA). Immobilon Western kjemiluminescens HRP substrat ble hentet fra Millipore, Corp (Billerica, MA, USA) og Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL, USA).
2. Anoikis resistente celler
Anoikis resistente cellekulturen ble utført i henhold til fremgangsmåten ifølge Sakuma et al. [36] og Khongmanee et al. [37] med mindre modifikasjoner. I korte trekk, ble festet H460-celler trypsinisert når cellene nådde 80-90% konfluens med 0,05% trypsin /0,02% EDTA. Deretter ble cellene dyrket i ultralav feste 6-brønners plate (Corning Costar, MA, USA) i RPMI-1640 medium, mens andre betingelser som er beskrevet for fastgjøring kultur ble opprettholdt. Celler ble dyrket ved en tetthet på 2 x 10
5 celler /ml i 48 timer. Suspenderte celler ble deretter samlet opp og klargjort til en enkelt cellesuspensjon ved 1 mM EDTA-behandling. Deretter ble cellene vasket med fullstendig RPMI-1640 medium. Celleviabilitet ble målt ved hjelp av automatisert celleteller. Levedyktige celler ble brukt for videre eksperimenter.
3. Celleviabilitet assay og celleproliferasjonsanalyse
celler levedyktigheten ble bestemt ved MTT-assay. Celler ble sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
4 celler /brønn på 96-brønners plate over natten. Deretter ble de behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TCS i 24 timer. Etter behandlingen ble mediet deretter erstattet med MTT-løsning (5,0 mg /ml i PBS) og inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Deretter ble mediet erstattet med 100 ul DMSO for å oppløse formazanprodukt og intensiteten av formazanprodukt ble målt ved 570 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (Anthros, Durham, NC, USA). Cellelevedyktigheten ble uttrykt som prosent beregnet fra den optiske tetthet av behandlede celler i forhold til de styrte cellene. I mellomtiden ble celle proliferativ effekt bestemmes også ved hjelp av MTT-analyse. Celler ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
3 celler /brønn i 96-brønns plate og inkubert over natten. Etter dette ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TCS i 0, 24, 48 og 72 timer. Celleproliferasjon ble målt ved MTT-analyse som beskrevet i celleviabilitet vurderingen.
4. Nuclear farging analysen
apoptotisk og nekrotisk celledød ble bestemt av Hoechst33342 og PI co-farging. Celler ble sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
4 celler /brønn på 96-brønns plate og inkubert over natten. Cellene ble deretter behandlet med TCS i 24 timer. Etter bestemte behandlinger, ble celler inkubert med 10 ug /ml Hoechst33342 og 5 ug /ml PI i 30 minutter ved 37 ° C. De apoptotiske celler som har kondensert kromatin og /eller fragmentert kjerner og PI-positive nekrotiske celler ble visualisert og scoret under et fluorescens mikroskop (Olympus IX51 med DP70, Olypus America Inc., Center Valley, PA, USA).
5. Cellesyklusanalyse
Etter behandling av cellene med TCS i 48 timer ble cellene trypsinert og fiksert med 70% absolutt etanol ved -20 ° C over natten. cellene ble deretter vasket med kald PBS og inkubert i PI oppløsning inneholdende 0,1% Triton-X, 1 ug /ml RNase, og 1 mg /ml propidiumjodid ved 37 ° C i 30 minutter. DNA i hele celler ble farget med PI og cellesyklusprofil ble analysert ved hjelp av strømningscytometri (FACSort, Becton Dickinson, Rutherford, NJ, USA).
6. Kolonidannelse assay
Ved behandling med TCS, ble krings-uavhengig vekst undersøkt via kolonidannelse analysen i samsvar med fremgangsmåten ifølge Koleske et al. [38] med mindre modifikasjoner. I korthet ble cellene behandlet med TCS ved ikke-toksiske konsentrasjoner i 24 timer og deretter behandlet med 1 mM EDTA for å fremstille enkeltcelle-suspensjon. Cellene ble suspendert i RPMI-1640 inneholdende 10% FBS og 0,33% agarose, deretter 250 ul inneholdende 1 x 10
3-celler ble innleiret i et andre lag i en 24-brønners plate i løpet av et 500 mL basislag inneholdende 10% FBS og 0,5% agarose. Cellene ble matet hver 3. dag ved å tilsette 250 ul av fullstendig medium. Etter 7 og 10 dager ble de resulterende kolonier fotografert ved x 4 forstørrelse. Colony nummer og kolonistørrelse ble bestemt på 10
th dag med kultur.
7. Filopodia karakterisering
Filopodia var preget av phalloidin-rhodamine flekker analyse som beskrevet i Kowitdamrong et al. [39]. Celler ble behandlet med TCS ved ikke-toksiske konsentrasjoner i 24 timer i løsne tilstand og sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
3 celler /brønn på 96-brønners plate i 4 timer. Cellene ble deretter vasket med PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved 37 ° C, permeabilisert med 0,1% Triton-X100 i PBS i fire minutter, og blokkert med 0,2% BSA i 30 minutter. Etter dette ble cellene inkubert med 1:100 phalloidin-rhodamin i PBS i 15 min og vasket med PBS 3 ganger. Filopodia ble så fotografert ved en fluorescens mikroskop (Olympus IX51 med DP70).
8. Migrasjon analysen
Migrasjon ble bestemt av Boyden kammeret analysen som tidligere beskrevet i Kowitdamrong et al. [39]. Cellene ble forbehandlet med TCS på ikke-toksiske konsentrasjoner i 24 timer i frittliggende tilstand. Deretter ble cellene sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn på en øvre 24-transwell plate av transwellfilteret (8-uM porestørrelse) i mediet inneholdende 0,1% serum og 500 ul av fullstendig medium var tilsatt til det nedre kammer. Etter 24 timer ble de ikke-migrerte celler i oversiden membranen fjernet ved avtørking bomullsdott. Cellene som migrerte til undersiden av membranen ble farget med 10 ug /ml Hoechst33342 i 30 min. Cellene ble deretter visualisert og scoret under et fluorescens mikroskop (Olympus IX51 med DP70).
9. Invasjon assay
invasjonen-analysen ble utført ved anvendelse av 24-Transwell kamre som tidligere beskrevet i Kowitdamrong et al. [39]. Transwells ble belagt med 50 ul av 0,5% matrigel på den øvre flate av kammeret og inkubert over natten ved 37 ° C i en fuktet inkubator. Etter behandling med TCS ved ikke-toksiske konsentrasjoner i 24 timer i frittstående tilstand, ble cellene sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn på det øvre kammer i medium inneholdende 0,1% serum og 500 ul av fullstendig medium var tilsatt til det nedre kammer. Etter 24 timer ble de ikke-invaderte celler i oversiden av membranen fjernet ved avtørking bomullsdott. Invaderte celler ved basolateral side av membranen ble fiksert med kald absolutt metanol i 10 minutter og farget med 10 ug /ml Hoechst33342 i 30 min. Cellene ble deretter visualisert og scoret under et fluorescens mikroskop (Olympus IX51 med DP70).
10. Western blot-analyse
Etter bestemte behandlinger, cellene ble inkubert i en lyseringsbuffer inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1,5% Triton X-100, 150 mM natriumklorid, 10% glycerol, 1 mM natrium orthovanadate, 50 mM natrium fluorid, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, og en kommersiell proteasehemmer blandingen (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) i 2 timer på is. Cellelysater ble oppsamlet, og proteininnhold ble bestemt ved anvendelse av Bradford fremgangsmåten (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Like mengder av protein fra hver prøve ble denaturert ved oppvarming ved 95 ° C i 5 minutter med ladningsbuffer og deretter applisert på en 7,5% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese for påvisning av EMT markører og E-cadherin ekspresjon eller 10% SDS-polyakrylamid- gelelektroforese for påvisning av trekkrelatert protein ekspresjon. Etter separering ble proteinene overført på 0,45 uM nitrocellulosemembraner. De overførte Membranene ble blokkert i 5% fettfri tørrmelk i TBST (25 mM Tris-HCL (pH 7,5), 125 mM NaCl, 0,05% Tween 20) i 1 time, og deretter inkubert med et spesifikt primært antistoff (1: 1000 fortynning) over natten ved 4 ° C. Membranene ble vasket tre ganger med TBST i 5 min og inkubert med pepperrotperoksydase-koplede isotype-spesifikke sekundære antistoffer (1:2,000 fortynning) i 2 timer ved romtemperatur. Membranene ble vasket tre ganger med TBST i 5 min, og immunkompleksene ble detektert ved forsterkning med et kjemiluminescerende substrat og kvantifiseres ved hjelp av analytiker /PC Tetthetsmåling programvare (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
11. Statistisk analyse
Data ble hentet fra tre uavhengige forsøk og presenteres som betyr ± standardfeil (SE). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av enveis ANOVA og post hoc test (Tyrkias test) ved et signifikansnivå på
P
-verdier 0,05. SPSS 17.0 ble brukt for alle statistiske analyser.
Resultater
1. Effekter av TCS på anoikis resistente H460-celler
Anoikis resistente kreftceller ble benyttet som en modell for å studere CTCs [36], [37], [40]. Anoikis motstandsdyktig lungecancerceller ble samlet som beskrevet i Materialer og Metoder. Det ble funnet at frittliggende H460-celler som spontant dannes flercellede aggregater etter dyrkning i 48 timer (figur 1B). For å belyse den mulige effekten av TCS på CTC lungekreftceller, ble cytotoksiske effekten av forbindelsen på cellene først karakterisert. TCS ved de konsentrasjoner som varierer fra 0,069 og 69 uM ble funnet i plasma hos TCS-eksponerte [4]. Derfor ble de anoikis resistente celler ble inkubert med TCS ved konsentrasjoner på 0-10 uM i 24 timer og cellelevedyktigheten bestemt ved MTT-analyse. Figur 1C viser at TCS behandling signifikant redusert celleoverlevelse ved en dose på 10 uM til omtrent 80% av cellene gjenværende levedyktige, mens behandling av cellene med TCS på 0-7.5 uM forårsaket ingen signifikant toksisk effekt. Hoechst33342 /PI farging analysen bekreftet at apoptose og nekrose var ikke påvises i TCS-behandlede celler på 0 til 7,5 mikrometer. Den apoptotiske celler med fragmenterte eller kondenserte kjerner ble bare påvist i celler behandlet med 10 uM TCS (figurene 1D og E). Derfor ble konsentrasjonen av TCS ved 0-7.5 uM anvendt for følgende eksperimenter.
Ved å vise den toksiske effekten av TCS på anoikis resistente celler, vi neste undersøkte effekten av TCS på celleproliferasjon og cellesyklusen. Celler ble behandlet med ikke-toksiske konsentrasjoner av TCS på 0-72 h og proliferasjon av cellene ble bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Proliferasjon reaksjon av anoikis resistente celler til TCS er vist i figur 1F. TCS-behandlede celler viste ingen signifikant forskjell i forhold til celleproliferasjon sammenlignet med de ikke-behandlede kontrollceller. Disse resultatene ble bekreftet ved cellesyklusanalyse ved anvendelse av PI og flowcytometri. Resultatene indikerte at TCS behandling forårsaket ingen signifikant effekt på cellesyklusen (fig 1G og 1H). Sammen resultatene antydet at TCS besatt uten proliferativ effekt på anoikis resistente H460-celler i normalt dyrkings tilstand.
2. TCS fremmer cellevekst i forankrings-uavhengig måte
Fordi forankrings-uavhengig vekst av kreftceller er blitt vist å forsterke metastase, vi neste undersøkte effekten av TCS på kreftcellevekst i en slik tilstand. Ved å gjøre dette, anoikis resistente celler H460 ble behandlet med TCS i 24 timer før de ble utsatt for kolonidannelse analysen. Cellene ble deretter sådd ut i agarose lag for å forhindre celle-celleinteraksjon og vedlegg. Koloni nummer og kolonistørrelse ble oppnådd ved å fotografere og teller etter at cellene ble dyrket i 7 og 10 dager. Den kolonidannelse ble vist i figur 2A. Koloni nummer og kolonistørrelse av hver behandling ble beregnet som en prosent av kontrollgruppen, og er vist i figur 2B og C, respektivt. Resultatene indikerte at TCS ved konsentrasjoner på 5 og 7,5 uM betydelig økt kolonidannelse av anoikis resistente H460-celler. Imidlertid TCS ved begge konsentrasjoner vesentlig redusert kolonistørrelse i forhold til den ikke-behandlede kontrollgruppe. Slike observasjoner indikerte at TCS fremmet forankrings-uavhengig overlevelse av cellene, men reduserte veksten av cellene i frittstående tilstand. Våre resultater består med tidligere funn om at økningen i forankringsuavhengig overlevelse med lav proliferativ evne har blitt observert i kreftcellene gjennomgår EMT [11], [12], [41], [42].
(a) Celler ble forbehandlet med TCS (0 til 7,5 pM) i 24 timer og utsatt for bløt agar-kolonidannelse assay, som beskrevet i «Materialer og metoder». Representative felt fra tre uavhengige eksperimenter ble fotografert etter at cellene ble dyrket i 7 og 10 dager. Scale bar er 1000 mikrometer. (B-C) Colony nummer og kolonistørrelse ble bestemt etter bilde analysator på 10
th dag med kultur. Verdier er gjennomsnitt av de tre uavhengige triplikatprøvene ± SE. *
P
. 0,05 versus ikke-behandlet kontroll
3. TCS inhibere celle-celle-interaksjon
Tap av celle-celle adhesjon ble funnet i cellene under prosessen med å EMT som et resultat fra cadherin bytte [7], [8]. For å undersøke effekten av TCS på celle-celle adhesjon av anoikis resistente H460-celler, sådd vi-celler i 24-brønners lav feste plate med en tetthet på 1,5 x 10
5-celler /brønn og behandlet dem med ikke-toksiske konsentrasjoner av TCS. Den celle-celle-interaksjon ble observert i dannelsen av celle aggregering og fotografert ved hjelp av et fasekontrastmikroskop. Aggregat størrelse og antall ble bestemt og beregnet i forhold til ikke-behandlet kontrollgruppe. Figur 3A viser at TCS behandling vesentlig endret den samlede oppførselen til cellene til enkelt celle suspensjon. Tilsetning av TCS resulterte i signifikant reduksjon av både antall og størrelse av multi-cellulære aggregater på en doseavhengig måte (figur 3B og C). Disse resultatene antydet at TCS fremmet tap av celle-celle adhesjon av anoikis resistente H460-celler som er en dominerende egenskap av cellene som gjennomgår EMT.
(A) Celler ble behandlet med TCS (0 til 7,5 pM) i 12 , 24 eller 48 timer i frittstående tilstand og celle-celle-interaksjon ble fotografert. Scale bar er 1000 mikrometer. (B-C) Etter behandling med TCS (0 til 7,5 mm) i 24 timer i frittliggende tilstand, samlet størrelse og samlede antall ble bestemt etter bilde analysator. Dataforeliggende hjelp av de tre uavhengige triplikate prøver ± SE. *
P
. 0,05 versus ikke-behandlet kontroll
4. TCS øker uttrykket av EMT markører
Vi neste undersøkte effekten av TCS behandling på EMT markører inkludert N-cadherin, vimentin, sneglen, og slug. Anoikis motstandsdyktig H460 celler ble behandlet med ikke-giftige konsentrasjoner av TCS i 24 timer og EMT markører ble evaluert av western blotting. Figurene 4A og B viser at ekspresjonsnivået av E-cadherin ble signifikant redusert i respons til TCS behandling på en konsentrasjonsavhengig måte. I tillegg TCS forbedret betydelig økning av N-cadherin, vimentin, slug, og snegle. Ekspresjon av sneglen ble betydelig forbedret ved TCS behandling på 5 og 7,5 uM i en doseavhengig måte, mens ekspresjonen av den grove ble bare signifikant indusert ved behandling med TCS ved 7,5 pM. Disse resultatene antydet at TCS øket EMT fenotyper i disse cellene.
(A) Anoikis motstandsdyktig H460-celler ble behandlet med TCS (0 til 7,5 pM) i 24 timer i frittstående tilstand. Nivået på N-cadherin, E-cadherin, vimentin, slug og sneglen ble bestemt ved western blotting. Blottene ble reprobed med β-actin å bekrefte lik belastning. (B) immunoavtrykket Signalene ble kvantifisert ved densitometri og midlere data fra uavhengige eksperimenter ble normalisert til resultatene. Dataforeliggende hjelp av de tre uavhengige triplikate prøver ± SE. *
P
. 0,05 versus ikke-behandlet kontroll
5. TCS-mediert EMT fremmende celler migrasjon og invasjon
Et viktig kjennetegn på aggressive kreftceller er deres høy evne til å migrere og invadere [43], [44]. EMT er anerkjent som en viktig faktor tilrettelegge cellemotilitet [12], [45]. Celler ble behandlet med TCS ved ikke-toksiske konsentrasjoner i 24 timer og migrasjons og invasjons atferd av cellene ble bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Figur 5A viser at TCS-behandlede celler viste økt polaritet og filopodia. Filopodia av TCS-behandlede celler ble farget med phalloidin-rhodamin som vist i figur 5B. TCS-behandlede celler utstilt filopodia utstikkere samler på grensen av celler på en doseavhengig måte. I tillegg migrering og invasjon assay viste at TCS øket cellemigrering og invasjon (figurene 5C og D). De ovennevnte resultatene antydet at EMT induksjons ved TCS behandling fremmes filopodia dannelse og forsterkes trekkende og invasive egenskaper av anoikis resistente H460-celler.
(A) Celler ble behandlet med TCS ved 0 til 7,5 pM i 24 timer og deretter festes på konvensjonelle kulturskåler i 4 timer. Cellemorfologi ble påvist ved fasekontrastmikroskopi. Scale bar er 25 mikrometer. (B) Etter den angitte behandling, filopodia og levedyktige celler ble oppdaget av phalloidin-rhodamine eller Hoechst33342 flekker, henholdsvis. Celler ble visualisert under fluorescensmikroskop. Filopodia fremspring ved hver behandling ble angitt med piler. Scale bar er fem mikrometer. (C) Cellene ble forbehandlet med TCS (0 til 7,5 pM) i 24 timer. Transwell-analysen ble anvendt for å undersøke cellemigrering. Trekkende celler ved basolateral siden av membranen ble farget med Hoechst33342 og visualisert under fluorescens mikroskopi. Scale bar er 50 mikrometer. De gjennomsnittlige antall av trekklegemer i hvert felt ved basolateral side av membranen ble plottet i forhold til kontrollgruppen. Verdier er gjennomsnitt av de tre uavhengige triplikatprøvene ± SE. *
P
0,05 versus ikke-behandlet kontroll. (D) Etter behandling med TCS (0 til 7,5 pM) i 24 timer, ble celle invasjon evaluert ved hjelp av transwell belagt med matrigel som beskrevet under «Materialer og metoder». Invaderte celler ved basolateral siden av membranen ble farget med Hoechst33342 og visualisert under fluorescens mikroskopi. Scale bar er 50 mikrometer. De gjennomsnittlige antall invaderte celler i hvert felt på tvers av membranen ble plottet i forhold til kontroll-gruppen. Verdier er gjennomsnitt av de tre uavhengige triplikatprøvene ± SE. *
P
. 0,05 versus ikke-behandlet kontroll
Videre nedstrøms effektor proteiner som er ansvarlig for cellemotilitet ble bestemt ved hjelp av western blotting. Cellene ble behandlet med den angitte konsentrasjon av TCS i 24 timer og utsatt for Western blot-analyse. Uttrykket nivåer av trekkrelaterte proteiner inkludert aktivert FAK (fosforylert FAK, Tyr 397), FAK, aktivert Akt (fosforylert Akt, Ser 473), Akt, aktivert Rac1 (Rac1-GTP), og aktivert RhoA (RhoA-GTP) var undersøkt. Figurene 6A og B viser at TCS behandling signifikant økt nivå av fosforylert FAK, aktivert Akt, og aktiv Rac1-GTP. Men besatt TCS ingen signifikant effekt på aktivert RhoA nivå. Disse resultatene antydet at TCS-indusert EMT fremmet motilitet av anoikis resistente H460 celler gjennom aktivering av FAK /Akt signalveien samt Rac1 aktivering.
(A) Anoikis resistente H460 celler ble behandlet med TCS på 0 -7,5 uM i 24 timer i frittstående tilstand og deretter festet på konvensjonelle kulturskåler i 4 timer. Nivået på pFAK (Tyr 397), FAK, Pakt (Ser 473), Akt, ble aktivert Rac1 (Rac1-GTP) og aktivert RhoA (RhoA-GTP) bestemmes av western blotting. Blottene ble reprobed med β-actin å bekrefte lik belastning. (B) immunoavtrykket Signalene ble kvantifisert ved densitometri og midlere data fra uavhengige eksperimenter ble normalisert til resultatene. Verdier er gjennomsnitt av de tre tredoble uavhengige utvalg ± SE. *
P
. 0,05 versus ikke-behandlet kontroll
Diskusjoner
Lungekreft har fått flest oppmerksomhet i kreftforskning feltet siden denne typen kreft er ansett som en viktig årsak til kreft-relaterte dødelighet [46]. Faktisk er den høye metastase hastighet på en slik cancer gjør den til den mest livstruende, og i de fleste tilfeller metastase blir detektert på tidspunktet for første diagnose [47]. På grunn av at evnen til kreftceller til å metastasere kan utvides ved hjelp av fremgangs EMT [9], [12], [48], den foreliggende undersøkelse rapporterer den positive regulerende effekt av TCS på EMT av humane kreftceller fremhever det mulig nye toksisitet forårsaket av denne forbindelsen.
TCS har vært mye brukt i over 30 år i helsevesenet produkter så vel som i medisinsk utstyr. TCS er lett og fullstendig absorbert etter oral administrasjon. TCS er blitt identifisert i urin, plasma, og morsmelk hos mennesker med et bredt spekter av nivåer avhengig av individets daglige inntak, dens konsentrasjon i produktene så vel som den rute og hyppigheten av administreringen [2], [3]. De lave og høye konsentrasjoner av TCS i humant plasma er rapportert på 0,02 og 20 ng /ml (0,069 og 69 mm) med henholdsvis [4]. Tidligere studier har rapportert mulige effekter av TCS i induksjon av levercelleadenom og kreft formasjoner i gnager modell [2]. Nylig, Ma et al. (2013) fant at TCS redusert global DNA metylering (GDM) i HepG2 celler, og de foreslåtte reduksjonen som mulig mekanisme TCS fremme svulst i gnagere [49]. Siden global DNA hypometylering er assosiert med avvikende genuttrykk, tap av imprinting, kromosom ustabilitet og uregelmessigheter, har det vist seg å spille en nøkkelrolle i å kontrollere EMT og kreft metastase [50].
