Abstract
Bakgrunn
De fleste av tykk- og endetarmskreft (CRC) tilfeller er forebygges ved tidlig oppdagelse og fjerning av forstadier polypper. Selv om CRC er den nest vanligste innvendig kreft i Australia, bare 30 prosent av befolkningen antas å ha risikofaktorer delta i avføring baserte testscreeningprogrammer. Mye tyder på en robust, blod-basert diagnostisk analyse ville øke screening etterlevelse. En rekke potensielle diagnostiske blodbaserte protein biomarkører for CRC er blitt rapportert, men alle mangler sensitivitet eller spesifisitet for anvendelse som en frittstående diagnostisk. Hensikten med denne studien var å identifisere og validere et panel av proteinbaserte biomarkører i uavhengige kohorter som kan oversettes til en pålitelig, ikke-invasiv blod-basert screening test.
hovedfunnene
i to uavhengige gruppene (n = 145 og n = 197), evaluert vi syv enkle biomarkører i serum av CRC pasienter og alder /kjønn matchet kontroller som viste en signifikant forskjell mellom kontroller og CRC, men mangler individuelt følsomheten for diagnostisk program. Ved hjelp av logistiske regresjon strategier, identifiserte vi et panel av tre biomarkører som diskrimineres mellom kontroller og CRC med 73% sensitivitet på 95% spesifisitet, når den brukes til noen av de to kohortene. Dette panel bestående av insulinlignende vekstfaktorbindende protein 2 (IGFBP2), Dickkopf-3 (DKK3), og pyruvat kinase M2 (PKM2).
Konklusjoner
På grunn av den heterogene natur av CRC er usannsynlig å ha tilstrekkelig sensitivitet eller spesifisitet for bruk som en frittstående diagnostisk screeningtest og et panel av markører kan være mer effektivt en enkelt biomarkør. Vi har identifisert en 3 biomarkør panel som har høyere sensitivitet og spesifisitet for tidlig stadium (fase I og -II) sykdom enn blod i avføringen test, øker muligheten for dens anvendelse som en ikke-invasiv blod diagnostiske eller screening-test.
Citation: Fung KYC, Tabor B, Buckley MJ, Priebe IK, Puriņš L, Pompeia C, et al. (2015) Blood-Based Protein Biomarker Panel for deteksjon av tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (3): e0120425. doi: 10,1371 /journal.pone.0120425
Academic Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, TYSKLAND
mottatt: 24 september 2014; Godkjent: 22 januar 2015; Publisert: 20 mars 2015
Copyright: © 2015 Fung et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av CSIRO forebyggende Helse National Research flaggskip og National Health and Medical Research Council (tilskudd nummer 1017078) (https: //www. nhmrc.gov.au/) til LJC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen diagnostisert i verden hvor det utgjør ca 10% av alle kreftdiagnoser og har en estimert årlig dødelighet enn 600.000 [1]. Land som Australia, New Zealand, Europa, USA og Storbritannia er rapportert å ha den høyeste forekomsten av sykdom, men forekomsten øker i land som Japan og de av Øst-Europa. Flertallet av tilfellene (opp til 80%) er sporadisk hvor miljø- og livsstilsfaktorer antas å spille en rolle i sin utvikling [2]. CRC er en heterogen sykdom som utvikler seg via en opphopning av genetiske mutasjoner og epigenetiske endringer i det kolonepitelet som til slutt resulterer i neoplastisk transformasjon [3-5]. Den langsomme og progressive natur av denne prosessen gir en mulighet til å gjennomføre screening-programmer og diagnostiske verktøy for tidlig deteksjon av sykdommen som har potensial til å redusere forekomst og dødelighet assosiert med CRC. I et forsøk på å redusere forekomsten og å oppdage sykdommen i en tidlig fase før symptomene er tydelig, har screeningprogrammer vært gjennomført i mange land, inkludert USA, Storbritannia, Australia, Japan og Europa [6-8].
For tiden er de mest brukte diagnostiske verktøy omfatter endoskopiske prosedyrer som kolonoskopi og sigmoidoskopi, og det guaiac-baserte blod i avføringen test (gFOBT) eller immunokjemiske blod i avføringen test (iFOBT), også kjent som fekal immuntest ( FIT) [9]. Mens koloskopi og sigmoidoskopi er de mest sensitive prosedyrer for påvisning av tykktarmssvulster og forstadier til kreft (adenomer og polypper), og kan være potensielt kurativ hvis polypper er fjernet, disse prosedyrene er vanskelig å gjennomføre på en populasjonsbasis på grunn av kostnadene, invasivitet , kompetansen som kreves, og tidkrevende natur på grunn av tarm forberedelse kreves [10,11]. Mens billig og ikke-invasiv, FOBT og FIT har lavere sensitivitet og spesifisitet enn koloskopi (dvs. disse testene har høyere falske positiver) og er mest vellykket på å oppdage sent stadium sykdommen [10,12]. Videre diagnostiske utførelsen av FOBT og FIT er variabel, med rapporterte sensitivitet for CRC mellom 11-64% for gFOBT (79-98% spesifisitet) og 56-89% for FIT (83-97% spesifisitet) [13]. Disse testene er også ofte kompromittert av dårlig for pasienten, variasjoner i analytiske prosedyrer som for eksempel forskjellige metoder for avføring innsamling og håndtering, behovet for flere testprøver, og variasjoner i tolkning av testresultater [13,14]. Foreløpig har bare gFOBT vist seg å redusere CRC dødelighet i store prospektive randomiserte kliniske studier [8,13].
Mange studier har blitt publisert rapportering biomarkører som kan implementeres som en ikke-invasiv test for å oppdage CRC , spesielt i en tidlig fase (fase i og /eller premaligne sykdom). Et antall strategier for å identifisere blodbaserte protein biomarkører er blitt rapportert i litteraturen, inklusive proteomikk og /eller gen-ekspresjon analyse av kolorektal tumorvev og utskilte proteiner. Selv om noen av disse studier har identifisert potensielle paneler av proteiner eller gener som er egnet for påvisning CRC [15-19], data fra oppfølgingsstudier, for eksempel i Større materialer, er ikke tilgjengelige. Foreløpig de mest lovende biomarkører synes å være DNA metylering markører, inkludert metylert septin 9 (mSEPT9) målt i blodet [20-23] og en krakk baserte DNA-test som består av denaturert BMP3, NDRG4, VIM, og TFPI2 og en mutant skjema av KRAS [24]. Mer nylig ble et modifisert DNA-basert kreft test bestående av metylert BMP3 og NDRG4, mutante KRAS og ß-aktin som kontroll i kombinasjon med fekal hemoglobin testet i en asymptomatisk populasjon screening bestående av 9,989 pasienter [25]. Det ble bemerket at DNA-test hadde lavere spesifisitet, en høyere falsk positiv rate og led av en høyere teknisk strykprosent på grunn av sin komplekse natur som kan hemme gjennomføringen som en befolkning bred screening test. Selv avføring baserte DNA-tester har vist lovende resultater for CRC deteksjon i kliniske studier, er de ennå ikke er implementert i klinisk praksis eller som en populasjon omfattende screening test.
På grunn av den heterogene natur CRC, en enkelt biomarkør er neppe ha tilstrekkelig sensitivitet eller spesifisitet for anvendelse som en frittstående diagnostisk screening test og et panel av markørene kan være mer effektiv. Tidligere evaluerte vi ytelsen og egnetheten av 32 protein biomarkører i serum og /eller plasma fra pasienter med kolorektal kreft og normale kontroller [26] for deres evne til å diagnostisere CRC. Selv om denne analysen identifisert 12 protein biomarkører som avvek betydelig mellom de to gruppene, ingen protein hadde tilstrekkelig sensitivitet og spesifisitet for bruk som en frittstående diagnose. Vi har også identifisert potensielle biomarkører kombinasjoner som representerer ulike sider ved sykdom som kan føre til en diagnostisk test for CRC. Her rapporterer vi på evalueringen av syv av disse protein biomarkører (IGFBP2, PKM2, DKK3, MAC2BP, vev hemmere av metalloproteinaser 1 (TIMP1), interleukin 8 (IL8) og interleukin 6 (IL6) som en potensiell diagnostisk eller screening test for CRC .
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle forskningsprotokoller som brukes i denne studien ble godkjent av de relevante menneskerettighetsforskningsetiske komiteer Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation, Adelaide på (CFNS menneskelig forskningsetiske komité-Proposal 03/17 (a) (b)), og Royal Melbourne Hospital, Melbourne (HREC prosjekt 2003,145 . 2003,146) Skriftlig samtykke ble innhentet fra hver pasient før blodprøvetakning
Prøvetaking
Pasientene ble nydiagnostiserte tilfeller av CRC uten tidligere historie med sykdom. blod ble innhentet før kirurgi ved kolorektal kirurgi preadmission klinikker fra et nettverk av sykehusene i forbindelse med den viktorianske Cancer Biobank, Melbourne, Victoria, Australia, mellom 2005 og 2011. Pasienter som allerede hadde fått kjemo- og /eller radioterapi ble ekskludert fra denne studien. For CRC pasienter ble blodprøver tatt etter diagnose og minst en dag før operasjonen. Staging ble gjennomført i henhold til TNM klassifikasjon for tykktarms- og endetarmskreft [27].
Serumprøver fra CRC pasienter og alder /kjønn matchede kontroller ble samlet ved hjelp av en standard prosedyre som tidligere beskrevet [28,29]. Blod ble oppsamlet i serum gelrør (Scientific Specialties Inc., USA), og hver prøve ble etterlatt for å stå ved romtemperatur i 30 minutter før sentrifugering (1,200g, 10 minutter, romtemperatur). Serumet fraksjon ble deretter overført til rene 15 ml rør og sentrifugert igjen (1,800g, 10 minutter, romtemperatur) før de blir aliquotted (250 ul) og lagret (-80 ° C). Alle prøver ble behandlet og lagret innen 2 timer etter prøvetaking
Biomarker analyse og identifikasjon av biomarkør panel
Følgende biomarkører ble målt ved hjelp av kommersielt tilgjengelige ELISA kits i henhold til de respektive produsenten protokoller. IGFBP2 (Diagnostic Systems Laboratories, USA eller Demeditec Diagnostics GmbH, Tyskland), MAC2BP (Bender MedSystems GmbH, Østerrike), PKM2 (Schebo Biotech, Tyskland), DKK3 (R D Systems, USA) . IL6 og IL8 ble analysert som perle-baserte analyser hentet fra R 0,0001) og 59% (p 0,0001) ved 95% spesifisitet for CRC samlet målt i opplæring og test kohorter, henholdsvis. Tilsvarende PKM2 også vist seg å være den mest vellykkede markør på å identifisere CRC ved hvert stadium av sykdommen sammenlignet med kontrollpopulasjon i denne studien, inkludert tidlig fase sykdom (følsomheter av 48% (p = 0,0008), 52% (p 0.0001 ), 61% (p 0,0001) og 75% (p 0,0001) for trinn i, II, III og IV, henholdsvis i opplærings kullet og sensitiviteter av 52% (p 0,0001), 65% (p 0,0001) , 54% (p 0,0001) og 80% (p 0,0001) for trinn i, II, III og IV, henholdsvis i testen kohort) (S1 tabell). Egenskapene til de enkelte biomarkører i opplæring og test kohorter kan bli funnet i S1 tabell. Når vurderes individuelt, ingen av disse biomarkører hadde tilstrekkelig følsomhet til å diagnostisere CRC.
Identifisering av en tre-biomarkør panel for CRC diagnose
Bruk frem trinnvis logis regresjon brukt til trening datasett (Cohort 1), en tre biomarkør modell bestående av DKK3, PKM2 og IGFBP2 ble identifisert som kunne diagnostisere CRC med 73% sensitivitet på 95% spesifisitet (tabell 4). Videre denne tre-biomarkør modellen vist seg å være robust når validert i test kohort (Cohort 2, sensitivitet på 73% ved 95% spesifisitet), og var i stand til å diskriminere mellom kontroller og CRC pasienter på ulike TNM stadium med lik følsomhet (tabell 4). Viktigere er det biomarkører modellen i stand til å identifisere pasienter med tidlig fase sykdom med høy følsomhet (dvs. 57% og 76% sensitivitet, ved 95% spesifisitet for Trinn I og II, henholdsvis, i opplæring kullet og 59% og 84% for stadiene i og II, henholdsvis, i testen kullet). Fig. 1 viser ROC-kurven for de tre-biomarkør modell og egenskapene til modellen er beskrevet i Tabell 4.
Diskusjon
Tidligere har vi målt 32 protein biomarkører i plasma og serum av pasienter og kontroller CRC [26]. Disse biomarkører ble først identifisert som potensielt nyttige for CRC diagnose basert på biologi, genekspresjon mikromatriser og proteomikk data, både fra våre egne studier og fra litteraturen. I vår forrige undersøkelse, målte vi PKM2 i plasma og funnet ut at det hadde 19% sensitivitet (95% spesifisitet) mens i serum vi observerte sensitivitet på 56% ved 95% spesifisitet. Når målt i serum, PKM2 var den beste resultater biomarkør for CRC diagnose i forhold til de andre biomarkører vi målt. Videre var det også den beste resultater markør når skille tidlig stadium sykdom (48% sensitivitet). Som en ytterligere forlengelse av denne studien, har vi foretatt nærmere vurdering av syv av disse proteinene i to uavhengige tilfelle kontroll gruppene (gruppe 1 og 2). Videre har vi identifisert et panel av tre proteiner biomarkører som er i stand til å diagnostisere CRC fra en kontrollpopulasjon med 73% sensitivitet på 95% spesifisitet i både trening (n = 145) og prøve (n = 197) kullene i vårt studium. Selv om disse innledende studier er lovende, er vi for tiden gjennomfører ytterligere testing av vår biomarkør panel i en pasient kohort som inkluderer ikke-maligne kolorektale sykdommer (f.eks, inflammatorisk tarmsykdom, diverticulutis), adenomer, godartede og /eller forstadier polypper og andre kreftformer. Dette vil gjøre oss i stand til å bestemme spesifisiteten av panelet for CRC deteksjon og dens følsomhet for tidlig eller premaligne sykdom.
Våre tre biomarkør Panelet består av IGFBP2, DKK3 og PKM2, og hver av disse proteinene er kjent for å være biologisk viktig i CRC sykdom og progresjon og er representative for den heterogene natur av denne kreft. For eksempel er det mange rapporter som indikerer involvering av IGFBP2 i spredning, migrasjon og invasjon av kreftceller [31], og forhøyede nivåer av IGFBP2 har også blitt rapportert i serum og plasma fra CRC pasienter sammenlignet med normale kontroller [32- 35]. Transcriptional stanse av DKK3 grunn av arrangøren hypermethylation i CRC vev har blitt rapportert [36,37], og dette kan forklare redusert nivå i serum hos CRC pasienter vi observert i denne studien. Imidlertid har en forhøyet protein ekspresjonsnivå i endotelceller i mikrokar av kreftvev har også blitt rapportert som indikerer den potensielle betydning av DKK3 i CRC progresjon, på grunn av angiogenese og neovaskularisering [38]. PKM2 er et cytosolisk enzym som er involvert i energimetabolismen som er uttrykt ved både normale prolifererende celler og kreftceller. Forhøyet ekspresjon av tumor-spesifikke dimere form av dette proteinet har blitt rapportert i CRC og andre gastrointestinale cancere [39-41] og tallrike studier har evaluert dens nytte som en fekal eller blod-baserte markør for CRC screening og /eller diagnose [40 , 42-46]. Den primære ulempen om sin nytte som en frittstående diagnostisk markør har vært dens dårlig spesifisitet for CRC.
Ytelsen til tre-biomarkør modell bestående av IGFBP2, DKK3 og PKM2 (73% sensitivitet på 95% spesifisitet ) er tilsvarende som sitert for FOBT og FIT (følsomhet 61-79% ved 86-95% spesifisitet) [12,14,47-49]. Videre vises det panel av biomarkører som vi har identifisert til å utføre godt for stadium sykdommen deteksjon tidlig (dvs. Stage I og II sykdom). Dette overlegen ytelse på tidlige stadier, spesielt ved Stage jeg, gir en viktig fordel av vår biomarkør panel i løpet av tiden brukes ikke-invasive tester for CRC. Dette er en viktig faktor siden tidlig deteksjon og riktig pasientbehandling bedrer total overlevelse for denne sykdommen. Videre testing av panelet i en stor prospektiv kohort, som inkluderer pasienter med høy risiko adenomer eller polypper, er nødvendig for å fullt ut forstå den potensielle nytten av vårt panel for diagnostiske eller screening formål. Det er også mulig at den biomarkør panelet kan benyttes i kombinasjon med nåværende screening modaliteter slik som FOBT, FIT, eller den nylig rapportert plasma mSEPT9 test eller krakk-baserte DNA markører [20-24] for ytterligere å forbedre ytelsen diagnostisk.
Selv om det er kjent at screeningprogrammer kan redusere dødeligheten av CRC, nye bevis tyder på at en ikke-invasiv blodbasert test med høy sensitivitet og spesifisitet for sykdommen, særlig tidlig stadium sykdommen, kan være en fordel å overvinne oppfattet barrierer for deltakelse i forbindelse med bruk av FOBT [50,51]. Mens ikke-invasiv, er FOBT ikke er spesifikke for CRC og det er ikke i stand til nøyaktig å detektere tidlig stadium sykdom. Videre er verdien av denne testen hemmet av dårlig pasientens etterlevelse [50]. Data fra studier som evaluerer pasientens preferanse for blod testing versus endoskopi, inkludert koloskopi eller sigmoidoskopi, er ikke tilgjengelige. Men studier som undersøker pasienten preferanse mellom FOBT og koloskopi viser motstridende resultater. For eksempel, Schroy et al. indikerer at pasienter har en preferanse for fekal testing for rutinemessig screening på grunn av sin bekvemmelighet og ikke-invasiv metode [52]. En annen studie av Hol et al. konkluderte med at screening ved hjelp av endoskopi teknikker var å foretrekke blant en screening befolkning på grunn av vissheten om diagnose og redusert risiko for sykdom [53]. Dette indikerer at å bli implementert i samfunnet, høy sensitivitet og spesifisitet til nøyaktig og pålitelig diagnose CRC og informere pasientoppfølgingsrutiner er viktige funksjonene i noen diagnostisk test som må vurderes.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. Scatter tomter til de sju biomarkører evaluert i opplærings- og test kohorter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120425.s001 product: (PDF)
S2 Fig. Mottaker operatør karakteristiske kurver for de sju biomarkører evaluert i opplærings- og test kohorter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120425.s002 product: (PDF)
S1 Table. Egenskapene til de enkelte biomarkører i opplæring og test kohorter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120425.s003 product: (PDF)
Takk
Forfatterne ønsker å takke den viktorianske Cancer Biobank (Melbourne, Victoria) for deres hjelp med prøvetaking.
