Abstract
Formål
Kreft i bukspyttkjertelen er en aggressiv kreft med karakteristisk metastatisk sykdomsforløp og motstand mot konvensjonell chemo-strålebehandling. RLIP76 er et multi-funksjonelt cellemembranprotein som fungerer som en viktig merkaptopurinsyre veien transporter samt sentrale regulator av reseptor-ligand-komplekser. I denne forbindelse, undersøkte vi betydningen av målretting RLIP76 på PI3K /Akt sti og mekanismer som regulerer respons på cellegift eller strålebehandling.
Forskning Design og metode
Cell overlevelse ble vurdert av MTT og kolonidannende analyser. Cellulære nivåer av proteiner og fosforylering ble bestemt ved Western blot-analyser. Virkningen på apoptose ble bestemt ved TUNEL assay. Den anti-kreft-effekter av RLIP76 målrettet inngrep
in vivo
ble bestemt ved anvendelse av mus xenograft modell av kreft i bukspyttkjertelen. Reguleringen av doxorubicin transport og stråling følsomhet ble bestemt av transport studier og kolonidannende analyser, henholdsvis.
Resultater
Vår nåværende studier viser en altomfattende modell for rollen som RLIP76 i nivåregulering av grunnleggende proteiner som PI3K, Akt, E-cadherin, CDK4, BCL2 og PCNA som er av spesiell betydning i signaltransduksjon fra kritiske oppstrøms signalkaskader som bestemmer spredning, apoptose og differensiering av kreft i bukspyttkjertelen celler. RLIP76 uttømming også forårsaket markert og vedvarende tilbakegang av etablerte menneske BxPC-3 bukspyttkjertelen kreftsvulster i naken mus xenograft modell. RLIP76 viste seg å være en viktig regulator av narkotika transport langs med å bidra til stråling motstand i bukspyttkjertelkreft.
Konklusjon /Betydning
RLIP76 representerer en mekanistisk betydelig mål for å utvikle effektive intervensjoner i aggressive og ildfaste bukspyttkjertel kreft
Citation:. Leake K, Singhal J, Nagaprashantha LD, Awasthi S, Singhal SS (2012) RLIP76 Regulerer PI3K /Akt alarm og Chemo-Strålebehandling Resistance i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 7 (4): e34582. doi: 10,1371 /journal.pone.0034582
Redaktør: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 11 januar 2012; Akseptert: 7 mars 2012; Publisert: 03.04.2012
Copyright: © 2012 Leake et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH Grant CA 77495 og Foundation of North Texas Cancer Research. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall blant menn og kvinner [1]. Omtrent 95% av ondartede svulster i bukspyttkjertelen oppstår fra det eksokrine vev. Blant bukspyttkjertelen eksokrine maligniteter, 80% til 90% er duktale adenokarsinomer [2], [3]. Færre enn 20% av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen ha sykdom som er makroskopisk begrenset til bukspyttkjertelen ved diagnose med resten av pasienter med avansert lokalt og fjernt viscerale metastaser, vanligvis involverer leveren [4]. Bukspyttkjertel kreft har flere avvik i cellulære signalkaskader og er karakteristisk kjent for sin invasiv fenotype og refraktær mot konvensjonelle former for terapi. Den behandling av kreft i bukspyttkjertelen blir ofte møtt med skuffende resultater på grunn av utviklingen av resistens overfor terapi påfølgende til aktivering av et antall rednings å fremme proteiner som å transdusere signaler fra ekstracellulære signalmolekyler så som epidermal vekstfaktor (EGF), transformerende vekstfaktor (TGF ), eller insulin-lignende vekstfaktorer (IGF1) [5], [6]. Molekylære studier har også preget mutasjoner i K-ras onkogenet i 80% eller mer av duktale adenokarsinomer [7]. Den PI3K /Akt reaksjonsvei spiller en viktig rolle i signaloverføring fra oppstrøms vekstfaktorreseptorer, så vel som onkogene K-ras [8] – [12]. PI3K /Akt signale representerer også en potent og grunnleggende akse signal relé som bestemmer den basale overlevelse og motstand mot de apoptotiske effekter av chemo-strålebehandling i en rekke kreftformer, noe som gjør PI3K /Akt pathway en sentral fokus av mekanistiske undersøkelser i bukspyttkjertelkreft [13], [14]. Foreløpig er det ingen effektiv behandling for kreft i bukspyttkjertelen og konvensjonell kjemoterapi-strålebehandling har vist svært begrenset suksess i å forbedre pasientens overlevelse. Den totale overlevelsen av kreft i bukspyttkjertelen pasienter er ~ 5%. Derfor etterforskningen av virkningsmekanismer av nye mål som kan regulere de molekylære endringer som driver kreft i bukspyttkjertelen overlevelse og refraktær mot terapi vil lette utviklingen av effektive tiltak for kreft i bukspyttkjertelen [4], [15].
merkaptopurinsyre pathway spiller en avgjørende rolle i å regulere den cellulære antioksidant potensial og motstand mot cellegift eller strålebehandling [16]. Glutation (GSH) er en svovelinneholdende lite molekyl i cellene som er nødvendig for å beskytte cellene fra flere toksiske stimuli som induserer celledød [17]. Under det første trinn av merkaptopurinsyre svei, den cellulære glutation S-transferaser (GST) katalysere konjugeringen av administrerte cytostatika og produkter av lipidperoksidasjon, indusert påfølgende til radioterapi, med GSH under dannelse av glutation-konjugater (GS-Es) [18 ]. GS-es som fremdeles giftige for cellene og må effluxed ut av celler for å beskytte cellene mot celledød. Under det andre trinn av merkaptopurinsyre vei, blir de GS-es effluxed ut av cellene, og denne fremgangsmåten er mediert av energi-avhengige transportpumper som er tilstede i cellemembraner [19]. I vår omfattende tidligere publiserte studier, har vi vist at RLIP76 er en primær merkaptopurinsyre pathway transporter som fjerner GS-es som følge av produkter av lipidperoksidasjon og cytostatika fra cellene. Denne funksjonen av RLIP76 er mer viktig for kreftceller sammenlignet med normale celler som uttømming av RLIP76 dreper ikke normale celler, men er meget effektiv i å drepe kreftceller av nesten alle typer [20] – [24].
Vårt nylig publiserte studier indikerer at RLIP76 er også en stress-responsiv GS-E transportør som kreves for clathrin avhengig endocytose (CDE), som er nødvendig for regulering av reseptor-ligand-signalisering på cellemembranreseptorer [25]. I sammenheng med slående kjemoterapi eller strålebehandling motstanden i bukspyttkjertel kreft og den grunnleggende rolle RLIP76 som en viktig merkaptopurinsyre pathway transporter som er nødvendig for å overleve og terapi motstand i kreftformer, undersøkte vi rolle RLIP76 i å regulere den kritiske signale proteiner som er involvert i videresending innspill fra flere oppstrøms overlevelses trasé og mekanismer som bidrar til cellegift eller strålebehandling motstand i bukspyttkjertelkreft.
Materialer og metoder
Material
doxorubicin (DOX, adriamycin) ble oppnådd fra Adria Laboratories (Columbus, OH).
3H-GSH (3000 Ci /mmol) ble kjøpt fra Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ).
14C-DOX (spesifikk aktivitet 44,8 Ci /mmol) ble kjøpt fra NEN Life Sciences (Boston, MA). Polyklonalt kanin-anti-humant IgG rec-RLIP76 samt pre-immun IgG ble fremstilt og renset som beskrevet tidligere [26], [27]. MRP (N19, katt # sc7774), Pgp (C19, katt # sc1517) Akt (cat # Sc8312), GAPDH (cat # sc32233), BCL2 (cat # sc509), Bim (cat # sc11425), og cyclin B1 ( cat # sc595) antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Columbus, OH). Pakt (S
473; cat # 05-736) antistoff ble anskaffet fra Upstate Cell Signaling (Lake Placid, New York). Antistoffer mot PI3K (cat # 4292S), pPI3K (Y
458; cat # 4228), og PCNA (katt # 2586S) var fra cellesignalisering Technologies (Danvers, MA). E-cadherin (cat # C3621), β-aktin (cat # A5441), og cdk4 (katt # DCS-35) antistoffer var fra Sigma-Aldrich Corp (St. Louis, MO.) Og Neomarkers (Fremont, California) hhv. TUNEL fluorescens deteksjon kit ble kjøpt fra Promega (Madison, WI). DNP-SG ble syntetisert fra CDNB og GSH i henhold til metoden beskrevet av oss tidligere [28]. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjent protokoll. RLIP76 antisense ble kjøpt fra Biosyntese, Inc., (Lewisville, Texas) [22], og RLIP76 siRNA ble kjøpt fra Dharmacon forskning (Lafayette, CO), som beskrevet tidligere [29].
Dyr
Hsd: atymiske nakne nu /nu-mus ble erholdt fra Harlan, Indianapolis, IN. Dyrene ble opprettholdt på Beckman Research Institute, City of Hope National Medical Center, Duarte, CA. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med godkjent protokoll (# 11016) ved Beckman Research Institute, City of Hope National Medical Center Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
Cellelinjer og kulturer
menneske~~POS=TRUNC navle vaskulære endotelceller (HUVEC) ble vennlig levert av Dr. Fiemu Nwariaku, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, som beskrevet tidligere (22-24), og dyrket ved 37 ° C i en fuktig atmosfære av 5% CO
2 i EGM-2 kule kit medium supplert med 10% (v /v) (v /v) Pen-Strep (P /S) oppløsning varmeinaktivert FBS og 1%. Human kreft i bukspyttkjertelen (BxPC-3 og PANC-1) cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection, Manassas, VA, og dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i MEBM og RPMI-1640 medium supplert med 10% (volum /volum) varme-inaktivert FBS, 1% (v /v), Pen-Strep (P /S) oppløsning, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvat, 4,5 g /l glukose, og 1,5 g /l natriumbikarbonat. Alle celler ble testet for
Mycoplasma
en gang hver 3. måned.
MTT celleviabilitet analysen
celle nummer /ml i en delmengde av celler som vokser i log fase ble bestemt ved å telle trypanblått-ekskluderende celler i et hemocytometer og 20.000 celler ble sådd ut i hver brønn av 96-brønners flatbunnede mikro-titer plater. Etter 12 timers inkubering ved 37 ° C, medium inneholdende enten pre-immun IgG eller anti-RLIP76 IgG (40 pg /ml sluttkonsentrasjon) ble tilsatt til cellene. Etter 24-48 timers inkubering ble 20 ul av 5 mg /ml MTT ble introdusert til hver brønn og inkubert i 2 timer eksponering. Platene ble sentrifugert, og mediet ble dekantert. Celler ble deretter oppløst i 100 ul DMSO under forsiktig risting i 2 timer ved romtemperatur, etterfulgt av måling av OD
570 nm [30]. Åtte replikate brønner ble benyttet i hvert punkt i hvert av tre separate målinger. Målte absorbansverdiene var direkte knyttet til et regneark for beregning av IC
50, definert som den legemiddelkonsentrasjon som redusert formazan formasjon med 50%. Uttømming av RLIP76 ekspresjon i celler ved RLIP76 siRNA og RLIP76 antisens ble målt som følger: cellene ble inkubert i 3 timer med 0-2 ug /brønn av enten RLIP76 siRNA ved hjelp Transmessenger Transfection Reagent (Qiagen) eller RLIP76 anti-sense ved hjelp Maxfect transfeksjon reagens (en molekyl) i henhold til produsentens gitt protokoller
Kloning, prokaryote uttrykk, og rensing av RLIP76
Renset RLIP76 protein. (1965 bp, 655 aa) ble hentet fra
E. coli
BL21 (DE3) som uttrykker pET30a (+) plasmid inneholdende full-lengde cDNA som tilsvarer sekvensen av RLIP76. Rensingen ble utført ved anvendelse av DNPSG-affinitet harpiks som beskrevet tidligere, og renhet ble bekreftet ved Western blot-analyse [26], [31].
funksjonell rekonstitusjon av renset rec-RLIP76 inn i kunstige liposomer og transportstudier
Renset RLIP76 ble dialysert mot rekonstituering-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM MgCl
2, 1 mM EGTA, 100 mM KCI, 40 mM sakkarose, 2,8 mM BME, 0,05 mM BHT, og 0,025% polidocanol). En vandig emulsjon av soya asolectin (40 mg /ml) og kolesterol (10 mg /ml) ble fremstilt på samme rekonstituering buffer ved ultralydbehandling og 0,1 ml av denne blandingen ble tilsatt til 0,9 ml porsjon av dialysert og renset rec-RLIP76 protein. Reaksjonsblandingen ble sonikert ved 50 V i 30 sek. Blæredannelse ble initiert ved tilsetning av 200 mg SM-2 bio-perler pre-ekvilibrert i buffer uten rekonstituering polidocanol. Blæredannelse ble utført i 4 timer ved 4 ° C ble SM-2 bio-perler ble fjernet ved sentrifugering, og vesikler (RLIP76-liposomer) ble oppsamlet. Den oppsamlede fraksjon gir primært unilammelar vesikler med midlere diameter på 0,25 um og intravesikulær /extravesicular volumforhold på 18 pl /ml. Kontroll vesikler (kontroll-liposomer) ble fremstilt ved anvendelse av en lik mengde av albumin eller råprotein fra
E. coli
ikke uttrykke RLIP76. ATP-avhengige transport av
14C-DOX og
3H-DNPSG i REC-RLIP76 rekonstituert proteoliposomes ble utført ved hurtig filtrering teknikk med nøyaktig protokoll beskrevet av oss tidligere hvor effektiviteten av levering for proteoliposomes er etablert [ ,,,0],26].
preparater av rå membranfraksjoner for Western blot analyser
crude membran-fraksjoner ble fremstilt fra de normale og kreftcellelinjer under anvendelse av etablerte prosedyrer som tidligere beskrevet [22]. I korthet ble cellene pelletert og vasket med balanserte saltoppløsning (138 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,3 mM KH
2PO
4, 0,3 mM Na
2HPO
4, 4 mM NaHCO
3, og 5,6 mM glukose, pH 7,4) tre ganger. Vaskede celler ble lysert i 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, inneholdende 1,4 mM BME, 0,1 mM PMSF, 0,05 mM BHT, 0,1 mM EDTA og 0,5% (v /v) polidocanol. Lysater ble sonikert tre ganger i 30 sekunder ved 50 W og inkubert i 4 timer ved 4 ° C med leilighetsvis risting. Etter inkubasjonen ble det resulterende preparat ble sentrifugert ved 100,000- x g i 60 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble oppsamlet og underkastet SDS-PAGE. Nivåer av RLIP76 protein i normale celler og kreftceller ble målt ved Western blot og ELISA ved anvendelse av anti-IgG RLIP76 som tidligere beskrevet [29], [31]. Renset rec-RLIP76 med renhet vurdert av aminosyresammensetning analyse ble brukt for å generere kalibreringskurvene.
transportplanlegging i IOVs
Crude membranblærer (innsiden ut vesikler Iov) ble fremstilt fra normale (HUVEC) og ondartet (BxPC-3 og Panc-1) cellelinjer bruke etablert prosedyrer som beskrevet av oss for K562 celler [26]. Transport studier av DOX og DNP-SG i IOVs ble utført ved fremgangsmåten som tidligere beskrevet [26]. IOVs ble separat belagt med 40 pg /ml endelig konsentrasjon av enten anti-RLIP76 IgG, anti-MRP1 IgG eller anti-IgG Pgp og som brukes til å måle den ATP-avhengige opptak av
14C-DOX. ATP-avhengige opptak av
14C-DOX ble bestemt ved å subtrahere radioaktiviteten (cpm) av kontrollene uten ATP fra den til de eksperimentelle grupper som inneholder ATP. Transporten av DOX ble beregnet i form av pmol /min /mg IOV protein. Transporten av
3H-DNP-SG ble målt på en lignende måte
tumorxenografter modell
Hsd:. Atymiske nakne nu /nu-mus ble erholdt fra Harlan, Indianapolis, IN. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med en protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). Trettiseks 10-ukers-gamle mus ble delt inn i seks grupper på 6 dyr (behandlet med pre-immunserum, egge siRNA, eggeantisense, RLIP76 antistoffer, RLIP76 siRNA og RLIP76 antisens DNA). Alle 36 dyr ble injisert med 2 x 10
6 humane kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC-3) suspensjoner i 100 ul PBS, subkutant. Dyrene ble undersøkt daglig for tegn på tumorvekst. Behandlingen ble administrert når svulsten overflatearealet over ~42 mm
2 (dag 47 etter tumorcelle-injeksjon, dvs. dag 1 etter behandling). Behandlingen besto av 200 ug av enten RLIP76 antistoffer, RLIP76 siRNA eller RLIP76 antisense i 100 ul PBS. Kontrollgrupper ble behandlet med 200 mikrogram /100 mL pre-immun serum, egge siRNA og eggeantisense. Tumorene ble målt i to dimensjoner ved målepunktene.
kolonidannelse assay
Celler (0,1 x 10
6 celler /500 ul) ble inkubert med egge antisens og RLIP76 antisense (10 ug /ml endelig konsentrasjon) i 24 timer. Etter 24 timer porsjoner av 50 og 100 pl ble ytterligere inkubert i 60 mm størrelse petriskåler, hver for seg, i et totalt volum på 4 ml medium til hver petriskål. For bestrålings eksperimenter, kontroll og RLIP76-proteoliposomes (50 pg /ml sluttkonsentrasjon, 24 h) behandlet celler ble bestrålt ved 100, 200, 500 og 1000 cGy ved hjelp av Varian Clinac 2100C lineær akselerator med 6 MeV fotonstråle. Etter 7 dager ble kolonier klebende fiksert, farget med 0,5% metylenblått i 30 min., Og koloniene ble tellet ved bruk av Innotech Alpha Imager HP [32].
Effekt av RLIP76 antisens på apoptose ved TUNEL assay
Cells (~ 1 x 10
6) ble dyrket på dekkglass og behandlet med egge antisens og RLIP76 antisense (10 ug /ml endelig konsentrasjon) i Maxfect transfeksjon reagens (en molekyl). Apoptose ble bestemt ved merking av DNA-fragmenter med terminal deoksynukleotidyl-transferase dUTP nick-ende merking (TUNEL) assay ved å bruke Promega apoptose deteksjonssystem ifølge protokollen gitt av produsenten [33].
Statistical Analysis
Alle data ble evaluert med en to-halet uparede student t test eller sammenlignet med en-veis ANOVA og er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. For
in vivo
studier ble narkotikabehandlingsverdier sammenlignet med kontroll kjøretøy behandlings verdier. En
p
verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Uttrykk av RLIP76 i kreft i bukspyttkjertelen celler
Western blot analyser av membranproteinekstrakter. fra humane normale og kreft i bukspyttkjertelen celler indikerte tilstedeværelse av relativt store mengder av RLIP76 i bukspyttkjertelcancerceller sammenlignet med normale celler (fig. 1A). Etter karakterisering av forbedret uttrykk for RLIP76, vi undersøkte videre effekten av RLIP76 hemming eller reduksjon i kreft i bukspyttkjertelen celler. Resultatene fra vurderingen RLIP76 protein nivåer som presenteres i Tabell 1 viser mengder av totale råolje membranproteiner innhentet fra 10
8 celler i log-vekstfase. RLIP76 proteinet representert 12 ± 2 g /10
8 normale celler og ~40 ± 3 pg /10
8 kreft i bukspyttkjertelen celler, henholdsvis (0,19% og ~0.61% av det totale vaskemiddel løselig protein fra membraner av normal og kreft i bukspyttkjertelen celler, henholdsvis). Uttrykket av RLIP76 i kreft i bukspyttkjertelen celler var i sammenlignbare rekkevidde i forhold til resultater fra ulike andre cellelinjer i våre tidligere studier [22], [24], [29].
Prøver av råolje membran fraksjoner av kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC-3 og PANC-1) og normale kontroll celler (HUVEC) inneholdende 100 ug protein ble anvendt for SDS-PAGE og Western blotting. Intensitet av full-lengde RLIP76 protein (~95 kDa) Bandet ble kvantifisert ved å skanne densitometry hjelp Innotech Alpha Imager HP. β-aktin ble benyttet som (panel A) en intern kontroll. Effekt av anti-RLIP76 IgG, RLIP76 siRNA og RLIP76 antisens på normale og kreft i bukspyttkjertelen celler: Virkning av anti-RLIP76 IgG (40 ug /ml endelig konsentrasjon) på celleoverlevelse ble bestemt ved MTT-analyse [29], [30]. Uttømming av RLIP76 ekspresjon av RLIP76 siRNA og RLIP76 antisense (hver 10 ug /ml endelig konsentrasjon) ble utført ved bruk av Transmessenger Transfeksjon-reagens-kit (Qiagen), og Maxfect Transfeksjon-reagens (en molekyl, Inc.), respektivt, ifølge produsentens instruksjoner. Celleoverlevelse ble målt ved MTT cytotoksisitets-analyse 48 timer etter behandling. Verdiene er presentert som gjennomsnitt ± SD fra to separate bestemmelser med åtte-gjentak (n = 16), svarte rammer, normale HUVEC celler; grå barer, BxPC-3 kreft i bukspyttkjertelen celler (panel B) * p 0,05, ** p 0,01 sammenlignet med respektive kontroller. Effekt av RLIP76 anti på PI3K og Akt signalering i kreft i bukspyttkjertelen celler: RLIP76 antisense forårsaket hemming av PI3K /Akt sti i BxPC-3 og Panc-1 celler. Cellene ble behandlet med 10 mikrogram /ml RLIP76 anti i 24 timer og immun-strøket for pPI3K, PI3K, Pakt, Akt, Bim, BCL2, cyclin B1 og CDK4. Det samme blot ble strippet og reprobed for GAPDH å sikre lik protein lasting (panel C). Søylediagram viser kvantifisering av respektive Western blot. Stiplet linje representerer ingen vesentlig endring som observert med eggeantisense (panel D).
RLIP76 hemming eller uttømming fører til cytotoksisitet i kreft i bukspyttkjertelen celler
De første cytotoksiske effekten av RLIP76 hemming i kreft i bukspyttkjertelen celler ble vurdert av RLIP76 hemming hjelp av anti-RLIP76 IgG og RLIP76 utarming hjelp RLIP76 siRNA eller RLIP76 phosphorothioate anti av en etablert MTT celle overlevelse analyse [22], [30]. Protein-A affinitetsrenset immunoglobulin fraksjon oppnådd fra pre-immunserum ble anvendt som kontroll. Anti-RLIP76 IgG ble anvendt i disse eksperimentene ble tidligere vist ved Ouchterlony dobbelt-diffusjon immuno assay for å være ikke-kryss-reaktive med andre proteiner, inkludert Pgp eller MRP [31]. Celler ble behandlet med pre-immun IgG, egge siRNA, eggeantisense, anti-RLIP76 IgG, RLIP76 siRNA eller RLIP76 antisense i 24 timer. Den cytotoksisitet av alle tre RLIP76 målsøkende midler, RLIP76 siRNA, antistoff og antisense, er fortrinnsvis rettet mot de ondartede celler sammenlignet med de ikke-maligne HUVEC-celler, som var lik våre observasjoner med andre maligne (lunge, melanom, nyre, prostata ) og ikke-maligne cellelinjer [22], [24], [29], [34]. I motsetning til tidligere resultater sett med lunge eller tykktarm kreft (hvor alle tre modaliteter ga lignende resultater), RLIP76 anti var betydelig mer effektive i å drepe kreft i bukspyttkjertelen celler enn RLIP76 antistoff (Fig. 1B). RLIP76 medierer overlevelse og proliferasjon av cancerceller ved flere mekanismer som innbefatter forbedrede avgiftning av produkter av lipidperoksydasjon, så vel som regulering av intracellulære signalveier [19], [25], [35]. Den forbedrede effekten av RLIP76 anti var en slående funn som stimuleres ytterligere detaljert undersøkelse av RLIP76 reduksjon i nivåregulering av kritiske intracellulære proteiner i kreft i bukspyttkjertelen celler.
RLIP76 anti nedregulerer PI3K /Akt sti i kreft i bukspyttkjertelen celler
BxPC-3 og Panc-1 celler ble behandlet med RLIP76 antisense for 24 timer, etterfulgt av Western blot analyser for å studere virkningen på kritiske intracellulære proteiner (fig. 1C og D). PI3K /Akt er konstitutivt aktivert i flertallet av bukspyttkjertelsvulster [11]. RLIP76 anti behandling undertrykte betydelig fosforylering av PI3K, en felles oppstrøms signal signaliserer node som tranduces mitogene signaler påfølgende til cellemembranen reseptorer som vekstfaktorer og inte. RLIP76 anti behandling også betydelig redusert proteinnivå og fosforylering av Akt i begge BxPC-3 og Panc-1 celler. Interessant, fosforylering av Akt og PI3K ble ikke påvist i normale HUVEC-celler (data ikke vist), som er i overensstemmelse med den generelle forståelse at PI3K eller Akt er aktivert i transformerte celler [36]. Den PI3K og Akt representere betydelige noder av signal relé som i sin tur regulerer de kritiske nedstrøms mål som er involvert i apoptose, proliferasjon og opprettholde fenotypen av kreft. Aktiveringen av Akt fører til undertrykkelse av ekspresjon av E-cadherin [37]. E-cadherin er ansett som en markør for normal epitelial fenotype og tap av E-cadherin er assosiert med «epithelial mesenchymale overgang (EMT)» og en aggressiv fenotype i-kreft [38]. Aktivering av PI3K fører til ytterligere aktivering av mTOR som undertrykker uttrykk for pro-apoptotisk Bim og favoriserer overlevelse og spredning av kreftceller [39]. De forbedrede nivåer av anti-apoptotiske BCL2 og cyklinavhengig kinase 4 (CDK4) er blitt vist å mediere resistens overfor inhibering mTOR [40]. Nedbryting av RLIP76 av antisense betydelig økte nivåer av pro-differensiering markør E-cadherin og pro-apoptotiske proteiner Bim samtidig redusere nivåene av anti-apoptotiske proteiner BCL2, cyclin B1 og CDK4 i både BxPC3 og Panc-1 kreft i bukspyttkjertelen celler. Dermed uttømming av RLIP76 hatt en betydelig innvirkning på kritiske formidlere av PI3K /Akt signaliserer akse i bukspyttkjertelkreft (fig. 1C og D).
Effekt av RLIP76 utarming på klonogene overlevelse og apoptose
Vi ytterligere bekreftet virkningen av RLIP76 utarming på proliferativ potensial og celle overlevelse ved å vurdere den klonogene potensial og apoptose i BxPC3 bukspyttkjertelen celler. RLIP76 antisense-behandling forårsaket RLIP76 tømming som påvist ved Western blot (Fig. 2A) og inhiberte klonogene potensial som bestemmes av kolonidannende analyse (Fig. 2B). Virkningen av RLIP76 på apoptose ble bestemt ved TUNEL assay. Resultatene av TUNEL-analysen viste ingen påvisbar apoptose med egge antisens mens RLIP76 antisens forårsaket apoptose i BxPC-3 kreft i bukspyttkjertelen celler. Kvantifisering av rød og grønn fluorescens av bilde -J analyse bekreftet de kvalitative fluorescerende funnene at RLIP76 uttømming av antisense var effektive i å indusere apoptose (fig. 2C).
Nedbryting av RLIP76 ved RLIP76 anti hjelp Western blot analyser, spor 1 inneholdt standard, kolonnene 2 og 3, inneholdt uren membranfraksjon av kreft i bukspyttkjertelen (BxPC-3) celler 24 timer etter behandling med antisense RLIP76 og egge antisens, respektivt. Resultatene ble kvantifisert ved å skanne densitometry hjelp Innotech Alpha Imager HP. β-aktin ble benyttet som (panel A) en intern kontroll. Koloni-dannende effektivitet i BxPC-3-celler etter behandling med antisense, ble utført ved farging av cellene med metylenblått og koloniene ble tellet ved bruk av Innotech alfa Imager HP. Verdier er midler ± S.D. av tre separate forsøk. *** P 0,005 sammenlignet med ingen eller eggeanti behandling (panel B). Apoptose i BxPC-3 celler ved RLIP76 anti av TUNEL analysen, eggeantisense (øvre panel) og RLIP76 antisense (nedre panel) behandlede celler. Apoptotiske celler viste grønn fluorescens og karakteristisk for celle krymping. Den tilstøtende bar Diagrammet viser bilde J analyser av TUNEL analysen representerer prosentandelen av TUNEL positive apoptotiske celler (grønn) og normale levende celler (røde). * P. 0,05 (panel C)
RLIP76 uttømming fører til regresjon av kreft i bukspyttkjertelen xenografter i nakne mus
De oven
in vitro
observasjoner reflekterer anti- antineoplastiske virkninger av RLIP76 uttømming ble videre undersøkt
in vivo
mus xenograft modell for kreft i bukspyttkjertelen. Tumor bærende dyr med etablert
s.c
. implantert BxPC3 bukspyttkjertelen celle svulster (~42 mm
2) ble behandlet med 200 mikrogram av enten RLIP76 antistoff, RLIP76 siRNA eller RLIP76 anti av
i.p..
injeksjon. Vektøkning var sammenlignbare med ikke-tumorbærende kontroller, og ingen åpenbar-toksisitet var tydelig. Behandlingen med RLIP76 antistoff, RLIP76 siRNA eller RLIP76 antisense resulterte i raske og dramatiske reduksjoner i svulster (fig. 3A og B). Den RLIP76 antistoff, RLIP76 siRNA eller RLIP76 antisensprimere behandlede dyr peiling etablert subkutant svulster var i live for ~298 dager uten noen bevis for tilbakefall. Det var ukontrollert vekst i alle kontrollgruppene som ble behandlet med pre-immunserum, egge siRNA og egge antisens og følgelig kontrollgruppene ble kritisert av ~49 dager (fig. 4). Effekten av tumorvolumreduksjon var tydelig fra tumor-vekter på dag 47 etter starten av behandlingen (fig. 3B). Effektiviteten av RLIP76 antisense i nedbrytende svulst RLIP76
in vivo
er demonstrert i Western blot for RLIP76 fra tumor homogenates (Fig. 3B, innfelt). Etter RLIP76 utarming og hemming ble regresjon av tumor implantater sett i alle dyr, uten noen åpenbare toksiske effekter eller effekter på vektøkning
For xenoimplantater studier, brukte vi trettiseks 11 uker gammel Hsd.: atymiske nakne nu /nu mus (Harlan, Indianapolis, IN) randomisert 6 dyr hver i seks grupper som følger: 1) pre-immun serum, 2) egge siRNA, 3) egge anti-sense DNA, 4) RLIP76 antistoffer, 5) RLIP76 siRNA og 6) RLIP76 anti. Alle 36 dyr ble injisert med 2 x 10
6 humane kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC-3) suspensjoner i 100 ul PBS, subkutant til en flanke av hver nu /nu nakne mus. Dyrene ble undersøkt daglig for tegn på tumorvekst og kroppsvekter. Når tumorer nådde et tverrsnittsareal av ~42 mm
2 (47 d senere), ble dyrene randomisert i i behandlingsgrupper som vist i figur 4. Behandlingen besto av 200 ug av RLIP76 antistoffer, siRNA eller antisens i 100 ul PBS. Kontrollgrupper ble behandlet med 200 ug /100 ul av enten pre-immunserum, egge siRNA eller kryptert anti-sense DNA. Svulster ble målt i to dimensjoner ved hjelp av målepunktene. Tumormålinger blir presentert med alle kontrollgruppene (pre-immun IgG, egge siRNA eller antisense) versus alle behandlede grupper (anti-IgG RLIP76, RLIP76 siRNA, eller anti-sense) (panel A). Tumor-vekt er redusert på dag 47 etter behandling start (panel B) og tumor RLIP76 er oppbrukt av antisense (panel B, innfelt). Svulster ble skåret ut 48 timer etter antisense-behandling, veiet og homogenisert, og alikvoter inneholdende 100 pg protein fra hverandre, ble lastet inn i SDS-PAGE for Western blotting mot anti-RLIP76 IgG (n = 3, baner 1-3, eggeantisense behandles, og baner 4-6, RLIP76-antisens behandlet). Resultatene ble kvantifisert ved å skanne densitometry. Membran ble strippet og re-analysert med β-actin antistoff for å verifisere lik protein lasting, * p 0,05 sammenlignet med respektive kontroller. Western blot-analyse av tumorvev lysater: mekanistisk grunnlag for tumorvekst inhibering av RLIP76-antisense ble bestemt i tumorlysatene fra kontroll og RLIP76-antisens-behandlede mus. Tumorvev ble homogenisert, og ~70 ug protein ble løst på SDS-PAGE og analysert for pPI3K, PI3K, Pakt, Akt, PCNA, Bim, E-cadherin, Cyclin B1 og CDK4. Blottene ble strippet og reprobed for GAPDH å sikre lik protein lasting (panel C). Søylediagram representerer densitometry analyser. Stiplet linje representerer ingen vesentlig endring som observert med eggeantisense (panel D)
Hsd. Atymiske nakne nu /nu mus ble hentet fra Harlan, Indianapolis, IN. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med en protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
