Abstract
Bakgrunn
β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase -3 genet (
B3GNT3
) koder for et medlem av B3GNT familie som fungerer som ryggraden strukturen dimer sialyl-Lewis A og er involvert i L-selectin ligand biosyntese, lymfocytt homing og lymfocytt menneskehandel. B3GNT3 har vært innblandet som et viktig element i utviklingen av visse kreftformer. Men egenskapene til B3GNT3 i utvikling og progresjon av kreft fortsatt i stor grad ukjent. Dermed vår studie forsøkte å undersøke uttrykket mønster og den prognostiske verdien av B3GNT3 hos pasienter med tidlig stadium livmorhalskreft.
Metoder
mRNA og proteinnivåer
B3GNT3
uttrykk ble undersøkt i åtte livmorhalskreft cellelinjer og ti sammenkoblede livmorhalskreftsvulster, ved hjelp av real-time PCR og Western blotting, henholdsvis. Immunhistokjemi (IHC) ble brukt til å analysere B3GNT3 protein ekspresjon i parafininnstøpte vev fra 196 tidlig stadium cervikale kreftpasienter. Statistiske analyser ble brukt for å vurdere sammenhengen mellom
B3GNT3
uttrykk score og kliniske parametre, samt pasientens overlevelse.
Resultater
B3GNT3
uttrykk var signifikant oppregulert i livmorhalskreft cellelinjer og lesjoner sammenlignet med normale celler og tilstøtende noncancerous cervical vev. I de 196 tilfellene av testede tidlig stadium livmorhalskreft prøvene ble B3GNT3 proteinnivået positivt korrelert med høy risiko typer av humant papillomavirus (HPV) infeksjon (p = 0,026), FIGO stadium (P 0,001), tumorstørrelse (P = 0,025), tumor tilbakefall (P = 0,004), vital status (P 0,001), samtidig kjemoterapi og strålebehandling (p = 0,016), lymphovascular plass engasjement (P = 0,003) og viktigst, lymfeknutemetastase (P = 0,003 ). Pasienter med høy B3GNT3 ekspresjon hadde en kortere total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS) sammenlignet med de med lav ekspresjon av dette protein. Multivariat analyse antydet at B3GNT3 uttrykk er en uavhengig prognostisk indikator for livmorhalskreftpasienter.
Konklusjoner
Vår studie viste at forhøyet B3GNT3 uttrykket er assosiert med bekkenlymfeknutemetastase og dårlig utfall i tidlig stadium livmorhalskreftpasienter. B3GNT3 kan være en roman prognostisk markør og terapeutiske mål for behandling av livmorhalskreft
Citation. Zhang W, Hou T, Niu C, Song L, Zhang Y (2015) B3GNT3 Expression er en roman Marker korrelert med bekken lymfeknutemetastase og dårlige kliniske resultatet i tidlig stadium livmorhalskreft. PLoS ONE 10 (12): e0144360. doi: 10,1371 /journal.pone.0144360
Redaktør: Valli De Re, Centro di riferimento Oncologico, IRCCS National Cancer Institute, ITALIA
mottatt: 16 juni 2015; Godkjent: 17 november 2015; Publisert: 28.12.2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hos kvinner er livmorhalskreft den tredje vanligste diagnosen ondartet svulst i skjede over hele verden, og står for anslagsvis 274000 dødsfall på verdensbasis hvert år [1]. Tallrike studier har indikert at høyrisiko typer av humant papillomavirus (HPV) infeksjon er en viktig risiko for livmorhals utvikling, men det er fortsatt ikke tilfredsstillende i diagnostisering og forutsi prognose [2]. Fremskritt i terapeutiske metoder og diagnostiske verktøy har redusert forekomst og dødelighet av livmorhalskreft [3]. Men det er fortsatt den viktigste årsaken til gynekologisk onkologi relaterte dødsfall i utviklingsland, spesielt pasienter med lymfeknutemetastase [4]. Videre er lymfeknutemetastase den sterkeste prognostiske faktoren for tidlig stadium livmorhalskreft (FIGO stadium Ib-IIa) og det avgjør behandlingsstrategi for livmorhalskreft [5]. Endrede uttrykk for onkogener, for eksempel
Bmi-en
,
URG4 Hotell og
C14ORF166 product: [6-8], har blitt identifisert som potensielle prognostiske markører i livmorhalskreft. Imidlertid er kraften i mange identifiserte biomarkører for å forutsi lymfeknutemetastase og klinisk utfall av individuelle tumorer begrenset. Dermed er identifisering av nye og særegne biomarkører for tidlig deteksjon og prediksjon av lymfeknutemetastase og prognose i livmorhalskreft viktig.
Genet som koder β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase-3 (B3GNT3), tidligere kalt kjerne 1β3GlcNAcT, ligger på kromosom 19q13.1 og består av tre eksoner [9]. Det er et medlem av β3GlcNAcT familie med en full-lengde mRNA fra 2720 bp som koder for et høyt konservert 43-kDa protein, som er klassifisert som en type II transmembrane protein [10]. Den β3GlcNAcT familien omfatter minst åtte forskjellige β3GlcNAcTs som er assosiert med malign transformasjon [11]. Nedregulering av B3GNT1 er assosiert med dårlig resultat i pankreatisk duktus adenokarsinom [12]. Etcheverry [13] fant at B3GNT5 ble overexpressed med en hypomethylated promoter i glioblastom vev sammenlignet med kontroll hjernen vev. Shibata [14] har vist at B3GNT7, som fungerer i biosyntesen av HMOCC-1-antigenet, blir uttrykt i høyere i humane ovarie kreftceller i forhold til normale eggstokkene. Nivået av B3GNT8 transkript ble økt markert og kan være involvert i malignitet i leukemi, laryngeal karsinom, tykktarm og magekreft [15, 16, 17, 18].
B3GNT3 ekspresjon er blitt observert i normalt vev, inkludert i tykktarmen, jejunum, magen, spiserøret, placenta og trakea [19]. Nylig, Ho [20] rapporterte at B3GNT3 kan spille en viktig rolle i å undertrykke de ondartede fenotypene av neuroblastom-celler, inkludert migrering og invasjon, ved undertrykkelse av FAK, Akt og ERK, som er viktige nedstrømssignalmolekyler for integriner og en rekke vekstfaktorreseptorer . Imidlertid er det rapportert at B3GNT3 protein deltar i utvikling og progresjon av kreft hos mennesker, for eksempel non-Hodgkin lymfom (NHL), tykktarmskreft, spiserørs plateepitelkreft (OSCC), og bukspyttkjertelen og hepatocellulære kreft [10,19,21 ]. For eksempel, han [21] fant en sammenheng mellom
B3GNT3
locus, CA19-9 nivåer og sialyl Lewis A antigen, som kan være mulig mekanisme i OSCC, bukspyttkjertelen og hepatocellulære kreft. I etiologien av NHL, spiller B3GNT3 dominerende rolle i L-selektin ligand biosyntese, noe som er viktig for tumorcelleoverlevelse og metastase [10]. B3GNT3 er sannsynlig å være den mest sannsynlige kandidat som er involvert i biosyntesen av ryggraden strukturen av dimerisk sialyl Lewis A (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc), som er en kreft som har sammenheng glykosphingolipid antigen i humane tarmkreft vev og tykktarmskreft cellelinjen Colo205 [19]. Dessuten, Yeh et al. [9] rapporterte at B3GNT3 styrer forlengelsen av kjernen 1 mucin-type O-glykan, som ofte danner 6-sulfo sialyl Lewis X-antigen, en epitop uttrykt i høye endoteliale venyler (HEV), og fungerer som en L-selektin ligand kreves for lymfocytt homing. Disse funnene antydet at B3GNT3 kan spille ulike roller i utvikling og progresjon av ulike kreftformer. Ikke desto mindre, studier på sammenhengen mellom B3GNT3 og kreft er sjeldne, og det er ingen publisert rapport på egenskapene til B3GNT3 Uttrykket og klinisk /prognostisk betydning i livmorhalskreft, særlig korrelasjonen mellom B3GNT3 ekspresjon og bekkenlymfeknutemetastase (PLNM).
Her ønsket vi å utforske uttrykk mønster av B3GNT3 i livmorhalskreft cellelinjer og tidlig stadium livmorhalskreftprøver. Videre undersøker vi forholdet mellom den og clinicopathological parametere og analysere sin verdi i prognosen for tidlig stadium livmorhalskreftpasienter basert på kliniske utfall data.
Metoder
Etikk uttalelse
den forskningsetiske komité for Cancer Center, Sun Yat-Sen University (Kina) gitt etisk godkjenning for denne studien, og alle pasientene gitt skriftlig informert samtykke. Alle prøvene ble håndtert og lagret anonymt i henhold til etiske og juridiske standarder.
Cellelinjer
livmorhalskreft cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA). De livmorhalskreft cellelinjer, inkludert HeLa, HeLa229, HCC94, Siha, ME-180, MS751, Caski og C-33A, ble opprettholdt i RPMI-1640 medium (Gibco BRL, Rockville, MD) supplert med 10% føtalt bovint serum ( FBS) (HyClone, Logan, UT, USA) og 1% antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 lg /ml streptomycin). Primære normale livmorhals epitelceller (NC) ble isolert fra noncancerous epitelvev av livmorhalsen og ble dyrket i fullstendig KeratinocyteSFM medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). For bruk av kliniske materialer for forskningsformål, ble skriftlig informert samtykke innhentes fra pasienter og godkjenning ble innhentet fra Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center Institutional forskningsetiske komité.
Prøver og kliniske kjennetegn
Alle pasienter ga informert skriftlig samtykke for analyse av deres vev for forskningsformål, og studien ble godkjent av Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center Institutional Review Board. Totalt 193 paraffinembedded livmorhalskreft prøver ble innhentet fra avdeling for patologi ved Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center mellom 2007 og 2009. Tumor iscenesettelse og clinicopathological klassifisering ble utført i henhold til International Federation of obstetrikk og gynekologi, 2009 (FIGO) klassifisering av karsinom i livmorhalsen. De 193 pasientene var i IB1-IIA2 stadium livmorhalskreft og alle fikk en radikal hysterektomi og lymphadenectomy uten preoperativ strålebehandling, kjemoterapi eller hormonbehandling. I vår studie, Pasienter med noen av høyrisikofaktorer fikk postoperativ kjemoterapi og /eller strålebehandling. I detalj, «høy risiko» faktorer inkludert PLNM høy differensiering klasse, positiv parametrial engasjement, positiv lymphovascular plass engasjement, positiv kirurgisk margin, dyp stromal invasjon og stor svulst størrelse ( 4 cm). Dessuten pasienter med bare dypt stromal invasjon eller positive kirurgiske marginer fått strålebehandling. Pasienter med bare lymphovascular plass engasjement, høy differensiering klasse, eller stor svulst størrelse ( 4 cm) fikk kjemoterapi. Clinicopathological data ble samlet inn fra utålmodige medisinske poster og oppsummert i tabell 1. Alle pasientene hadde oppfølgings poster for mer enn 5 år og oppfølging fristen ble januar 2014. Survival tid ble regnet fra dato for operasjonen derfor følgende opp fristen, eller dødsdato (vanligvis et resultat av kreft tilbakefall eller metastaser). Median oppfølgingstid for primærlivmorhalskreft kohorten var 51 måneder, med en oppfølging tidsrom på 3 til 99 måneder. Den pre-operative HPV teste vårt sykehus brukes til å undersøke smittestatus av pasientene var polymerase chain reaction påvisning av HPV. I denne kohort, 153 cervikale kreftpasienter viste HPV-infeksjon (+), mens 40 kreftpasienter livmorhals ble HPV-infeksjon (-). Seksten friske livmorhalskreft og sammenkoblede tilstøtende noncancerous cervical vev (ANT) ble samlet for real-time PCR, Western blotting og immunhistokjemi (IHC) analyse.
qPCR
Totalt cellulært RNA ble isolert fra dyrkede celler og seksten friske livmorhalskreft og sammenkoblede tilstøtende noncancerous prøver cervical vev ved hjelp av TRIzol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som produsent instruert. Disse RNA-prøver ble forbehandlet med RNase-fri DNase, og 2 ug RNA fra hver prøve ble anvendt for komplementær deoksyribonukleinsyre (cDNA) syntese priming med tilfeldige heksamerer. Primerne ble designet av Primer Express v 2.0 programvare (Applied Biosystems). De følgende primere ble anvendt: B3GNT3, 5′-GCCGGAGATACTTCATCCTG-3 «og 5′-GAGAGGAGCAGGTAGAGGGG-3′; glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) genet, 5»-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3 «og 5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3». Påvisningen reagens anvendt i dette forsøk var SYBR Green. Totale volum av hver prøve ble 10 ul: 2 * SYBR grønn blanding: 5 ul; cDNA: 1UL; Forward primer: 0,5 ul; Omvendt primer 0,5 ul; ddH2O 3UL. For PCR-mediert amplifikasjon av B3GNT3 cDNA, et første amplifikasjon ved anvendelse av B3GNT3-spesifikke primere ble utført med et denatureringstrinn ved 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 30 denaturering sykluser ved 95 ° C i 60 s, primer-hybridisering ved 55 ° C i 30 s, og primer-forlengelse ved 72 ° C i 30 sek. Ved gjennomføringen av sykkel trinn, en avsluttende forlengelsestrinn ved 72 ° C i 5 minutter ble gjort før reaksjonsblandingen ble lagret ved 4 ° C. Sanntids-PCR ble deretter anvendt for å bestemme fold økning av B3GNT3 mRNA i livmorhalskreft cellelinjer i forhold til normale cervikale epitelceller og i hver av de primære cervikale tumorer i forhold til den tilstøtende normalt vev tatt fra samme pasient. Hvert forsøk ble utført i triplikat og gjentas minst tre ganger. MRNA uttrykk for B3GNT3 ble normalisert til GAPDH.
Western blotting
Totalt protein ble fremstilt ved celle totale protein utvinning kits i henhold til produsentens instruksjoner (Millipore, Bedford, MA). Like mengder av hver proteinekstrakt (30 ug) ble elektroforetisk separert på 9,5% SDS-polyakrylamidgeler. Etter overføring til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA), ble membranene blokkert i 1 time ved romtemperatur med 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20 (TBST) . Membranene ble deretter inkubert med anti-B3GNT3-antistoff (1: 1000, Proteintech, 18098-1-AP) over natten ved 4 ° C. Pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin-IgG-antistoff (1: 2000, Santa Cruz, SC-2004) ble anvendt for å bestemme B3GNT3 uttrykk. Til slutt ble B3GNT3 uttrykk påvist ved anvendelse av ECL-prime Western blotting deteksjonsreagensen (Amersham) i henhold til produsentens instruksjoner. Utslettet membraner ble strippet og re-analysert med en anti-Alpha-Tubulin antistoff (Sigma, St. Louis, MO) som en lasting kontroll.
Immunhistokjemisk (IHC) analyse
Immunhistokjemisk farging ble gjennomført for å vurdere proteinekspresjon mønster av B3GNT3 i 193 parafininnstøpte humane cervikale kreftvevet. Prosedyrene ble utført med klassiske protokoller. I korte trekk ble de parafininnstøpte vevsblokker fra livmorhalskreftpasienter skåret i 4-mikrometer tykke seksjoner og oppvarmet ved 65 ° C i 30 min. Snittene ble deparaffinized med xylen og deretter rehydrert i vannet. Glassene ble neddykket i EDTA antigen gjenfinning buffer og deretter mikrobølgeovnen ble behandlet for antigen gjenfinning. Deretter ble endogen peroksidaseaktivitet blokkert med 3% hydrogenperoksid i 15 minutter, fulgt av inkubering med 1% bovint serumalbumin for å blokkere ikke-spesifikk binding. Prøvene ble inkubert over natten ved 4 ° C med et kanin polyklonalt antistoff mot B3GNT3 (Upstate Biotechnology, 1: 100, Proteintech, 18098-1-AP). For negative kontroller ble den anti-B3GNT3 antistoff erstattet med normalt geiteserum. Etter vasking med PBST, ble vevet glir sekvensielt inkubert med biotinylert anti-kanin-sekundært antistoff (Sigma) ved romtemperatur i 30 minutter, fulgt av ytterligere inkubering med streptavidin-pepperrot peroksydase kompleks (Sigma) ved romtemperatur i 30 min. De vevssnitt ble senket ned i 3-amino-9- etyl karbazol og kontra med 10% Mayers hematoksylin, dehydrert og montert i Crystal Mount.
Evalueringen av graden av farging ble anmeldt og scoret uavhengig av to patologer blindet til de histopatologiske trekk og pasientdata av prøvene. For semikvantitativ analyse, var stillingen av hver vevsprøve, basert på både den andelen av positivt fargede tumorceller og intensiteten av fargingen. De immunofarging resultater for B3GNT3 ble bedømt på grunnlag av følgende kriterier: (i) den andelen av positive tumorceller i tumorvevet: 0 (0%), 1 (1% -10%), 2 (11% -50%) , 3 (51% -75%) og 4 (76% -100%); (Ii) farging intensitet: 0 (ingen flekker), en (svak farging = lys gul), 2 (moderat farging = gul brun), 3 (sterk farging = brun). Fargingen Indeksen ble beregnet som produktet av andelen av positive celler x at resultatet av fargeintensitet (område fra 0 til 12). Cut-off-verdier for B3GNT3 ekspresjon ble valgt på basis av et mål på heterogeniteten med log-rank test statistisk analyse med hensyn på total overlevelse. En optimal verdi cutoff ble identifisert som følger:. Fargingen indeksen poengsum of≥ 6 ble ansett som svulster med høy B3GNT3 uttrykk og ≤4 ble ansett som svulster med lav uttrykk for B3GNT3
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 16.0 statistisk programpakke (SPSS, Chicago, USA). Chi-kvadrat test og Fishers eksakte test ble brukt for å vurdere forholdet mellom B3GNT3 uttrykk og clinicopathological egenskaper. Bivariate korrelasjoner mellom variabler ble beregnet ved Spearman rang korrelasjonskoeffisienter. Overlevelseskurver ble plottet ved Kaplan-Meier-metoden, og forskjeller ble analysert ved hjelp av log-rank test. En Cox regresjon proporsjonale farer modellen ble brukt for univariate og multivariate analyser for å bestemme selvstendig betydning av relevante kliniske kovariater. Verdier av
P 0
.
05
i alle tilfeller ble vurdert som statistisk signifikante.
Resultater
Forhøyet uttrykk for B3GNT3 i livmorhalskreft cellelinjer
Real- time PCR og Western blotting ble brukt for å undersøke nivåer av B3GNT3 uttrykk i åtte livmorhalskreft cellelinjer (HeLa, HeLa 229, HCC 94, C33A, CaSki, MS751, ME-180 og Siha) sammenlignet med en normal cervical epithelial cellelinje (NC ).
Western blotting-analyse viste at alle de åtte livmorhalskreft cellelinjer (MS751, C33A, Hela, HeLa229, Siha, HCC94, CaSki, og ME-180) viste signifikant høyere nivåer av B3GNT3 protein sammenlignet med NC ( fig 1A).
B3GNT3
mRNA uttrykk var minst 3,5 ganger større i livmorhalskreft cellelinjer i forhold til NC (figur 1B). Resultatene viste at B3GNT3 er oppregulert i livmorhalskreft cellelinjer.
(a og b) Uttrykk for B3GNT3 mRNA og protein i livmorhalskreft cellelinjer (C33a, Ca Ski, HeLa, HeLa 229, MS751, Me- 180, ble Siha og HCC 94) og normale livmorhalsen cellelinjer undersøkt ved western blotting (a) og kvantitativ real-time PCR (qPCR) (b). Uttrykket nivåer ble normalisert mot α-tubulin og GAPDH, respektivt. Feilstolpene representerer standardavviket av den midlere (SD) beregnet ut fra tre parallelle forsøk. * P 0,05.
B3GNT3 er overuttrykt i livmorhalskreft vev
Etter det, om B3GNT3 oppregulering funnet i livmorhalskreft cellelinjer var klinisk relevant ble bekreftet av kvantitativ real-time PCR (qPCR ) og western blotting analyse i 10 livmorhalskreft vev (T) matchet med tilstøtende noncancerous vevsprøver (ANT). Som vist i figur 2B, er uttrykk for
B3GNT3
mRNA var dramatisk høyere i de 10 livmorhalskreft vevsprøver enn i de sammenkoblede normale vev, med differensial ekspresjonsnivået i området fra 4.2- til 17,4 ganger. I samsvar med disse resultatene, det B3GNT3 protein viste høyere overflod i alle 10 livmorhalskreft prøvene sammenlignet med matchet ANT (Fig 2A).
(a) Representative bilder av western blotting analyser av B3GNT3 protein uttrykk i ti matchet par av livmorhalskreft vev (T) og tilstøtende noncancerous vev (ANT). a-Tubulin ble benyttet som kontroll lasting. (B) Den gjennomsnittlige T /ANT prosenter av
B3GNT3
mRNA uttrykk i den parede livmorhalskreft (T) og tilstøtende noncancerous vev (ANT) ble kvantifisert ved kvantitativ real-time PCR (qPCR) og normalisert mot GAPDH. Feilstolpene representerer standardavviket av den midlere (SD) beregnet ut fra tre parallelle forsøk. (C) Immunhistokjemisk analyse av B3GNT3 protein uttrykk i ti par matchet livmorhalskreft vev. * P 0,05.
Sammenhengen mellom B3GNT3 overekspresjon og kliniske trekk ved livmorhalskreft
Immunohistochemistry (IHC) ble utført for å undersøke uttrykk mønster av B3GNT3 protein i en retrospektiv kohort av 193 livmorhalskrefttilfeller , inkludert 85 tilfeller av scenen IB1 (44,1%), 29 tilfeller av scenen IB2 (15,0%), 56 tilfeller av scenen IIA1 (29,0%) og 23 tilfeller av scenen IIA2 (11,9%). Som vist i figur 3A, ble immunreaktiviteten av B3GNT3 protein påvist ved varierende nivå og lokalisert hovedsakelig i den cellulære plasma. Positiv farging for B3GNT3 proteinet ble sett i 78 tilfeller (40,4%) av 193 som deltok pasientprøver, mens 115 tilfeller (59,6%) farget negativt eller bare svakt for B3GNT3 protein (tabell 1). Intens uttrykk for B3GNT3 protein ble registrert i 24,7% (21/85), 41,4% (12/29), 58,9% (33/56), og 52,2% (12/23) av livmorhalskreft av FIGO stadium Ib1, Ib2, IIa1and IIa2, henholdsvis (
P
0,05, χ
2 test). Interessant, kvantitative IHC-farging data viste at midlere optiske tetthet (MOD) verdier av B3GNT3 farging i den lymfeknutemetastase gruppe var statistisk høyere enn i den lymfeknutemetastase-fri gruppe (P 0,001, figur 3B).
Positiv B3GNT3 farging ble observert hovedsakelig i cytoplasma av livmorhalskreftceller. (A) a og b, ble B3GNT3 uttrykk ikke detektert i normale vev i livmorhalsen; c og d, representative bilder av svak B3GNT3 flekker i livmorhalskreft vev; e og f, representative bilder av moderat B3GNT3 flekker i livmorhalskreft vev; g og h, representative bilder av sterk B3GNT3 flekker i livmorhalskreft vev. (B) Den statistiske analyse av den gjennomsnittlige midlere optiske tetthet (MOD) av B3GNT3 farging i lymfeknutemetastase-gruppen og lymfeknutemetastase-fri gruppe. * P 0,05. (C) Kaplan-Meier-kurver av univariat analyse av data (log-rank test) sikret total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS) for pasienter med høy versus lav B3GNT3 uttrykk.
IHC farging av B3GNT3 protein uttrykk nivåer ble analysert videre for å bestemme deres forhold til clinicopathological egenskapene til livmorhalskreft. Som vist i tabell 2, høyt B3GNT3 protein uttrykk tendens til å være sterkt korrelert med HPV-infeksjon, FIGO stadium, tumorstørrelse, tumor tilbakefall, vital status, samtidig kjemoterapi og strålebehandling, lymphovascular plass engasjement og viktigst, lymfeknutemetastase (tabell 2) . Disse data ble ytterligere bekreftet ved Spearmans korrelasjonsanalyse (Tabell 3). Men ingen signifikante sammenhenger ble funnet mellom B3GNT3 protein uttrykk og pasientens alder, histologisk differensiering klasse, plateepitelkarsinom antigen, histologisk type cellegift, stråling, myometrium invasjon, egenskaper ved kirurgisk margin og infiltrasjon av parauterine organ hos pasienter med livmorhalskreft .
Høy B3GNT3 uttrykk spår dårlig prognose av pasienter med tidlig stadium livmorhalskreft
i vår studie kohort, den prognostiske betydningen av B3GNT3 protein uttrykk i livmorhalskreft ble utforsket ved hjelp av Kaplan-Meier analyse og log-rank test. Den log-rank test viste at overlevelse var signifikant forskjellig mellom de lave og høye B3GNT3 protein expression grupper (både P 0.001, figur 3C). Pasienter med høye B3GNT3 nivåer hadde signifikant kortere total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS) enn de med lave nivåer. De kumulative OS og DFS ratene var 90,5% og 97,2%, henholdsvis, i den lave B3GNT3 gruppe, mens de var bare 65,7% og 84,7%, henholdsvis, i det høye B3GNT3 gruppe. En validerings kohorten ble ansatt for å ytterligere evaluere den prognostiske verdien av B3GNT3 for bestemte undergrupper av pasienter, som ble stratifisert etter alder, HPV-infeksjon, FIGO Stage, PLNM, plateepitelkarsinom antigen, tumor størrelse, differensiering klasse, cellegift, stråling, samtidig kjemoterapi og strålebehandling, myometrium invasjon, egenskaper ved kirurgisk margin, infiltrasjon av parauterine orgel og lymphovascular plass engasjement. Uttrykket av B3GNT3 protein var sterkt assosiert med OS varigheten av pasienter uten PLNM (log-rank test, P 0,001), med plateepitelkarsinom antigen ≥ 1,5 ng /ml (log-rank test, P = 0,002), med HPV-infeksjon (log-rank test, P = 0,001), med dyp stromal invasjon (log-rank test, P = 0,028), med klinisk stadium (stadium Ib1-Ib2, log-rank test, P = 0,004; Stage IIa1-IIa2 , log-rank test, P = 0,040), med histologisk differensiering klasse (grad 1-2, log-rank test, P 0,001; grade 2-3, log-rank test, P = 0,001), og med kjemoterapi ( log-rank test, P = 0,004) (fig 4). Univariate Cox regresjonsanalyse viste at på et høyere nivå av B3GNT3, PLNM, plateepitelkarsinom antigen, lymphovascular plass engasjement og tilbakefall spår en dårlig prognose for tidlig stadium livmorhalskreftpasienter (tabell 4). Deretter multivariat analyse ved hjelp av Cox-modell for alle variabler som var signifikant i den univariate analysen viste at B3GNT3 uttrykk, PLNM og tilbakefall fungerte som uavhengige prognostiske faktorer for pasienter med livmorhalskreft (tabell 4). Således våre resultater indikerte at B3GNT3 proteinet kan representere en potensiell prognostisk indikator for tidlig stadium cervikale kreftpasienter.
(a) total overlevelse (OS) av pasientene uten lymfeknutemetastase med høy versus lav B3GNT3 uttrykk . (B) OS for pasienter med plateepitelkarsinom antigen 1.5ng /ml med høy versus lav B3GNT3 uttrykk. (C) OS for pasienter med HPV-infeksjon med høy versus lav B3GNT3 uttrykk. (D) OS for pasienter med dyp stromal invasjon med høy versus lav B3GNT3 uttrykk. (E) OS for pasienter ved stadier Ib1-Ib2 med høy versus lav B3GNT3 uttrykk. (F) OS for pasienter ved stadier IIa1-IIa2 med høy versus lav B3GNT3 uttrykk. (G) OS for pasientene ved differensiering 1-2 med høy versus lav B3GNT3 uttrykk. (H) OS for pasienter ved differensiering 2-3 med høy versus lav B3GNT3 uttrykk. (I) OS for pasienter med høy versus lav B3GNT3 uttrykk som fikk kjemoterapi.
Diskusjoner
I denne studien, viste vi, for første gang, som uttrykk for B3GNT3 protein er oppregulert i livmorhalskreft og korrelerer med kliniske egenskaper, spesielt PLNM av pasienter med tidlig stadium livmorhalskreft. Videre høy B3GNT3 protein uttrykk redusert OS og DFS av disse pasientene, spesielt de som fikk kjemoterapi. Multivariat analyse viste at B3GNT3 uttrykket kan være en uavhengig prognostisk indikator for overlevelse i livmorhalskreftpasienter.
B3GNT3 er involvert i biosyntesen av poly-N-acetyllactosamine kjedene og biosyntesen av ryggraden strukturen av dimerisk sialyl Lewis A . De essensielle roller B3GNT3 i tumorigenesis har blitt avslørt nylig [10, 19, 20, 21]. Shiraishi [19] viste at B3GNT3 ble sterkt uttrykt i tykktarmskreft cellelinje Colo205. De rapporterte at menneskelige kolon kreft vev og tykktarmskreft cellelinje Colo205 inneholde kreftfrem forbundet glykosfingolipider med dimere Lewis A-antigener (Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1-3Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc) og B3GNT3 er sannsynlig å være den mest sannsynlige kandidat som er involvert i biosyntesen av ryggraden strukturen av dimerisk sialyl Lewis A (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc). Cerhan [10] fant at B3GNT3 er relatert til immunforsvaret og betennelse, og spiller en viktig rolle i lymfocytt menneskehandel og migrasjon, noe som fører til svulst celle overlevelse og metastase i NHL. En annen studie viste at
B3GNT3
locus er assosiert med CA19-9 nivåer i bukspyttkjertelkreft [21]. B3GNT3 er et β-1, 3-N-acetylglucosmaniyltransferase involvert i produksjon av ryggraden strukturen av dimerisk sialyl Lewis A, som er den karbohydrat antigen epitop av CA19-9. Derfor kan dette være mulig mekanisme underliggende sammenhengen mellom variantene i
B3GNT3
locus og CA19-9 konsentrasjoner. Deres studie [21] foreslått at B3GNT3 spiller en onkogen rolle i visse typer kreft. Imidlertid Ho [20] rapporterte at B3GNT3 kan spille en kritisk rolle i å undertrykke de ondartede egenskaper av neuroblastomer og dets endrede ekspresjon kan bidra til patogenesen av neuroblastom. Det er vanlig at visse gener har onkogene roller i flere typer kreft, men har anti-onkogene roller i andre typer kreft. For eksempel er PTK6 uttrykt i invasive ductal brystkreft, serøs ovarialcancer, ikke-småcellet lungekreft, tykktarmskreft og hode og nakke kreft [22-26]. I kontrast, kan PTK6 være en viktig tumor suppressor i ulike menneskelige kreftformer, som menneskelig strupe plateepitelkarsinom og esophageal plateepitelkarsinom [27, 28]. Dessuten rolle B3GNT3in livmorhalskreft er uklart. Derfor vurderte vi om B3GNT3 er oppregulert i livmorhalskreft og er klinisk forbundet med utvikling og progresjon av livmorhalskreft. I vår studie rapporterte vi at B3GNT3 mRNA og protein ble overexpressed i livmorhalskreft cellelinjer og livmorhalskreft prøver (faser Ib-IIa). Et kommersielt tilgjengelig antistoff mot B3GNT3 ble anvendt i immunhistokjemi. IHC-farging viste en negativ eller bare svakt i normalt vev i livmor. Imidlertid ble positiv farging for B3GNT3 protein sett i livmorhalskreft prøver. Videre våre resultater fra Realtime-PCR, Western blotting og IHC var konsekvent. Derfor erkjenner dette polyklonale antistoff spesifikt bare B3GNT3 i livmorhalskreft vev. Videre fant vi at B3GNT3 uttrykk korrelerer med kliniske karakteristika for pasienter med tidlig stadium livmorhalskreft som HPV-infeksjon, FIGO stadium, tumorstørrelse, tumor tilbakefall, vital status, samtidig kjemoterapi og strålebehandling, lymphovascular plass engasjement og viktigst, lymfeknute metastasering.
