Abstract
Aim
p16
Metylering oppstår ofte i kreftutvikling. Mens det har vært en teori om at
p16
metylering stater er dynamisk opprettholdt i kreftceller, har direkte bevis som støtter denne hypotesen ikke vært tilgjengelig før nå.
Metoder
En fusjon cellemodell ble etablert som omprogrammeres det native DNA-metylering mønster av cellene. Metylering status for
p16
lene var deretter gjentatte ganger analysert kvantitativt i fusjonen monoklonale, foreldrekreftcellelinjer (
p16
-Helt metylert-AGS og unmethylated-MGC803), og HCT116 ikke- fusjon celle ved hjelp DHPLC og bisulfite sekvensering. Histone metylering ble analysert ved hjelp av kromatin immuno-nedbør (chip) -PCR. P16 uttrykk status ble bestemt ved bruk av immunfarging og RT-PCR.
Resultater
metylering status for flertallet av
p16
lene ble stabilt opprettholdt i fusjonen monoklonalt celler etter opp til 60 passasjer. Viktigst, focal de novo metylering, demetylering og hydroksymetylering ble konsekvent observert i løpet av ca 27% av
p16
alleler i fusjons monoclones, men ikke homozygously denaturert eller unmethylated foreldre celler. Videre subkloner av monoclones konsekvent hevdet det samme
p16
metylering mønster. Et lignende fenomen ble også observert ved hjelp av
p16
hemi-metylert HCT116 non-fusion kreftcellelinje. Interessant, transkripsjon ble ikke observert i
p16
lene som ble hydroxymethylated med et anti-strand-bestemt mønster. Også ble nivåene av H3K9 og H3K4 trimethylation i fusjonsceller funnet å være noe lavere enn foreldre AGS og MGC803 celler, henholdsvis.
Konklusjon
Denne studien gir den første direkte bevis bekrefter at metylering tilstander av
p16
CpG øyer er ikke bare homeostatisk vedlikeholdt, men også ledsaget av en dynamisk prosess med forbigående fokus metylering, demetylering og hydroksymetylering i kreftceller
Citation. Qin S, Li Q, Zhou J, Liu ZJ, Su N, Wilson J et al. (2014) homeostatiske Vedlikehold av Allele Spesifikke
p16
Metylering i kreftceller ledsaget av Dynamic Focal Metylering og Hydroksymetylering. PLoS ONE 9 (5): e97785. doi: 10,1371 /journal.pone.0097785
Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA
mottatt: 6 februar 2014; Godkjent: 22 april 2014; Publisert: 14. mai 2014
Copyright: © 2014 Qin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av National Natural Science Foundation of China [Grant 31261140372 og 81171900], National Basic Research Program of China [Grant 2011CB504201 og 2010CB529303], og Foundation Beijing Natural Science of China [Grant 7122033]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dajun Deng er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
DNA metylering anses å være en av de mest stabile epigenetiske modifikasjoner i pattedyr. Metyleringen tilstander av celledifferensiering relaterte gener har vist seg å være svært dynamisk i løpet av bakterie-celle og preimplantation utvikling, men blir forholdsvis statisk under utviklingen av somatiske vev [1] – [3]. I kontrast til metylering tilstander av vertstilpasningsrelaterte gener forbli dynamisk i somatiske vev for å tillate riktig respons på miljøfaktor eksponering og påfølgende patogenese [4] – [6]. Hydroksymetylering av DNA er nært involvert i å endre genet metylering status og har vist seg å ikke bare spille en nøkkelrolle i DNA demetylering, men også tjene mange av sine egne funksjoner [7], [8].
Tumor suppressor P16 kodet av ink4 /arf locus i menneskets kromosom 9p21 er en cellesyklus regulator som er involvert ved inhibering av G1 → S-faseovergangen gjennom P16-CDK4 /6-RB veien [9]. Locus er transkripsjonelt dempet i embryonale stamceller, og spiller en hastighetsbegrensende rolle ved omprogrammering av induserte pluripotent celler [10]. Selv om en 9p21 fragment sletting er den hyppigste genetiske endringer som finnes i alle kreft [11], er hypermethylation av CpG øyer fortsatt den viktigste mekanismen for p16 inaktivering i flere kreft hos mennesker [12] – [14]. Faktisk har en rekke kohortstudier vist at p16 metylering oppstår tidlig i kreftutvikling og har vist seg å øke risikoen for ondartet transformasjon av epitelial dysplasi [15] – [21]. Selv om den utløsende rolle p16 metylering i kreftutvikling er ikke klarlagt, tyder bevis for at p16 metylering kan bidra vesentlig til kreftutvikling og kunne utvikles til en potensiell biomarkør [4]. Selv om p16-metylering er en av de mest studerte epigenetiske modifikasjoner, dens stabilitet i kreftceller og den mekanisme gjennom hvilken det holdes ennå ikke er blitt klarlagt [22] – [26]. En detaljert forståelse av vedlikehold maskiner involvert i DNA metylering er et kritisk punkt for utvikling av metylering biomarkører og epigenetisk intervensjon terapi.
Forekomsten av p16 metylering i menneskelige kronisk gastritt vev er sterkt korrelert med Helicobacter pylori-infeksjon, og dramatisk redusert etter H. pylori eradiation, noe som tyder på at de fleste metylert-P16 alleler ikke kan være stabile [27], [28]. I motsetning til dette, er p16-metylering i dyrkede normale celler og kreftceller sannsynligvis meget stabil som det var effektivt gjenvunnet etter DNA-metylering inhibitor (5-aza-CDR) ble fjernet, [29]. Imidlertid reaktivering av metylering-stilnet gener ble observert i en viss del av de DNA-metyltransferase-inhibitor-behandlede celler. Det er vanskelig å utelukke muligheten for at den observerte utvinning av p16 metylering resultater fra et utvalg fordel dratt til celler som ikke har gjennomgått p16 reaktivering /demetylering under inhibitor behandling. I tillegg har det nylig blitt rapportert at denaturert CpG områder innenfor p16 CpG øyer er hovedsakelig lokalisert i p16 ekson-en koding nukleosomale region i menneskelige gastritt lesjoner og strekker seg inn i 5’UTR og formidler nukleosomale regioner under utviklingen av mage karsinom [26]. Disse funnene tyder på at de fullt metylert-P16-alleler kan være mer stabile enn fokalt metylert lene; bør imidlertid denne hypotesen bli ytterligere testet ved hjelp av monoklonale celler inneholdende P16 alleler med diverse metylering mønster, inkludert fokal metylering.
Cellefusjon er blitt brukt til å studere mekanismene bak gentranskripsjon regulering og DNA-metylering endringer [24], [30]. For å etablere en modell celle inneholdende ulike p16 metylering mønstre ble et magekreft cellelinje med helt metylerte p16 (AGS) kombinert med en p16-aktiv magekreft cellelinje (MGC803) gjennom cellefusjon. Deretter ble disse fusion cellene klonet og subklonet før fordelingen av denaturert og hydroxymethylated CpG områder innenfor p16 CpG øyer ble karakterisert. Metyleringen status for de fleste P16 alleler i fusjons cellene forble den samme som foreldrecellene. Lave nivåer av fokus de novo metylering, demetylering og hydroksymetylering ble også observert i fusjonsceller; ble imidlertid disse endringene funnet å være ustabil hendelser. Et lignende fenomen ble også observert ved bruk av p16 hemi-metylerte HCT116-cellelinjen. Disse funnene indikerer at metylering tilstander av P16 CpG øyer er homeostatisk opprettholdt i kreftceller. Så langt vi kjenner til, er dette den første rapporten som tyder på at metylering status av CpG øyer er homeostatisk opprettholdes i kreftceller ikke gjennomgår differensiering.
Materialer og metoder
Cell kultur
human magekreft cellelinje MGC803 ble dyrket i RPMI 1640 medium med 10% FBS. AGS ble dyrket i F12-medium med 10% FBS. MGC803 [31] og AGS (ATCC CRL-1739) cellelinjer ble vennlig levert av professor Yang Ke ved Peking University Cancer Hospital og Institute. HCT116-celler ble vennligst tilveiebrakt av Dr. Yuanjia Chen, Peking Union Hospital (ATCC CCL-247) og ble dyrket i RPMI 1640 medium med 10% FBS.
Generering av de stabile fusjonscellekloner
pBabe-puro (hygromycin motstand) og pIRES2-EGFP (neomycin /G418 resistens) vektorer ble transfektert til AGS og MGC803 celler, henholdsvis ved hjelp LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, 11668-027) i henhold til produsentens anvisninger. Puromycin (puromycin
r + -AGS) og G418 (neomycin
r + -MGC803) utvalg ble utført på AGS og MGC803 cellelinjer, etterfulgt av kultur i F12-medium med 10% FBS og puromycin (0,25 ug /ml) og RPMI 1640 medium med 10% FBS og neomycin (700 ug /ml), henholdsvis. Fusjons ble utført ved anvendelse av PEG8000 som tidligere beskrevet [32]. Etter fusjon, ble cellene dyrket i seleksjonsmedium inneholdende både neomycin (700 ug /ml) og puromycin (0,25 ug /ml). Etter valget, individuelle kolonier ble mono-klonet, og etter tre runder med påfølgende kloning ble fem monoclones oppnådd. To av de fem monoclones ble valgt for ytterligere mono-kloning.
Mikro
D9S974 Hotell og
D9S1749
analyse
primer sett for
D9S974 product: (følelse, 5′-gagcc tggtc tggat cataa-3 «; anti, 5′-aagct tacag aacca gacag-3») og
D9S1749 plakater (følelse, 5′-aggag agggt acgct tgcaa-3 «; antisense, 5′-tacag ggtgc gggtg cagat aa-3») ble anvendt for å amplifisere
p16
alleler (fig S1A). Genotyper av micorsatellites ble analysert ved 80 ° C ved DHPLC hjelp av en UV-detektor (260 nm) som tidligere beskrevet [33].
Karyotype analyse
En 25-cm kolbe ved 60% celle konfluens ble behandlet med 0,2 mg /ml colchicin i 4 timer. Celler ble gjenvunnet etter trypsinering og behandling med 75 mmol /l KCl-oppløsning i 25 min. Cellene ble løst (03:01 metanol: eddiksyre)., Og farget med Giemsa beis
DNA forberedelse, sulfitt og TAB behandling
Genomisk DNA ble ekstrahert fra vevsprøver med fenol /kloroform . Prøvene ble behandlet med 5 mol /l av natriumbisulfitt i 16 timer ved 50 ° C [34]. For 5hmC analyse, ble genomisk DNA behandlet ved hjelp av TAB Kit i henhold til produsentens spesifikasjoner (WiseGene, Cat # K001) [35].
Hydroxymethylated DNA-spesifikke immunoprecipitation (hMeDIP)
Genomisk DNA ble ultralydbehandlet i 200 bp og 600 bp fragmenter ved hjelp Bioruptor ultralyd (Diagenode). 100 ng lydbehandlet DNA ble lagret som inngangskontroll. Hver prøve besto av 1 ug ultralydbehandlede DNA fortynnes i IP-buffer og inkubert med 4 pl anti-hydroxymethylcytosine (5hmC) antistoff (Active Motiv) ved 4 ° C over natten. De antistoff-DNA komplekser ble tatt ved hjelp av protein A /G-perler og deretter renset. PCR ble kjørt på alle prøvene ved hjelp av 35 sykluser med primere 5′-agtcct ccttc cttgc CAAC-3 «og 5» tccga gcact tagcg aatgt g-3 «. Unmethylated cytosin, 5-metylcytosin, og 5hmC DNA-fragmentene ble brukt som PCR-kontroller for å verifisere 5hmC berikelse.
Chromatin-immunoprecipitation (chip) analyser
Nivåer av histonmodifikasjonene H3K9me3 og H3K4me3 ble bestemt ved hjelp av chip analyser som beskrevet [36].
PCR presiseringer
392 bp fragment av den antisense-tråden i
p16
exon-en ble forsterket med CpG-fri primersett (forstand, 5′-ttttt agagg atttg aggga tagg-3 «, antisense, 5′-ctacc taatt ccaat tcccc tacaa acttc-3»), som beskrevet [37]. Den 588 bp fragment av antisense-tråden i
p16
ekson-en og promoter ble forsterket ved hjelp av sMSP primer sett (følelse, 5′-ctacct aattc caatt cccct aca-3 «; antisenses, 5» ccaat tcccc tacaa acttc g-3 «, 5′-ccaat tcccc tacaa acttc atcct ccaaa atcg-3» og 5 «ccaat tcccc tacaa acttc atcct ccaaa atcac CCG-3») [26]. Den 369 bp av sans-tråden i
p16
exon-en ble forsterket med CpG frie primer sett (følelse, 5′-gttgt agatt tttta tttat ttgga t-3 «; antisense, 5» tcccc ttacc taaaa aaata CC-3 «) ved glødetemperaturen 56 ° C. De 284 bp og 346 bp amplikonene av antisense-tråder av
p16
ekson-2 og intron-2 ble henholdsvis forsterket med CpG frie primer sett (følelse, 5′-tggta ggtta tgatg atgggt-Ag 3 «, antisense, 5′-aacat aatta ctacc tctaa taccc c-3) og (forstand, 5′-tttgt gggtt tgtag aagta ggtat g-3′, antisense, 5»-cctaa tccaa caact AATCC actac c-3) ved glødetemperatur 57 ° C.
Metylering kvantifisering av CpG øyer bruker DHPLC
392 bp, 369 bp, 284 bp, 346 bp PCR produktene forsterket av universelle primere ble separert ved hjelp av WAVE DNA fragment Analysis System med en fluorescens (FL)-detektoren (Transgenomic, Inc., OM, USA) ved 57,6, 55,0, 58,0 og 57 ° C, henholdsvis [37], [38]. Den WAVE-HS1 FL-dye buffer (Transgenomic, Inc.) ble brukt til å forbedre FL-intensiteten av PCR-produkter (universal post-kolonne merking). Genomisk HCT116 DNA ble brukt som standard kontroll.
Clone sekvense
PCR ble utført på bisulfit konvertert DNA. De amplikonene ble klonet inn i PCR sløv vektor (Invitrogen), forvandlet til
E. coli
, og sekvensert ved hjelp av en ABI 3730 Analyzer.
p16
RT-PCR
p16
mRNA ble oppdaget som beskrevet [12] .
P16 immunofluorescens farging
Immunofluorescence farging ble utført som tidligere beskrevet [39]. Kort sagt, ble fusjons cellene fiksert i 4% formaldehyd /PBS i 10 min før en 5-minutters vask i PBS. Faste prøver ble blokkert i 30 minutter med 0,5% Triton X-100 /PBS ved romtemperatur. Celler ble inkubert med anti-P16-antistoff (Abcam, ab54210) i 1 time ved 37 ° C, etter å ha vasket med 0,5% Triton X-100 /PBS og deretter inkubert med geite-antikanin-IgG-antistoff merket med rhodamin i 1 time ved 37 ° C. DAPI (1:2000) ble brukt til å farge cellekjernen. Bilder ble tatt på en Leica konfokal mikroskop.
Resultater
Etablering og karakterisering av en celle fusjon modell med Variert metylert
p16
alleler
Det har vært rapportert at heterokaryons kan indusere DNA metylering variasjon via celle fusjon av to cellelinjer [30]. Vi antok at en celle fusjon modell som inneholder forskjellige metylering tilstander av P16 CpG øyer kunne kopiere de novo metylering eller demetylering prosesser. Dermed ble puromycin
R + -AGS celler som inneholder fullt metylert-P16 alleler og neomycin
R + -MGC803 celler som inneholder unmethylated-P16 alleler konstruert, henholdsvis. Disse to cellelinjer ble så smeltet og dyrket i seleksjonsmedium inneholdende både puromycin og neomycin. Etter tre runder med kloning ble fusion monoclones karakteriseres ved hjelp av to mikro (D9S974 og D9S1749) i nærheten av p16 locus (figur S1 A). To D9S1749 mikro kromatogram mønstre (C7 /C9 /E10 og D3 /E3) og en D9S974 mønster ble observert i 5 testet monoclones som avvek fra de mønstre av foreldre celler. Kromosom modus var også forskjellig mellom representant klone E10 (nær-tetraploid) og dets foreldre celler (nær-diploid) (figur S1B).
Stall vedlikehold av helt metylert og unmethylated-
p16
alleler i kreftcellene
metylering status for p16 CpG øyer (392 bp) ble kvantitativt analysert i disse fusjons kloner bruker en DHPLC analyse som tidligere rapportert [37]. Som det ble sett i P16 hemi-metylert HCT116-celler, forholdet mellom methylated- til unmethylated-P16-molekyler var omtrent 1:01 i disse fusjons kloner (figur 1A-venstre). Andelen av metylert-P16 alleler ble stabilt opprettholdt i en representativ klon fra passasjene 45, 50, 55, og 60 (figur 1A-høyre). Videre RT-PCR detektert p16-mRNA i alle 5 testede kloner (figur 1B). Nucleoplasmic P16-proteinet ble også observert i hver celle i to representative monoclones (C9 og E3) (figur 1C). Basert på denne informasjonen, er det tydelig at transkripsjon /metylering statene i P16 lene i fusjonsceller trolig opprettholdes i et lignende mønster til foreldre celler.
(A) metylering tilstander av
p16
CpG øyer i fusjons monoclones ble analysert ved hjelp DHPLC (til venstre). Andelen av methylated-
p16
i monoclone-E10 ble stabilt opprettholdt ved passasjer 45, 50, 55, og 60 (til høyre). (B) RT-PCR viser varierende mRNA uttrykk for
p16
i fusjons monoclones og foreldre MGC803 og AGS cellelinjer. (C) Confocal immunocytochemistry flekker viser varierende P16 uttrykk i de ulike cellelinjer.
fokalt metylert
p16
lene er ikke stabil i kreftceller
Interessant, mens de fleste P16 molekyler forble i fullstendig denaturert eller unmethylated stater, de representative fusion kloner inneholdt omtrent 27% (13/48) fokalt methylated- (eller demethylated-) P16 molekyler i ekson-en region (figur 2B). Imidlertid gjorde de homozygously denaturert eller unmethylated foreldre celler ikke viser samme metylering endringer. For å bekrefte at den testede klonen var i virkeligheten monoklonalt ble denne klon videre subklonet. Videre analyser viste at p16 metylering mønstre i to subkloner konsekvent forble lik foreldre kloner (figur 2C og Figur S2).
(A) Bisulfite klone sekvensering av 392 bp fragment av
p16
CpG øy i AGS og MGC803 celler; Hver grønne linjen representerer en CpG nettsted. Nukleosomale plassering i ekson-1 er også merket (26). (B og C) Bisulfite sekvensering i fusjons monoclone-E3 og subkloner. Focal metylering endringer (gul-skygget); denaturert CpG områder (rød prikk); unmethylated CpG områder (åpen dot); fokalt methylated- eller demethylated-
p16
molekylene (svarte piler). (D) homeostatiske metylering modell for en enkelt CpG øy i tetraploide celler.
En enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) (rs36228836) ble identifisert i p16 promoter regionen. Det ble fastslått at genotypen til denne SNP forskjellig mellom de to foreldrecellelinjer (T /A for MGC803 og T /T for AGS), og dermed gjør det mulig å identifisere de MGC803-spesifikke P16 A-allel i fusjonsceller (figur S3). For å avklare om disse fokalt metylert fragmenter var et resultat av de novo metylering eller demetylering ble metylering stater i et 588 bp fragment som dekker denne SNP analysert ved hjelp av en seeding metylering spesifikk PCR-analyse (sMSP). Det ble oppdaget at CpG metylering av P16 lene ved metylering «seeding» områder innenfor intron-en ble effektivt beriket [26]. Resultater av sulfitt-sekvensering bekreftet at fokus de novo metylering ble observert i MGC803-spesifikke A-alleler av monoclone-D3 (Figur S3).
For å undersøke om forbigående fokalt metylert-P16 alleler finnes i ikke-fusjonsceller, metylering mønster av p16 hemi-metylerte HCT116-cellelinjen ble også analysert. Tilsvarende 16% (8/49) av de P16 molekylene viste fokal metylering i HCT116-celler (figur 3). Videre, ved anvendelse av en del /ins leseramme-skiftmutasjon som finnes i exon-1-kodende region som en genetisk markør, ble det fastslått at både fokal de novo metylering i mutant G-innsetting alleler (hovedsakelig unmethylated) og demetylering i villtype alleler (hovedsakelig denaturert) forekommer også sporadisk i HCT116-celler (4/26 og 4/23, henholdsvis). Dette indikerer at det fokale metylering og demetylering av P16 alleler faktisk foreligger i ikke-fusjonskreftceller. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at mens midt metylering og demetylering er relativt vanlige hendelsene, de fleste av de helt methylated- og unmethylated-P16 alleler er stabilt opprettholdt i kreftceller.
(A) Bisulfite klone sekvensering av 392 bp fragment av
p16
CpG øy i HCT116 cellene. Wild-type (
sletting
) /mutant (G-
innsetting
)
p16
lene; fokalt demethylated-
p16
molekylene (svarte piler); fokalt
de novo
denaturert molekyler (røde piler). (B) homeostatiske metylering modell for en enkelt CpG øy i diploide celler.
For å undersøke om det sentrale metylering /demetylering oppstår i genet kroppen, vi analyserte metylering tilstander av CpG øyer innen den p16-ekson-2 og intron-2. DHPLC analyse viste at disse to CpG øyene var fullt metylert i AGS, MGC803, og HCT116-celler (figur S4A 0,01). (B) Den undertrykkende H3K9me3 nivå i fusjons subkloner og AGS celler var betydelig høyere enn MGC803 celler, spesielt i promoter regionen (monoclones vs. MGC803, P 0,01).
Diskusjoner
DNA metylering mønsteret er kjent for å endre dynamisk under differensiering av embryoniske stamceller og utvikling av vev i virveldyr. Imidlertid er det fortsatt et mysterium hvordan metylering tilstander av genomet blir opprettholdt i cellene ikke lenger gjennomgår differensiering. I denne studien ble det funnet at metylering statene helt methylated- og unmethylated-
p16
alleler var stabil under celledeling. Videre lave nivåer av fokus demetylering, hydroksymetylering, og
de novo
metylering forekom relativt hyppig i to typer
p16
hemi-metylert kreft cellemodeller, men ikke i homogent denaturert eller unmethylated celler. Disse funnene antyder at homogen metylering kan utøve undertrykkelse press på
p16
genet som kan i det minste delvis påvirke tidligere unmethylated CpG øyer. I motsetning til dette, den transkripsjon trykk som utøves ved fullstendig demetylering av genet er i stand til å indusere og opprettholde demetylering av
p16
CpG øyer. Hydroksymetylering av
p16
CpG-alleler ble også funnet å spille en rolle i den homeostatiske vedlikehold av genomet metylering. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten som viser at metylering status for en tumor suppressor gen homeostatisk opprettholdes i kreftceller.
Stabiliteten denaturert P16 alleler har ennå ikke blitt forklart. I gastritt lesjoner, metylering tilstander av de fleste P16 alleler er ustabile og H. pylori-avhengig [27], [28]; imidlertid, i cancercellelinjer som de har vist seg å være bemerkelsesverdig stabil [29]. Vår siste omfattende sekvenseringsstudier viste at metylerte CpG-områdene i gastritt befinner seg innenfor ekson-en region av p16-genet, men strekker seg inn i promoter-regionen etter at utviklingen av gastrisk karsinom. Dette innebærer at fullstendig metylert-P16 lene er betydelig mer stabile enn sine fokalt denaturert kolleger [26]. Det har også blitt rapportert at heterokaryons kan indusere DNA-metylering variasjonene via cellefusjon av to cellelinjer, og dessuten at enkelte stilnet-P16 molekyler i musecancerceller kan reaktiveres etter å ha blitt sammensmeltet med P16-aktiv mus embryonale stamceller [30], [39]. I den foreliggende undersøkelse, ble fusjonsceller som inneholder et bredt spekter av P16 metylering mønstre etablert fra homozygously denaturert og unmethylated foreldrecellelinjer for å undersøke stabiliteten av fokalt og helt metylert-P16 alleler innenfor samme celle. Som forventet, P16 lene av fusjons cellene viste en fullstendig og variabelt utvalg av metylering. De P16 alleler i fusjons kloner og deres subkloner forble stabilt hemi-denaturert under celle passasjer, noe som indikerer at disse helt denaturert og unmethylated P16 lene er relativt stabile. På den annen side, hemi-metylert fusjonskloner og HCT116-celler oppviste lave nivåer av fokalt denaturert /demetylert-P16 alleler, som gir direkte bevis for at de halvring metylert P16 alleler er mindre stabile enn de homogent metylerte P16 alleler. Denne dynamiske, men likevel homeostatic, metylering mønster av P16 CpG øyer kan tilby en felles mekanisme som forklarer DNA metylering vedlikehold i differensierings statiske celler. I tillegg er to CpG øyene i p16-ekson-2 og intron-2 blir jevnt denaturert i HCT116, AGS, og MGC803 celler, derfor er det sannsynlig at den homeostatiske vedlikehold av p16 metylering kunne observeres bare i sin promoter /exon-1-regionen i disse cellene. Fordi det er mange hemi-metylert regioner til stede i genomet, slik som X-kromosomet av kvinnelig celler og trykt gener, videre studier med hensyn til om navet, forbigående metylering og demetylering er generelle fenomener i homeostatisk vedlikehold av DNA-metylering er absolutt påkrevet.
5hmC spiller en avgjørende rolle i aktiv DNA demetylering som mellomserie metylcytosin oksidasjon. Det er imidlertid en viss andel av 5hmC ikke lenger oksydert, men er i stedet opprettholdt i genomet til voksent vev, slik som hjerne og kolon. Selv om de ekstra funksjonene 5hmC i genomet er fortsatt ukjent, er det sannsynlig å tjene en viktig hensikt. Det har blitt rapportert at hydroksymetylering ved begge promoter- og intragenic steder korrelerte positivt med genekspresjon [40]. Vanligvis er CpG øyer ikke metylert i regionene rundt transkripsjon start steder i aktivt transkriberte gener, men blir metylert i genet kroppen. Nylig har det blitt rapportert at hydroksymetylering i genomet av hjernen er TET2 avhengig og mer hydroksymetylering blir detektert i deteksjons-tråder enn de antisense-tråder av aktivt transkriberte gener legemer [41], [42]. I denne studien fant vi at den antisense-tråder av HCT116 cellene inneholdt en viss andel av «denaturert» villtype P16 alleler som var faktisk helt hydroxymethylated;
