Abstract
Bakgrunn
Kreft i bukspyttkjertelen (PDAC) er preget av et rikt bindevev rik på tenascin-C (TNC), glykoprotein en stor ECM hovedsakelig syntetisert av bukspyttkjertelen stel celler (PSC avtaler ). I menneskelige bukspyttkjertelen vev, øker TNC uttrykk i progresjonen fra lav grad av forstadier til invasiv kreft. Målet med denne studien var funksjonell karakterisering av effektene av TNC om biologisk relevante egenskaper for kreft i bukspyttkjertelen celler.
Metoder
spredning, migrasjon og vedheft analysene ble utført på bukspyttkjertelkreft cellelinjer som ble behandlet med TNC eller dyrket på et TNC-rik matriks. Stabile transfektanter som uttrykker
Store plakater TNC spleisevariant ble generert for å teste effekten av endogent TNC. TNC-avhengig intesignale ble undersøkt ved immunblotting, immunfluorescens og farmakologisk hemming.
Resultater
Endogen TNC fremmet bukspyttkjertelkreft cellevekst og migrasjon. En TNC-rik matriks også forbedret migrasjon samt adhesjon til den ikke-belagte overflate veksten av dårlig differensierte cellelinjer. I motsetning til dette adhesjon til fibronektin ble signifikant redusert i nærvær av TNC. ble Parallelt Effektene av TNC på celle adhesjon av endringer i aktivering staten paxillin og Akt.
Konklusjon
TNC påvirker spredning, migrasjon og vedheft av dårlig differensierte bukspyttkjertelkreft cellelinjer og kanskje derfor spille en rolle i PDAC spredning og metastase
in vivo
Citation. Paron jeg, Berchtold S, Vörös J, Shamarla M, Erkan M, Höfler H, et al. (2011) tenascin-C Forbedrer bukspyttkjertelkreft cellevekst og motilitet og påvirker celle adhesjon gjennom Aktivering av Inte Pathway. PLoS ONE seks (6): e21684. doi: 10,1371 /journal.pone.0021684
Redaktør: Cara Gottardi, Northwestern University, USA
mottatt: 12. desember 2010. Godkjent: 08.06.2011; Publisert: 29 juni 2011
Copyright: © 2011 Paron et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Deutsche Krebshilfe (Grant nummer~~POS=HEADCOMP: 108038). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) representerer 85-90% av alle bukspyttkjertelen svulster. I 2010 43,140 mennesker i USA ble anslått til å bli diagnostisert med kreft i bukspyttkjertelen og 36800 for å dø av denne dødelige sykdommen, noe som gjør PDAC den fjerde vanligste årsaken til tumorrelatert dødelighet på tross av en forekomst på bare 3% av totalt antall tilfeller [1 ]. PDAC overlevelse forbedret bare marginalt i de siste 30 årene og PDAC pasienter fortsatt har en svært dårlig prognose, med en samlet 5-års overlevelse under 5% og en median overlevelse som varierer fra 2 måneder hos pasienter med metastatisk sykdom til 8 måneder hos pasienter med ikke-metastatisk sykdom ved diagnosetidspunktet [2]. PDAC utfall ikke endre seg mye de siste årene hovedsakelig på grunn av sen diagnose. PDAC som lokalisert og regional sykdom er hovedsakelig asymptomatisk og verktøy for tidlig deteksjon er fortsatt savnet. Når diagnosen er kreft i bukspyttkjertelen ofte ildfast til noen kjemoterapi og strålebehandling, og mange kliniske studier har ikke klart å påvise en betydelig forbedring i total overlevelse i løpet av det siste tiåret [3]. Derfor er en bedre forståelse av de involverte i PDAC utvikling, vedlikehold og sprer mekanismer er nødvendig for å utvikle nye og mer målrettede terapier for behandling av dette i dag fremdeles dødelig sykdom.
Et karakteristisk trekk ved PDAC er den såkalte » desmoplastic «reaksjon, en rikelig fibrøst vev som omgir kreftceller og består hovedsakelig av blodkar og stromale celler spredt i et stillas av ekstracellulær matriks (ECM). Utviklingen av desmoplastic reaksjonen skyldes i hovedsak bukspyttkjertelen stel celler (PSC avtaler). PSC avtaler er stromale celler som, etter omdannelse fra en stillestående til en aktiv myofibroblast-lignende fenotype, utskiller ECM-proteiner og matrise-nedbrytende enzymer, og dermed etablere et miljø som sterkt fremmer kreft progresjon og, på samme tid, medfører en barriere for å medikamenttilførsels [ ,,,0],4] -. [7]
tenascin-C (TNC) er et stort ECM glykoprotein som består av seks monomerer knyttet til sin N-termini med disulfidbindingene for å danne en 1080-1500 kDa hexamer. Hver monomer består av forskjellige strukturelle motiver ordnet i en lineær rekkefølge, inkludert mellom 8 og 15 fibronektin type III (FN-III) -lignende gjentar [8], [9]. Den alternativ spleising av de FN-III-lignende gjentar er i stand til å modulere den biologiske funksjonen til TNC ved å endre sin interaksjon med andre ECM proteiner, som fibronektin (FN), eller med celleoverflatereseptorer, som inte eller annexin II, og ved overdragelse noen ganger motsatte roller til TNC i cellespredning, adhesjon og spredning [10], [11].
TNC er hovedsakelig uttrykt under embryonal utvikling. Hos voksne har TNC et begrenset mønster av uttrykket (i basalmembranen av huden, i kanalene i spyttkjertler, i kolon mukosa og i beholderveggene i forskjellige organer), men proteinnivåene øker dramatisk under forskjellige fysiologiske og patologiske tilstander, så som vev-omforming, neovaskularisering og inflammasjon [12], [13]. Videre har de fleste faste tumorer uttrykker høye nivåer av TNC. TNC er i stand til å påvirke kreftvekst ved å påvirke celle-adhesjon og motilitet på en måte som kan fremme invasjon og metastase [14] og ved å påvirke den cellulære ekspresjon av tumorsuppressorgener, onkogener og gener som er involvert i opprettholdelse av genomstabilitet [15]. I den normale bukspyttkjertelen, er TNC uttrykt i muskelveggen av blodkar og i det stromale vev rundt interlobular kanalene. TNC uttrykk er oppregulert i akutt og kronisk pankreatitt [16], og øker i progresjon fra lav grad av forstadier (pankreas intraepitelial neoplasi, Panin) til PDAC [17]. I PDAC TNC er utelukkende uttrykt i stroma rundt de neoplastiske kjertlene [16], [17]. Oppregulering av TNC i kreft progresjon synes å involvere spesifikt
stor
spleisevariant, som den største TNC transkripsjon, svarende til unspliced form av TNC, er funnet i bukspyttkjertelkreft, og i kronisk pankreatitt, men ikke i de normale bukspyttkjertel [17]. PSC avtaler har vist seg å være den viktigste kilden til TNC
in vivo,
mens PDAC celler ikke viser noen uttrykk for TNC enten ved immunhistokjemi eller immunoblotting. Det ble imidlertid lave nivåer av TNC mRNA funnet i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ved real-time kvantitativ PCR [17].
I denne studien, utførte vi en omfattende analyse av effektene av eksogene TNC på bukspyttkjertelkreft cellefunksjoner og vi undersøkt effekten av endogent TNC overekspresjon i bukspyttkjertelkreft cellelinje PANC-1. Våre resultater peker på en viktig rolle TNC i reguleringen av samspillet mellom epitelceller og ECM i utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen.
Resultater
Effekter av eksogene TNC om kreft i bukspyttkjertelen cellevekst
i begynnelsen, det ble testet om TNC tilsatt til kulturmediet ved forskjellige konsentrasjoner kan påvirke cellenes levedyktighet. En økning i antall levedyktige CAPAN-1, ASPC-1 og SU.86.86 celler (opptil 25%) ved TNC konsentrasjon på 0,01-0,1 pg /ml ble det observert, målt med MTT-analyse etter 72 timers vekst i serumfritt medium (fig. 1A). Vekst av ASPC-1 og CAPAN-1 ble hemmet ved den høyeste konsentrasjon TNC (10 ug /ml, 41 og 34% reduksjon, respektivt). TNC hadde en hemmende effekt på levedyktigheten av PANC-1 og MIA PACA-2-cellelinjer (Fig. 1A). Siden TNC utøver sin funksjon som en ECM-protein, ble celler dyrket på en TNC-rik matriks. Når utsådd på TNC-belagte plater og vokst opp til 72 timer i serumfritt medium, PANC-1 og MIA PACA-2 viste 44% og 27% økning i levedyktighet, henholdsvis, mens veksten av CAPAN-1 og AsPC- en redusert (23% og 45%, henholdsvis) (fig. 1B).
(A) Celler ble dyrket i 72 timer i serumfritt medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av TNC (0,01, 0,1, 1 og 10 ug /ml). (B) Celler ble dyrket i 72 timer i serumfritt medium bort på TNC-belagte plater (1 pg /cm
2). Vekst ble bestemt ved MTT-analyse. Data blir beregnet som gjennomsnitt +/- S.E.M. av tre forsøk og er uttrykt som prosent sammenlignet med ubehandlede kontroller (° p 0,05, * p 0,01, ** p 0,001, Studenter tosidige t test)
Eksogene TNC modulerer. motiliteten av bukspyttkjertelcancercellelinjer
for å teste effekten av TNC på migrering av bukspyttkjertelcancercellelinjer, sårheling analyser ble utført opprettholdelse av cellene i serumfritt medium for å minimalisere celleproliferasjon. TNC hadde ingen effekt på den til lukking av sår når de tilsettes til vekstmediet (Fig. 2A). Når de dyrkes på en TNC-rik matriks, lukket kreft i bukspyttkjertelen celler såret i en doseavhengig måte, men hver cellelinje viste en ganske individuelle respons på forskjellige konsentrasjoner av TNC. I detalj, økt cellemigrering opp til 1,7 og 1,1 ganger i SU.86.86 og PANC-1-cellelinjer, henholdsvis, og nådde statistisk signifikans ved en TNC konsentrasjon på 0,5 ug /cm2 i SU.86.86 celler og 0,1 ug /cm2 i PANC-1 celler. På den annen side er redusert til lukking av sår vesentlig (opp til 0,8-fold) i CAPAN-1-celler med TNC-konsentrasjoner på 0,5 og 2,5 g /cm2 (fig. 2B). En TNC konsentrasjon på 2,5 ug /cm2 hadde toksisk virkning på PANC-1-celler, og den sårheling analysen kunne ikke utføres under disse forhold.
(A) Celler ble platet på ubelagte plater og etter 24 timer monolaget ble skrapt med en 10 ul pipettespiss. Cellene ble deretter inkubert i serumfritt medium, eller i medium med tilsetning av TNC ved forskjellige konsentrasjoner (0,2 ug /ml, 1 ug /ml og 5 ug /ml) opp til 48 timer. (B) Celler ble sådd ut på 24-brønners plater belagt med tre forskjellige konsentrasjoner av TNC (0,1 mikrogram /cm
2, 0,5 ug /cm
2 og 2,5 ug /cm
2) eller på ubelagte plater og etter 24 timer ble monolaget ble skrapt med en 10 ul pipettespiss. Cellene ble deretter inkubert i serumfritt medium i opptil 48 timer. Migrering av celler inn i såret områder ble evaluert telle migrerte celler manuelt og ved den TScratch programvare [36] og en total på 2-8 felt ble tellet pr gruppe i hvert forsøk. Data blir beregnet som gjennomsnitt +/- S.E.M. og uttrykt som fold-endring i forhold til de ikke-behandlede celler (° p 0,05, * p 0,01, ** p 0,001, Studenter tosidige t test)
Effekter av endogen TNC. på celle levedyktighet og migrasjon
for å gi ytterligere støtte til de observerte fremme effekten av TNC om kreft i bukspyttkjertelen cellevekst og bevegelighet i belegget prosedyre ble PANC-1 celler brukes til å generere stabile transfektanter som uttrykker
store
TNC spleisevariant. Siden TNC fysiologisk fungerer som et ekstracellulært protein, ble positive kloner videre valgt på grunnlag av deres evne til å utskille TNC i kulturmediet. Som vist i figur 3A, uttrykket nivåer av utskilt TNC var helt forskjellige blant positive kloner. Forskjellige ekspresjonsnivåer reflektert på noen av de biologiske aktiviteter av TNC, slik som dens evne til å påvirke cellenes levedyktighet. Faktisk er antall levedyktige celler, som målt ved MTT-metoden etter 24, 48 og 72 timers vekst i komplett medium, var høyere i TNC-positive kloner, sammenlignet både med den ikke transfektert og til den mock-transfekterte PANC-1 -celler (fig. 3B og C). Den sterkeste virkning (i forhold til de ikke-transfekterte celler) ble observert i T2-klon, som også viste de høyeste ekspresjonsnivåer av utskilt TNC (Fig. 3A og B). I detalj, i forhold til ikke-transfekterte celler, PANC-T2-celler viste en økning i cellelevedyktigheten til 2,06-ganger +/- 0,01 etter 24 timer, fra 2,49-ganger +/- 0,04 etter 48 timer og fra 3,88 +/- 0,09 etter 72 timer. I PANC-T24 var økningen av 1,21-ganger +/- 0,01 etter 24 timer og fra 1,14-ganger +/- 0,02 etter 48 timer, og i PANC-T27 fra 1,43-ganger +/- 0,02 etter 24 timer, av 1,32 fold +/- 0,03 etter 48 timer og 1,08 ganger +/- 0,05 etter 72 timer. De celleviabilitet ratene PANC-1-celler som overuttrykker TNC i forhold til de mock-transfekterte celler var 55% høyere ved 24 timer, 68% høyere ved 48 timer og 99% høyere ved 72 timer (fig. 3C).
PANC-1-celler ble stabilt transfektert med en vektor som driver ekspresjonen av
stor
TNC (PANC-T2, PANC-T24 og PANC-T27-celler) og med den tomme vektoren (PANC-C21, PANC-C23 og PANC-C27-celler). (A) Immunoblotting av utfelt cellekulturmedium av de transfekterte PANC-1 celler dyrket opp til 80% konfluens. For å sikre at en tilsvarende rekke av transfekterte celler som var kilden til utskilte TNC, ble GAPDH ekspresjon i hele celleekstrakter testet. PANC-T2 celler viser de høyeste nivåene av utskilt TNC, mens lavere nivåer er observert i PANC-T24 og PANC-T27. Kontroll kloner i sammenligning er ikke noe som TNC sekresjon. (B) Celler ble dyrket i fullstendig medium. Vekst ble bestemt ved MTT-analysen ved forskjellige tidspunkter (24, 48 og 72 timer). Data blir beregnet som gjennomsnitt +/- S.E.M. av tre eksperimenter og uttrykt som prosentandel i forhold til de PANC-1 celler (° p 0,05, * p 0,01, ** p 0,001, studenter to-halet t-test). Formeringshastigheten er betydelig høyere for PANC-T2 ved alle tidspunkter (p 0,001), for PANC-T24 ved 24 timer (p 0,001) og ved 48 timer (p = 0,022) og for PANC-T27 ved 24 (p 0,001 ved begge tidspunkter) og for PANC-T27 (p = 0,042 ved 24 timer; p = 0,009 ved 48 timer). (E) Alle sammen, PANC-1-positive kloner (PT) migrere betydelig raskere sammenlignet med mock transfekterte cellene (PC) på begge tidspunkter (p 0,001)
Cell migrasjon på. derimot ble ikke påvirket av uttrykket nivåer av utskilt TNC. Stabile transfekterte PANC-T2, PANC-T24 og PANC-T27 celler lukket såret raskere enn ikke transfekterte og mock transfekterte celler. Sammenlignet med den ikke transfektert PANC-1-celler, denne effekten var signifikant ved 24 timer (1,52-ganger +/- 0,09) og 48 timer (1,46 ganger +/- 0,08) for PANC-T2 og ved 24 (1.66- fold +/- 0,13) og 48 timer (1,46-gangers +/- 0,08) for PANC-T27 (fig. 3D). Alle positive kloner sammen hadde en høyere migrasjonsrate i forhold til den mock-transfekterte kloner (62% ved 24 timer og 43% ved 48 timer, fig. 3E).
Eksogent TNC stimulerer celle adhesjon på ubelagte plater og reduserer celle spredning på FN
Som celle adhesjon sammen med migrasjon og invasivitet er et avgjørende skritt involvert i kreft sprer seg og metastasering, ble adhesjon av kreft i bukspyttkjertelen celler på TNC videre undersøkt. Siden TNC overekspresjon korrelerer med dårlig tumor differensiering
in vivo product: [16], fokuserte vi vår studie på dårlig differensierte cellelinjer Panc-1 og SU.86.86 [18], [19]. TNC belegg sterkt forbedret vedheft av begge cellelinjer (Panc-1: 7,0-fold, p 0,001; SU.86.86: 4,6-fold, p 0,001). Som anslått av krystallfiolett absorbans spektroskopi av vedlagte celler (fig 4A, venstre panel). I vevet sammenheng,-celler reagerer med TNC i kombinasjon med andre ECM-proteiner. Blant disse, FN blir ofte co-uttrykt med TNC [20]. Derfor, for å teste om TNC modulerer celle adhesjon i nærvær av FN, PANC-1 og SU.86.86 celler ble sådd ut på et blandet substrat av FN og TNC. TNC nærvær fastslått en betydelig reduksjon i binding av begge cellelinjer til FN på 3 timer etter utplating (PANC-1: 1,6 ganger, p 0,001; SU.86.86: 1,2 fold, p = 0,003) (Fig. 4A, venstre panel). For å teste om denne effekten kan skyldes substrat konkurranse mellom de to proteiner når de brukes sammen for å belegge plastoverflaten ble substratet bindingseffektivitet av den sammensatte matrise undersøkt ved hjelp av ELISA. Bindingen Effektiviteten av FN eller TNC alene ble ikke påvirket når platene ble belagt med begge proteiner samtidig, som vist i figur 4B og C. Cellelevedyktigheten ble også ikke signifikant påvirket når cellene ble dyrket på FN /TNC-belagte plater i forhold til FN belagte plater (MTT-analysen, data ikke vist). Til sammen viser disse resultatene at TNC griper inn i celleadhesjon på FN, men det har en motsatt virkning på ikke-belagte plater.
(A) Celler ble sådd ut i medium inneholdende 1% FBS, ble inkubert i 3 timer og fast . For farmakologisk hemning, ble celler inkubert med AZD0530 2 uM i 15 minutter før utplating. Venstre panel: TNC forbedrer celle adhesjon forhold til ubestrøket plater og reduserer cellebinding til FN. Høyre panel: Ved behandling med AZD0530, celler viste en redusert adhesjon sammenlignet med de ikke-behandlede celler ved alle testede betingelser. Data blir beregnet som gjennomsnitt +/- SEM av to eksperimenter og uttrykt som fold-forandring i forhold til kontroll (Ctrl) (venstre panel) eller til de ubehandlede celler (høyre panel) (* p 0,01, ** p 0,001, ANOVA-test). (B, C) 96-brønners plater ble belagt med TNC (0,5 pg /cm
2), FN (1 pg /cm
2) eller begge proteiner samtidig (FN /TNC) og ELISA ble utført som beskrevet i metoder. Underlaget bindingsaktiviteten TNC eller FN blir ikke påvirket når begge proteiner areused å belegge plastoverflaten. (D, E) PANC-1 (D) og SU.86.86 celler (E) ble sådd ut i 45 min før totalt protein ekstraksjon ble utført. Fosforylering av paxillin ved 118 Tyr (pPAX) og av Akt i Ser 473 (pakt), og total paxillin og Akt ekspresjonsnivåene ble undersøkt ved immunblotting ved bruk av spesifikke antistoffer, og etter behandling av cellene med Src kinase-inhibitoren AZD0530. GAPDH deteksjon ble brukt til å bekrefte lik protein lasting.
TNC og FN innflytelse paxillin og Akt aktivering av fosforylering
For å undersøke trasé som er involvert i limet oppførselen til kreft i bukspyttkjertelen celler på TNC og /eller på FN substrater, fosforylering nivået av paxillin ved Tyr 118, et tidlig trinn i integrin mediert signalisering, så vel som fosforylering nivået av Akt i Ser 473, og uttrykket nivåer av vinculin, et protein som er involvert i forbindelsen av fokal adhesjon til aktin cytoskjelettet, ble analysert ved immunblotting.
Som vist i fig. 4, TNC og FN hadde en svak forbedrende virkning på fosforyleringstilstanden av Aktin de PANC-1 og SU.86.86 cellelinjer i løpet av de første trinnene av celleadhesjon (45 min). Denne effekten var ikke tydelig lenger etter 24 timer og ved senere tidspunkter (ikke vist). Som for celle adhesjon, TNC syntes å ha motsatt effekt avhengig av det eksperimentelle oppsettet. Faktisk fosfor-Akt var litt oppregulert når man sammenligner TNC belagte plater
vs
ubestrøket plater og nedregulert når man sammenligner FN /TNC-belagte plater
vs
FN belagte plater. Den samme tendens kan ses ved måling paxillin aktivering, mens vinculin nivåer ble ikke påvirket enten av TNC eller FN (ikke vist). Src kinase-inhibitoren AZD0530 (Saracatinib), som hemmer fosforylering av paxillin og Akt, ble benyttet for å bekrefte at de observerte virkninger på celleadhesjonen ble faktisk formidlet av molekyler av integrin signalveien. I vedheft forsøk, etter inkubasjon med AZD0530 en inhibering av paxillin og Akt-fosforylering ble observert (fig. 4D og E). Denne effekten ble fulgt av en signifikant nedgang i PANC-1 og SU.86.86 adhesjon ved alle testede betingelser (PANC-1 FN: p = 0,004; alle andre tilstander p 0,001), med unntak av SU.86.86 adhesjon til ubelagte plater (fig. 4A, panel til høyre).
Deretter TNC effekt på samlings vedheft forsamlingen ble undersøkt på en morfologisk nivå ved immunfluorescens. Som vist på fig. 5, PANC-1 celler dyrket i 45 minutter på en TNC belagt overflate viste en mer diffus co-lokalisering mønster av vinculin og fosfo-paxillin enn det som ble observert på den ikke-belagte overflate, hvor fokal adhesjon først på mer langstrakt og i hovedsak konsentrert ved periferien av spredning cellen. På en FN matrise, ble observert bare litt merkbare forskjeller i fosfor-paxillin og vinculin fordeling mellom celler levd på FN og FN /TNC. I begge tilfellene ble fosfo-paxillin /vinculin områder i hovedsak begrenset til periferien av vedheftende celler, med lengre og mer dispergerte klebe områder i nærvær av TNC.
PANC-1-celler ble la seg til ubelagte eller TNC, FN og FN /TNC belagte dekkglass i 45 minutter, forsiktig vasket, fiksert og farget ved hjelp av fluorescerende sekundære antistoffer. Focal vedheft plaketter ble dokumentert av samlokalisering av vinculin (grønn) og fosfor-paxillin (pPAX, rød). Cellekjerner ble kontra med Hoechst 33342.
Diskusjoner
PDAC er preget av en fremtredende økning i bindevevet som omgir kreftceller. Viktige bidragsytere til denne såkalte «desmoplastic» reaksjon er pscs, en subpopulasjon av pankreatiske celler som, når de aktiveres av vekstfaktorer, cytokiner og oksidativt stress, skiller ut overskuddsmengder av ECM-proteiner og oppløselige mediatorer etablere en krysstale med tumorceller. Flere linjer av bevis tyder på at desmoplastic mikromiljøet spiller en sentral rolle i regulering av rask vekst og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen, angiogenese og motstand mot kjemoterapi [4] – [7], [21] -. [26]
TNC er en stor stromal ECM protein som er oppregulert i progresjonen fra PanINs til PDAC [17] og dens uttrykk har blitt korrelert med en dårlig differensiert fenotype av PDAC [16]. Videre har TNC ekspresjon er korrelert med en dårlig prognose av pasienter som lider av lunge og hjerne kreft [21], [27] – [29], mens ingen korrelasjon mellom ekspresjonsnivåer og prognose har blitt funnet i bukspyttkjertelkreft [16]. TNC er i stand til å samhandle med flere ECM proteiner (for eksempel FN, perlekan, aggrecan, versican og brevican) og mange celle-overflate reseptorer (inkludert inte α2β1, α7β1, α9β1, αvβ3, annexin II, EGFR og syndecan 4), modulermobil signalering og påvirke cellemigrering og proliferasjon [11]. I tillegg, i den voksne organismen TNC har klebemiddel og anti-klebeegenskaper og er uttrykt i løpet av fysiologiske og patologiske tilstander hvor cellemigrering og vev-omforming er involvert, som i sårheling prosessen eller i løpet av tumorigenese og metastase [11]. Men de molekylære mekanismer som TNC påvirker kreft progresjon er fortsatt i stor grad ukjent. For å løse dette spørsmålet i PDAC, har vi undersøkt hvordan TNC påvirker biologisk relevante egenskaper for kreft i bukspyttkjertelen celler.
Resultatene som presenteres her viser at TNC er i stand til å støtte og fremme vekst og migrasjon av dårlig differensierte bukspyttkjertelkreft cellelinjer . En annen interessant observasjon er at TNC alene viser en pro-klebende effekt på kreft i bukspyttkjertelen celler, i motsetning til den rapporterte anti-klebende effekt hos de fleste andre undersøkte cellelinjer, for eksempel glioblastom og bryst carcinoma celler [22]. Dette pro-adhesive virkning på kreft i bukspyttkjertelen celler er assosiert med en økning i fosforylering tilstand av Akt og i mindre grad av paxillin. Dette tyder på en mekanisme som involverer integrin-mediert adhesjon til TNC, analogt med det som tidligere er vist i kondrosarkom celler, hvor en økning av Ser 473 fosforylering av Akt i celler som fester seg til TNC fremmer celleoverlevelse i serum belastede medium [23]. Men effekten av TNC for kreft i bukspyttkjertelen celleviabilitet og proliferasjon var ganske heterogene og en hemming av vekst ble observert på noen cellelinjer, for det meste ved de høyeste konsentrasjonene av TNC. Dette resultat er ikke overraskende, på grunn av heterogeniteten av PDAC cellelinjer om deres opprinnelse og differensiering [19], [20], og til de pleiotrope og ofte motsatte virkninger av TNC avhengig av celle og vev sammenheng.
In vitro
studier rapporterer ofte motstridende resultater, med TNC både stimulerende [24] og hemme [25] cellevekst og fremme både celle adhesjon og avløsning [26]. Videre motsatte klebende og trekkende responser til TNC i samme gliomer cellelinje avhengig av integrin-reseptoren er involvert [30] og forskjellige klebe responser mediert av den samme integrin i forskjellige cellelinjer [31], er blitt beskrevet. Interessant, på en FN belagte overflate TNC avtar kreft i bukspyttkjertelen celleadhesjon og fosfo-paxillin og fosfo-Akt nivåer. Denne effekten på en blandet TNC-FN matrise, som er svært lik
in vivo
situasjon, hvor TNC og FN interagere i den tumor-assosiert ECM, er allerede blitt beskrevet for glioblastom og bryst carcinoma celler [20], [22]. I disse tumorer TNC reduserer celle spredning på FN interfererer med FN-binding til integrin ko-reseptor syndecan-4, således at det går fokal kontakt og stress fiberdannelse [29]. Siden underlaget bindende effektivisere FN ikke ble påvirket av TNC i vår studie, som vurdert av ELISA, kan en lignende mekanisme konkurranse for celleoverflatereseptorer bli en hypotese i PDAC celler. På grunn av denne effekten, aktivering av paxillin og fokal adhesjonskinase (FAK), og følgelig aktin spenning fiber og fokal kontaktdannelse samt full celle spredning er hemmet, med en generell forbedring i celleformering [22]. Svak binding til FN korrelerer vanligvis med en forbedret spredning i mange tumorceller [32]. I vår eksperimentell satt opp, hadde vi ikke observere en økning i celleproliferasjon for Panc-1 og SU.86.86 celler på en blandet substrat av FN og TNC forhold til FN alene, sannsynligvis fordi effektene av TNC om vedheft var begrenset til korte ganger (3 timer) og brennvidde heft montering i FN-heftende celler ble bare litt endret av TNC, som observert ved immunfluorescens. Disse observasjoner tyder på at de mekanismer som påvirker TNC kreftcelle adhesjon og spredning på en FN substrat er ikke generelt, men strengt avhengig av det spesifikke cellelinjen og på den eksperimentelle oppstilling anvendes.
Det er kjent at evnen av kreftceller til å interagere med ekstracellulære matriksproteiner, som FN, er avgjørende for celle invasjon og migrering. Våre data viser at antallet av kreft i bukspyttkjertelen celler som fester seg til FN ved korte tider er redusert i nærvær av TNC men er fremdeles høy og i rekken av antall celler fester seg til TNC alene. TNC kan derfor virke som en modulator av tidlige trekkende hendelser, som omfatter substratet føle og adhesjon, og kan fremme cellemigrasjon ved å redusere celleklebeevne til FN, og dermed indusere en mer dynamisk interaksjon mellom tumorceller og ECM komponentene. Videre arbeid er nødvendig for å forstå hvordan TNC påvirker adhesjonen prosessen i løpet av bukspyttkjertelkreft celleinteraksjon med FN, som celle-reseptorer er involvert, og som ytterligere intracellulære reaksjonsveier kan bli endret.
Som konklusjon, de foreliggende data viser at TNC påvirker vekst, motilitet og adhesjon av kreft i bukspyttkjertelen celler, disse effektene å være avvikende, avhengig av celledifferensiering og på sammensetningen av den ekstracellulære matriks. Terapeutiske strategier som tar sikte på å forstyrre TNC rike matrise kan være derfor nyttig i kontrast den ekstraordinære aggressivitet PDAC.
Materialer og metoder
Vedlikehold av cellelinjer
bukspyttkjertelen celler linjer CAPAN-1, ASPC-1, Panc-1, MIA PACA-2 og SU.86.86 [18], [19], [33] (American Type Culture Collection, ATCC) ble opprettholdt i høy glukose DMEM medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), og 1 x Penicilline /Streptomicine (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en humified atmosfære med 5% CO2. Celler ble testet for mykoplasmaforurensning ved polymerasekjedereaksjon (TAKARA, Shiga, Japan).
Dannelse av stabile kloner som overuttrykker TNC
Plasmidet TNC-L, hvor store, unspliced isoform av TNC er klonet inn i en pCMV-Script vektor (Stratagene, La Jolla, CA, USA), var en generøs gave fra Dr. JH Pringle (Department of Cancer Studies molekylærmedisin, Universitetet i Leicester School of Medicine, UK) [34 ]. Den komplette TNC-L-kodende sekvens ble kontrollert ved sekvensering. Deretter TNC-L-plasmidet og den tomme vektoren pCMV-Script ble først linearisert med restriksjonsenzymet APA-L1 og deretter transfektert inn i de PANC-1 cancerceller ved hjelp av Fugene transfeksjon reagens (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), ifølge produsentens instruksjoner. Etter 2 dager ble cellene utsatt for G418-seleksjon ved en konsentrasjon på 1 mg /ml. Etter 2 uker i nærvær av G418, ble flere kolonier observert og amplifisert. Kolonier ble sjekket for tilstedeværelse av det transfekterte gen ved PCR-analyse ved bruk av primerne 5-CGTGTACGGTGGGAGGTCTA-3 (på pCMV-Script) og 5-GACACCAGGTTCTCCAGCTC-3 (i TNC-genet). Muligheten av PCR-positive kolonier for å utskille TNC ble bekreftet ved Western blotting. De positive kloner PANC-T2, PANC-T24, PANC-T27 og kontroll (mock transfektert) kloner PANC-C21, PANC-C23, PANC-C27 ble valgt for de følgende eksperimenter.
TNC og FN belegg
TNC ble kjøpt fra Millipore (Millipore GmbH, Schwalbach, Tyskland) og FN fra Biochrom (Berlin, Tyskland). For 96-brønners plater (levedyktighet og heft), ble belegg utført med TNC ved en sluttkonsentrasjon på 1 pg /cm2. For 24-brønners plater (sårheling analyser) TNC-konsentrasjoner på 0,1 ug /cm2, 0,5 ug /cm2 og 2,5 pg /cm2 ble brukt. For 6-brønners plater (immunoblotting) en konsentrasjon på 0,5 ug /cm2 ble brukt. FN Belegget ble utført med en endelig konsentrasjon på 2 mg /cm2 i 96-brønns plater og 1 ug /cm2 i 24- og 6-brønns plater. Belegg proteiner ble tillatt å bli absorbert over natten ved 4 ° C, ble brønnene vasket med PBS for å fjerne ubundne proteiner og blokkert i 30 minutter ved 37 ° C ved tilsetning av 0,2% varme-denaturert (85 ° C i 12 min) BSA i PBS. Platene ble til slutt vasket to ganger med sterilt PBS og sterilisert ved UV-eksponering i 20 min. Dekk anvendt i immunofluorescens-eksperimenter ble plassert i 24-multibrønnsplater og belagt på samme måte.
