Abstract
Tykktarmskreft er en av de vanligste ondartet kreft på verdensbasis, men de nåværende terapeutiske tilnærminger for avansert tykktarmskreft er mindre effektive. Denne studien undersøkte assosiasjoner mellom uttrykket av kjernefysisk transkripsjon faktor SOX4 og ulike clinicopathologic parametere samt pasientenes overlevelse. Expression nivåer av atom SOX4 ble analysert ved immunhistokjemi; dataene består kolon vev fra 263 pasienter med tykktarmskreft. Sammenkoblet
t
tester ble brukt til å analysere forskjellene i atom SOX4 uttrykk mellom tumor og ikke-tumorvev fra hver pasient. To-tailed Χ
2 tester ble utført for å bestemme hvorvidt forskjellene i atom SOX4 uttrykk og clinicopathologic parametere var signifikant. Time-til-event endepunkter for clinicopathologic parametre ble plottet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, og statistisk signifikans ble bestemt ved bruk av univariate log-rank tester. Cox proporsjonal risikomodell ble brukt for multivariat analyse for å fastslå uavhengighet av prognostiske effekten av atom SOX4 uttrykk. Overekspresjon av atom SOX4 var signifikant korrelert med dybden av invasjonen (
P
= 0,0041), fjernmetastaser (
P
0,0001), og scene (
P
= 0,0001 ). Pasienter som viste høye uttrykk nivåer av atom SOX4 oppnådd en vesentlig dårligere sykdomsfri overlevelse, sammenlignet med pasienter med lav SOX4 uttrykk nivåer (
P
0,001). Univariat Cox regresjonsanalyse viste at overekspresjon av kjernefysisk SOX4 var en klar prognostisk markør for tykktarmskreft (
P
= 0,001). Overekspresjon av kjerne SOX4 kan anvendes som en markør for å forutsi utfallet av pasienter med kolonkreft
relasjon:. Lin C-M, Fang C-L, Hseu Y-C, Chen C-L, Wang J-W, Hsu S-L, et al. (2013) Kliniske og Prognostiske Konsekvenser av transkripsjonsfaktor SOX4 hos pasienter med tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (6): e67128. doi: 10,1371 /journal.pone.0067128
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 21 mars 2013; Godkjent: 14 mai 2013; Publisert: 27 juni 2013
Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Chi Mei Medical Center (Grant No. 101cm-TMU-03) (https://www.chimei.org.tw). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de hyppigste kreftformer og en vanlig årsak til kreft dødsfall [1]. I Taiwan, rangerer tykktarmskreft som oftest diagnostisert kreft og fører til mer enn 4900 dødsfall årlig (https://www.doh.gov.tw/statistic/index.htm, åpnes i september 2012). Til tross for dagens kirurgiske teknikker og kjemoterapi som har gjort betydelige forbedringer, på grunn av dårlig prognose og fjernt invasjon og migrasjon, den totale forekomsten av tykktarmskreft er ca 5% og 5-års overlevelse for tykktarmskreftpasienter er svært lav [2]. Dermed er identifisering av nye mål for utviklingen av ikke-konvensjonelle behandlinger haster og vil dra nytte av fremgang i bred og dyp forståelse av den molekylære patogenesen av tykktarmskreft.
Blant de prognostiske markører nå tilgjengelig for tykktarmskreft, er det viktigste det amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) stadium bestemt av dybden av invasjonen, involvering av lymfeknuter, og fjernmetastaser. Imidlertid varierer prognosen selv blant pasienter på samme scene. I de siste tiårene, har flere studier antydet at genetiske endringer kan spille en rolle i utvikling og progresjon av kreft i tykktarmen [3], [4]. Studier i molekylær patologi kan bidra til å forstå sykdommen patogenesen og kanskje også avsløre nyttige prognostiske molekylære markører. Noen foreslåtte biologiske prognostiske markører overekspresjon av protein kinase CK2, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), Enhancer av Zeste homolog 2 og transglutaminase 2 [5] -. [8]
Hos mennesker, sex bestemmende region Y (SRY) eske familien, også referert til som SOX familien, omfatter 20 sterkt konserverte transkripsjonsfaktorer som spiller viktige roller i utvikling. Disse transkripsjonsfaktorer er definert ved en konservert sekvens signatur i høy mobilitet gruppe (HMG) DNA-bindende domene (DBD) [9], [10]. SOX4 er et 47-kDa-proteinet som er kodet av et enkelt ekson gen, som er sterkt konservert i virveldyr. I mus, er SOX4 spesifikt uttrykt i ovarier, testis, brystkjertel, og thymus og i mus T og pre-B-lymfocyttiske cellelinjer [11]. I tillegg er essensielt for utviklingen av hjerte, lymfocytter, og thymocytter, og SOX4-null-mus SOX4 dør av hjertefeil [12]. Den proliferative kapasitet på B-celle stamfedre er sterkt redusert i celler fra SOX4 knockout mus [13].
Den kliniske betydningen av SOX4 har fått økt oppmerksomhet de siste årene, med en rekke rapporter som tyder på at SOX4 kan bidra til tumor progresjon. Tre uavhengige studier screening for viktige onkogener viste at SOX4 ofte endres gjennom retrovirale innsett [14] – [16]. Den murine leukemi virus vanligvis målrettet SOX4, og stabiliserte SOX4 meldingen for å produsere B-cellelymfom som vises økte SOX4 beskjed nivåer [16]. Økt SOX4 ekspresjon er assosiert med svulster i blære, prostata, og med ikke-småcellet lungekreft [17] – [19]. Imidlertid er rollen til SOX4 i slike svulster ikke fullt ut forstått, og de rapporterte data har vist visse motsetninger. Mens SOX4 knockdown resulterte i apoptose av ACC3 adenoid cystisk karsinom celler, SOX4 overekspresjon fremmet cellesyklus og apoptose av HCT116 kolon carcinoma celler [20], [21]. Den mikroRNA (miRNA) MIR-335 hemmet metastatisk celle invasjon og handlet, i hvert fall delvis, gjennom målretting
sox4 Hotell og dens antatte mål
TNC
, som koder for et ekstracellulært matriks komponent inngår i celle migrasjon [22]. I motsetning til det høyere nivå av ekspresjon SOX4, jo bedre er prognosen for pasienter med Medulloblastomas og andre tumortyper, [23]. Dermed kan SOX4 utøve ulik effekt på kreftceller avhengig av konteksten og primær transformasjon mekanisme; videre studier er garantert å avklare dette spørsmålet.
Til dags dato ikke har blitt etablert den prognostiske betydningen av kjernekraft SOX4 uttrykk nivåer i menneskelig tykktarmskreft. Denne studien undersøkte sammenhengen mellom atom SOX4 uttrykk og clinicopathologic parametre, og evaluert betydningen av kjernefysisk SOX4 forutsi prognosen for pasienter med tykktarmskreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Institutional Review board på Chi Mei Medical Center godkjent vevet oppkjøpet protokollen for immunhistokjemisk og immunoblotting studien. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver deltaker før vev oppkjøpet.
Deltakere og Prøvene
Vi har samlet 263 rad tykktarm kreft tilfeller fra de medisinske filer av Chi Mei Medical Center i Taiwan. Alle pasienter som inngår i vår studie gruppen ble behandlet mellom 1998 og 2005, og hadde fått kolektomi med lymfeknute disseksjon. Alle saker fikk vev bevis for adenokarsinom via colonoscopic biopsi før operasjonen. Fullstendigheten av kirurgisk reseksjon ble oppnådd i alle tilfeller, og patologisk undersøkelse viste ingen svulst involvering av reseksjonskanten i kirurgiske prøver. Ingen av våre hadde pasientene fått preoperativ kjemoterapi og /eller strålebehandling. Den ikke-tumor porsjon ble oppnådd fra grovt normal tykktarmsslimhinne, atskilt fra svulsten, i resekterte kolon prøven. Clinicopathologic parametre for tykktarmskreft ble bestemt i henhold til AJCC klassifisering. Oppfølgings varighet for sykdomsfri overlevelse ble definert som perioden mellom drift dato og dagen for tilbakefall, i henhold til pasientens journal. For hver pasient, analyserte vi et par av svulst og ikke-tumor kolon vev for å bestemme atom SOX4 uttrykk.
Immunhistokjemisk analyse
Nuclear SOX4 uttrykk ble analysert ved immunhistokjemi. Parafininnstøpte vevsblokker ble delt på fem mikrometer og overført til objektglass (Muto Pure Chemicals Co. Ltd., Tokyo, Japan). Brystvev ble anvendt som en positiv kontroll for SOX4. Den negative kontroll medførte utelatelse av det primære antistoff og inkubasjon med fosfatbuffer saltvann. Snittene ble avvokset med xylen, etterfulgt av rehydrering i gradert alkoholer. Deparaffinized seksjoner ble inkubert i pH 6,0 citratbuffer i 40 min ved 95 ° C på en varmeplate for å hente antigener. Ytterligere antigen blokkering ble utført ved anvendelse av Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution (Dako North America Inc., Carpinteria, CA) i 5 minutter. Platene ble deretter inkubert med primært antistoff: polyklonalt anti-SOX4 (levetid, Victoria, Canada) i 1 time ved romtemperatur, ved en fortynning på 1:3200. Påvisning av den immunreaktive farging ble utført under anvendelse av avidin-biotin-peroksidasekompleks fremgangsmåten i henhold til produsentens instruksjoner. En følsom Dako REAL EnVision Detection System (Dako North America Inc., Carpinteria, CA) ble brukt. Etter inkubasjon med diaminobenzidin i 5 minutter, ble seksjonene motfarget med hematoksylin og montert i Dako Faramount Vandig monteringsmedium (Dako North America Inc., Carpinteria, CA) for mikroskopisk tolkning. Immunoreaktivitets ble semikvantitativt scoret basert på intensiteten i farging: 0, ingen farging; 1, svak flekker; 2, moderat farging; 3 sterk farging. Seksjoner med en score på 0 eller 1 vises lav uttrykk for SOX4, mens de som scoret to eller tre ble klassifisert med høy uttrykk eller overekspresjon av SOX4. Klinisk datainnsamling og immunhistokjemisk analyse ble utført uavhengig av hverandre, i en etterforsker-blindet studie.
Cell Culture
Humant normalt (FHC) og tykktarmskreft cellelinjer (DLD-en og WiDr ) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Cellelinjer ble godkjent av ATCC cellebiologi program, og ble passert for ikke lenger enn seks måneder før nye celler ble brakt ut av frossen tilstand eller en ny celle prøve ble kjøpt fra ATCC. Celler ble dyrket i DMEM /F-12 (FHC), RPMI-1640 (DLD-1), eller MEM (WiDr) medier supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin G, 100 ug /ml streptomycin sulfat, og 250 ng /ml amfotericin B.
Nuclear Protein Forberedelse
Nuclear proteiner ble hentet ved hjelp av NE-PER Nuclear Ekstraksjonsreagens (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble lagret ved -80 ° C inntil anvendelse. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av en BCA Protein Assay Kit (Pierce Bioteknologi) med bovint serumalbumin som en standard.
Immunoblotting
denaturert proteinprøver ble utsatt for 12% SDS-PAGE. Proteiner ble overført til nitrocellulosemembraner, og blokkerte Blottene ble inkubert ved 4 ° C over natten med anti-SOX4 polyklonalt antistoff (1:1000 fortynning). TATA-bindende protein ble anvendt som en intern kontroll for likt protein lasting. Blottene ble inkubert ytterligere med sekundære antistoffer konjugert med peroksidase (Sigma, St. Louis, MO) i 1 time ved romtemperatur. De ble deretter inkubert med SuperSignal West Femto Maximun Sensitivity substrat (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL), og utsettes for en Fuji medisinsk røntgenfilm (Fuji Photo Film Co., Tokyo, Japan). Bildebehandling ble utført med Fuji Bilde Gauge programvare.
Statistical Analysis
parvise
t
tester ble brukt for å vurdere forskjellen i atom SOX4 uttrykk mellom tumor og ikke-tumorvev for hver pasient. Vi undersøkte flere clinicopathologic parametere: alder, kjønn, dybde av invasjonen, lymfeknutestatus, fjernmetastaser, scene, grad av differensiering, vaskulær gjennomtrengning og perinevral invasjon. Sammenhengen mellom atom SOX4 uttrykk og hver clinicopathologic parameter ble undersøkt ved hjelp av χ
2 test. Den gang-til-event endepunkter for alle clinicopathologic parametre ble plottet i et Kaplan-Meier-metoden, og graden av signifikans ble beregnet ved univariate log-rank test. Parametere som fremkom som vesentlig (
P
≤0.05) i univariat analyse ble ført som variabler i multivariat Cox regresjonsmodell, og hazard ratio (HR) og uavhengighet prognostisk effekt kunne bestemmes i en trinnvis bakover mote. Alle data ble analysert ved hjelp av SPSS programvare versjon 17.0 (SPSS, Chicago, IL). En
P
verdien av 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Demografi
Denne studien registrert 263 pasienter med tykktarmskreft, 154 av dem var. menn og 109 var kvinner (tabell 1). Pasientenes alder varierte fra 21 til 92 år ved første diagnose (gjennomsnitt ± standarad avvik (S.D.): 68,0 ± 12,9 år). Basert på det AJCC klassifisering, 25 pasienter var i stadium I, 91 ble i trinn II, 108 ble i trinn III, og 39 ble i trinn IV. Den oppfølgingsperioden for alle pasientene varierte fra 0 til 146 måneder (gjennomsnitt ± S.D .: 58,6 ± 40,2 måneder). Under oppfølging, 116 pasienter døde av tykktarmskreft.
Nuclear SOX4 Expression ble oppregulert og Associated med Clinicopathologic Parametere i Colon Cancer
Vi brukte immunhistokjemisk analyse for å undersøke uttrykket av kjernefysiske SOX4 i vev oppnådd fra våre studie pasienter (Tall 1A til C). Nuclear SOX4 uttrykk var betydelig høyere i tumorvev enn hos ikke-tumorvev (
P
0,001). Overekspresjon av kjernefysisk SOX4 (scorene til 2 eller 3) ble observert i 119 av de 263 pasientene (45,2%). Western blot-analyse viste også at ekspresjon av SOX4 ble vesentlig øket i kolon kreftceller og vev, sammenlignet med normale celler og vev (Figur 1D). I tillegg kvantitativ real-time PCR-analyse viste at ekspresjon av SOX4 mRNA ble vesentlig øket i tumorvev sammenlignet med ikke-tumor vev (tabell 2). Som vist i tabell 3, overekspresjon av atom SOX4 korrelerte signifikant med følgende parametre: dybde invasjon (
P
= 0,0041), fjernmetastaser (
P
0,0001), og scene (
P
= 0,0001). Ingen signifikant sammenheng dukket opp mellom overekspresjon av kjernefysisk SOX4 og alder, kjønn, lymfeknutestatus, grad av differensiering, vaskulær invasjon, eller perinevral invasjon
Paneler A til C:. Tykktarmskreft prøvene analysert ved immunhistokjemi med et antistoff mot SOX4 . Panel A viser en prøve uten SOX4 uttrykk; Panel B viser et eksempel med lavt uttrykk nivå av SOX4; Panel C viser et eksempel med høyt uttrykk nivå av SOX4. Panel D: Nuclear SOX4 protein uttrykk ble undersøkt i 3 kolon celler og tre ikke-tumor /svulst par av kolon vev. Forstørrelse:. 200 ×
Overuttrykte Nuclear SOX4 som en prognostisk markør for tykktarmskreft
Sammenslutning av kliniske resultater med atom SOX4 uttrykk er vist i figur 2 . Overuttrykte atom SOX4 var signifikant assosiert med kortere sykdomsfri overlevelse (
P
0,001). Pasienter med høy uttrykk nivåer av atom SOX4 oppnådde en 5-års sykdomsfri overlevelse på 58,3% sammenlignet med 76,6% for pasienter med lave nivåer. Videre er høy-trinns GC (stadium III og IV) ble benyttet for å finne ut virkningen av atom SOX4 overekspresjon på prognosen. Overekspresjon av atom SOX4 var signifikant assosiert med kortere sykdomsfri overlevelse (
P
= 0,016, figur 3). Pasienter med høy uttrykk nivåer av atom SOX4 oppnådde en 5-års sykdomsfri overlevelse på 44,8% sammenlignet med 63,8% for pasienter med lave nivåer.
Alle statistiske tester ble tosidige og signifikansnivået var
P
. 0,05
Alle statistiske tester ble tosidige og signifikansnivået var
P
. 0,05
resultatene av univariat analyse av prognostiske markører for tykktarmskreft er vist i tabell 4. Sykdomsfri overlevelse var signifikant korrelert med hver av følgende: dybden av invasjonen (
P
= 0,029), lymfeknutestatus (
P
0,001), fjernmetastaser (
P
0,001), scene (
P
0,001), vaskulær invasjon (
P
0,001), perinevral invasjon (
P
0,001), og overekspresjon av atom SOX4 (
P
= 0,001). Men sammenhengen mellom overekspresjon av kjernefysisk SOX4 og overlevelse var ikke signifikant etter kontroll for andre kjente prognostiske markører i multivariat analyse (
P
= 0,425, tabell 5). I multivariat analyse, fjernmetastaser (HR = 0,052, 95% KI = 0,024 til 0,111,
P
= 0,001). Den prognostisk uavhengig
Diskusjoner
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP er fortsatt et stort folkehelseproblem i verden [1]. Til tross for dagens kirurgiske teknikker og kjemoterapi som har gjort betydelige forbedringer, vaksinen for avansert tykktarmskreft er fortsatt lav og sykelighet er fortsatt høy [2]. Større kunnskap om de molekylære mekanismene bak utviklingen av denne dødelige svulst er nødvendig hvis nye strategier for å forebygge og behandle tykktarmskreft skal utvikles. Spesielt identifikasjon av molekyler som er endret i løpet av kreft initiering og progresjon kan gi verdifulle verktøy som prognostiske markører eller terapeutiske mål.
uttrykk for SOX4 i humane kreftformer varierer i henhold til krefttypen. Den SOX4 nivået er forhøyet i tallrike humane kreftformer, inkludert i blære, prostata, endometrium, og leveren, mens det reduseres i melanoma og galleblærekreft [17], [18], [24] – [27]. I denne studien har vi vurdert de uttrykk nivåer av atom SOX4 i tykktarm vev oppnådd fra 263 pasienter med tykktarmskreft. Våre resultater var i overensstemmelse med de i blære og prostata kreft, og viste at kjernefysisk SOX4 uttrykk ble forhøyet i tykktarm tumorvev i forhold til ikke-tumor kolon vev. De immunoblottingforsøk Resultatene bekreftet at atom SOX4 uttrykk var høyere i tykktarm kreft celler enn i normale tykktarmceller.
Våre funn viste også at overekspresjon av atom SOX4 i tykktarm kreft vev var nært korrelert med tumorinvasjon og metastasering. Den mekanismen som SOX4 utøver sin invasiv og metastatisk aktivitet er fortsatt uklart. I den første linje av bevis, ble mirnas (liten ikke-kodende RNA med regulatoriske funksjoner) vist seg å være forbundet med tumorinvasjon og metastase [28], [29]. Tidligere arbeid med Tavazoie et al. viste at MIR-335 undertrykker metastase gjennom nedregulering av SOX4 [22]. Dette resultatet antydet at SOX4 er knyttet til tumor aggressivitet.
Den andre linjen av bevis har blitt gitt av studier på epitel-mesenchymale overgang (EMT), som er et viktig steg i løpet av embryo [30]. Akkumulerende bevis tyder på at upassende utnyttelse av emt kan være en komponent av invasjonen av mange tumorer av epitelvev. Cellekarakteristikker blir sterkt påvirket i løpet av EMT, noe som resulterer i endringer i celle-celle og celle-matriks interaksjoner, celle motilitet, og invasivitet [31], [32]. Fersk studie av Zhang et al. viste at overekspresjon av SOX4 i menneskelige mammary epitelceller førte til oppkjøp av mesenchymale egenskaper, og forbedret celle migrasjon og invasjon. Videre SOX4 positivt regulert ekspresjon av kjente EMT induktorer og aktivert TGF-β veien for å bidra til EMT. Ekspresjon av SOX4 ble indusert ved TGF-β og var nødvendig for TGF-β-indusert EMT. Disse funnene viser at SOX4 spiller en viktig rolle i progresjon av brystkreft, ved dirigere EMT [33]. Disse studiene kan forklare delvis for foreningen av overekspresjon av kjernefysisk SOX4 med tumorinvasjon og metastasering.
Nøyaktig prediksjon av risiko for tilbakefall vil bistå i å minimere de negative effektene av tykktarmskreft og maksimere den terapeutiske effekten av behandling . Av de tilgjengelige prognostiske markører for tykktarmskreft, er det AJCC scenen viktigste. Imidlertid varierer prognosen selv blant pasienter ved den samme stadium av sykdommen; dermed er alternative prognostiske markører søkt. Få studier har undersøkt den prognostiske verdien av SOX4 proteiner. Aaboe et al. viste at en sterk sammenheng eksisterte mellom økt SOX4 uttrykk og økt pasientoverlevelse i tilfeller av blærekreft [17]. Tilsvarende Kim et al. viste at overekspresjon av SOX4 protein hos pasienter med leverkreft var assosiert med bedre pasientens utfall [25]. I tillegg Jafarnejad et al. viste at i melanom pasienter, eksisterte en sterk sammenheng mellom redusert SOX4 uttrykk og dårlig pasient overlevelse [26]. Vi fant ingen publiserte rapporter diskuterer prognostisk betydning SOX4 i menneskets tykktarm kreft. Resultatene fra denne studien viste at kjernefysisk SOX4 overekspresjon ble omvendt korrelert med pasientens overlevelse; dette funnet motsagt de tidligere rapporterte positive assosiasjoner. Vår studie var den første til å vise at overekspresjon av atom SOX4 kan forutsi dårligere resultater for pasienter med tykktarmskreft. Overekspresjon av kjernefysisk SOX4 synes å være en nyttig markør for å forutsi resultater hos pasienter med kreft i tykktarmen som har fått kirurgisk fjerning av tumoren. Derfor bør pasienter med tykktarmskreft som viser overekspresjon av kjernefysisk SOX4 følges opp nøye. Fordi vår pasientgruppe var liten, bør fremtidige studier inkludere et større tykktarmskreft pasientgruppe å belyse den prognostiske betydningen av kjernekraft SOX4 i denne sykdommen.
I sammendraget, denne studien gitt bevis for den kliniske betydningen av overexpressed SOX4 i pasienter med tykktarmskreft. Våre funn tyder på at målretting SOX4 kan gi en ny terapeutisk modalitet for behandling av tykktarmskreft.
