Abstract
Bakgrunn
Topoisomerase I (Top1) er målet for Top1 inhibitor kjemoterapi.
Top1
genet, som ligger på 20q12-q13.1, blir ofte oppdaget ved høye kopiantall i tykk- og endetarmskreft (CRC). Denne studien utforsker mekanismen, frekvens og prognostisk effekt av
Top1
genet avvik i fase III CRC og hvordan disse kan oppdages ved fluorescerende in situ hybridisering (FISH).
Metoder
Ni CRC-cellelinje metafasemarginer ble analysert ved hjelp av FISH med en
top1
sonde i kombinasjon med et referanse sonde dekker enten centromeric region av kromosom 20 (CEN-20) eller kromosom 2 (CEN-2) . Vevssnitt fra 154 chemonaive stadium III CRC pasienter, tidligere har studert med
Top1 /
CEN-20, ble analysert med
Top1 /
CEN-2. Relasjoner mellom biomarkør status og total overlevelse (OS), tid til tilbakefall (TTR) i CRC og tid til lokalt tilbakefall (LR, endetarmskreft only). Ble bestemt
Resultater
top1
avvik ble observert i fire cellelinje meta. I alle cellelinjer CEN-2 ble funnet å reflektere kromosom ploidinummer nivåer og derfor
Top1 Twitter /CEN-to probe kombinasjonen ble valgt til å identifisere
Top1
genet gevinster
(Top1 /
CEN-2≥1.5). Ett hundre og tre pasienter (68,2%) hadde
Top1
gevinst, hvorav 15 pasienter (14,6%) hadde en forsterkning (
Top1 /
CEN-20≥2.0).
Top1
genet gevinst ikke har noen tilknytning til kliniske endepunkter, mens
Top1
forsterkning viste en ikke-signifikant trend mot lengre TTR (multivariat HR: 0,50, p = 0,08). Når forsterkede saker ble segregert fra andre tilfeller av genet gevinst, ikke-forsterkede genet øker (
Top1
/CEN-2≥1.5 og Top1 /CEN-20 2,0) viste en trend mot kortere TTR (univariate HR: 1,57, p = 0,07).
Konklusjoner
top1
genkopitallet økning forekommer ofte i fase III CRC i en mekanisme som ofte inneholder CEN-20. Ved hjelp av CEN-2 som et mål for svulst ploidinummer nivåer, var vi i stand til å skille mellom ulike mekanismer for genet gevinst, som syntes å variere i prognostisk effekt.
Top1
FISH retningslinjene har blitt oppdatert
Citation. Smith DH, Christensen IJ, Jensen NF, Markussen B, Rømer MU, Nygård SB, et al. (2013) Mekanismer av topoisomerase I (
Top1
) genkopitallet Økning i en Stage III tykktarmskreft Pasient Cohort. PLoS ONE 8 (4): e60613. doi: 10,1371 /journal.pone.0060613
Redaktør: Anthony WI. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 19 desember, 2012; Godkjent: 28 februar 2013; Publisert: 05.04.2013
Copyright: © 2013 Smith et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den danske Agency for vitenskap, teknologi og innovasjon gjennom Industrial PhD-program. Nils Brünner og Hans Jørgen Nielsen ble støttet av det danske Rådet for strategisk forskning, Simon Fougner Hartmanns Family Foundation, IMK Almene Foundation, Kathrine og Vigo Skovgaards Foundation, Tømrermester Johannes Fog Foundation, Fabrikant Einar Willumsens Memorial Trust, dansk Kreftforeningen, Den danske Medical Forskningsrådet, Den Hede Nielsen Foundation, direktør Ib Henriksens Foundation, sagbrukseier Jeppe Juhl og Hustru Ovita Juhl Foundation, The Kornerup Fund, The Aase og Ejnar Danielsen fondet og Den Aage og Johanne Louis-Hansen Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. David Hersi Smith, Sven Müller og Kirsten Vang Nielsen er ansatt ved Dako A /S . Nils Brünner er medisinsk rådgiver for Dako A /S. Ib Jarle Christensen er en ekstern konsulent for Dako A /S. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. I 2011 utgjorde CRC for anslagsvis ni prosent av nye krefttilfeller, samt ni prosent av kreftdødsfall i USA [1]. For behandling av avansert CRC (stadium IV), to kjemoterapi alternativer er tilgjengelige: 5-Fluorouracil (5-FU, kapecitabin) i kombinasjon med irinotecan (FOLFIRI) eller oxaliplatin (FOLFOX) pluss biologiske legemidler. Flere studier rapporterer tilsvarende responsrater mellom de to regimene i førstelinjebehandling av avansert sykdom [2] – [4], med en enkelt studie rapporterer en signifikant høyere responsrate med FOLFOX [5]. Interessant, en av disse studiene rapporterte en annen linje 6% objektiv respons på FOLFIRI behandling mislykket FOLFOX og en 21% objektiv respons til andre linje FOLFOX behandling etter mislykket FOLFIRI, en indikasjon på ikke-komplett kryssresistens mellom irinotecan og oxaliplatin [4]. Dette funnet reiser spørsmålet om hvorvidt en undergruppe av pasientene som fikk FOLFOX som førstelinjebehandling ville hatt godt av FOLFIRI som førstelinjebehandling, eller vice versa. Vi anser derfor at arbeidet rettet mot oppdagelsen av en prediktiv biomarkør profil for FOLFOX /FOLFIRI behandlingsresultat er garantert.
Irinotecan, en pro-drug av SN-38, fungerer ved å hemme enzymet topoisomerase (Top1) [6]. Top1 spiller en avgjørende rolle i å lindre de topologiske påkjenninger som oppstår under DNA replikasjon og transkripsjon av nicking, avslappende og re-ligere dobbelttrådet DNA-strukturen. SN-38 binder Top1 og stabiliserer de mellomliggende DNA-Top1 komplekser. Påfølgende re-ligering blir hemmet, noe som til slutt resulterer i celledød som følge av DNA-skade under DNA-replikasjon eller transkripsjon [6], [7]. Top1 har på grunn av sin rolle som et mål for SN-38 blitt foreslått som en mulig prediktiv biomarkør for FOLFIRI behandlingsresultat. I avansert kolorektal kreft, to store retrospektive studier som undersøker sammenhengen mellom Top1 protein nivåer og irinotecan behandlingsresultat produsere motstridende resultater [8], [9]. Mens dette arbeidet har vært rettet mot å studere Top1 protein nivåer, forskning på kromosom endringer som involverer topoisomerase I genet (symbol:
Top1
) er begrenset. Tilhører 20q12-q13.1, en del av de ofte fått 20Q region innblandet i adenom til karsinom progresjon [10] – [13],
Top1
er funnet ved høye kopiantall i en stor andel av stadium III CRC prøver når oppdaget av Fluorescent in Situ Hybridisering (FISH) [14], [15], etter
i vår studie av
top1
har vi tidligere vist at i en fase III CRC chemonaive pasient kohort (n = 154), økt
top1
genkopitallet var signifikant assosiert med lengre overlevelse (OS) [15]. Interessant, anslagsvis 71% av pasientene næret en
Top1
genet kopi økning, mens bare 10% av pasientene næret en
Top1
forsterkning [
Top1 Twitter /CEN-20 ( cent 20) Ratio ≥2.0] [15], noe som indikerer at genet forsterkning er ikke den vanligste mekanismen for å generere flere kopier av
top1
. En sterk korrelasjon mellom
Top1 Hotell og CEN-20 ble funnet, avslører en sammenheng mellom
Top1 Kjøpe og CEN-20 kopi tall. Dette skulle tilsi at genet gain mekanismer som involverer både
Top1
locus og kromosom 20 centromeric regionen også oppstå, muligens ved gevinst på hele 20Q arm ved f.eks isochromosome formasjon eller hel kromosom 20 gevinst (aneusomy). Denne type genkopitallet økningen skjer ved mekanismer som er knyttet til kromosom missegregation og ikke genamplifikasjon. Måling av genkopitallet endringer av fisk tradisjonelt er avhengig av bruk av en samme kromosom referanse sonde, f.eks ved hjelp av CEN-20 for å måle gener på kromosom 20, vi derfor satt ut for å utvikle en roman FISH analyse for å skille vevsprøver med
Top1
kopiere antallet øker som følge av presiseringer fra de med øker på grunn av 20Q gevinst eller aneusomy etter søker en referanse probe rettet mot en urelatert kromosom.
formålet med studien er å bestemme frekvensen av
top1
endringer, kartlegge eventuelle prognostiske effekten av disse gense avvik, identifisere avskjær som gjenspeiler de underliggende genetiske mekanismene for
top1
kopiere antall endringer og oppdatere FISH scorings retningslinjer for å redusere observatør arbeidsmengde. For å oppnå disse målene, mekanismen av
Top1
genet kopi gevinst ble undersøkt i et panel av CRC cellelinjer med sikte på å finne en referanse probe som virkelig gjenspeiler ploidinummer nivåer, slik at
Top1
kopitall økninger skal påvises i forhold til det totale antall kromosomer (ploiditet nivå), og dette gjøres best ved bruk av et gen for centromeren-forhold. En ny sonde kombinasjoner, som består av
Top1
og en cent 2-spesifikke (CEN-2) probe, ble deretter påført på de tidligere testede stadium III CRC pasientprøver for å diskriminere mellom pasienter som hadde
Top1
kopi tallet øker som følge av mekanismer som involverer kromosom missegregation og de som er forårsaket av genamplifikasjon. Forholdet mellom de ulike mekanismer for
Top1
kopitall øker og prognose pasient ble undersøkt. I tillegg basert på all fisk data, kan vi oppdatere
Top1
FISH scorings retningslinjer.
Materialer og metoder
2.1 Pasienter og klinisk materiale
En hundre femtifire CRC pasienter med histologisk bekreftet stadium III adenokarsinomer og oppnåelig FFPE-tumorprøver ble valgt som tidligere beskrevet (se fig. 1) [15]. Alle pasientene hadde kirurgiske reseksjoner av deres CRC og fikk ingen adjuvant radio- og /eller kjemoterapi, da dette ikke var en del av standard CRC behandling i Danmark på den tiden (april 1991 til august 1993). Pasientene ble randomisert til enten ranitidin eller placebo i opptil fem år uten effekt av ranitidin på overlevelse rapportert [16]. Deltakerne forutsatt skriftlig informert samtykke og studien ble gjennomført i henhold til Helsinki II-erklæringen med godkjenning fra den danske Sundhedsstyrelsen (2760-419-1989), Data Protection Agency (1991-1110-751) og Central National etiske komité ( KF 01-2045 /91). Godkjenningen inkludert innsamling av vevsprøver for påfølgende analyse av biologiske markører (KF 01-078 /93)
2.2 Utarbeidelse av meta Non-avkortet Interphase kjerner
CRC cellelinjer Colo-205, HCC-2998, HCT-15, HCT-116, HT-29, KM12, og SW620 ble oppnådd fra NCI /Utvikling Therapeutics Program, mens DLD -1, ble LoVo, og LS-174T oppnådd fra American Tissue Culture Collection. Cellelinjene ble opprettholdt ved 37 ° C, 5% CO
2 i RPMI 1640 Glutamax ™ vekstmedium (Invitrogen, Carlsbad, USA) supplert med 10% føtalt kalveserum (Invitrogen). Når kulturene nådde en sammenfletting av ~70%, ble colcemid (Invitrogen) tilsatt, og kulturene ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C. Deretter ble cellene høstet, og en hypoton behandling ble utført (0,075 M KCl) i 10 minutter. Fiksering ble utført (fiksativ: 03:01 vol /vol absolutt metanol og iseddik). Og denne suspensjonen ble dryppet på glassplater
2,3 Top1 /CEN-2 Probe Blanding
top1
genproben er tidligere blitt beskrevet andre steder [14]. En CEN-2-spesifikk probe (Dako, Glostrup, Danmark), som består av flere FITC-merkede peptid-nukleinsyre-monomerer som er rettet mot gjentatte α-satellitt-sekvenser, ble kombinert med Texas Rødt-merket DNA-genproben i IQFISH buffer [17] (Dako).
Top1 Twitter /CEN-20 probe kombinasjonen har tidligere blitt beskrevet [14].
2,4 FISH Prosedyre
Fisk reagenser var fra Cytologi FISH Accessory Kit (K5499) og histologi FISH Accessory Kit (K5799) (Dako). Metafase-prøver ble fiksert i 3,7% formaldehyd, vasket, tørket (i en 70%, 85%, 96% etanol-serie) og lufttørket. FISH sonden ble lastet på slide, denaturert ved 82 ° C (
Top1 Twitter /CEN-02:05 min,
Top1 Twitter /CEN-20:10 min) og hybridisert (
Top1 Twitter /CEN-02:01 h,
top1 Twitter /CEN-20: over natten). Overflødig probe ble fjernet ved å vaske i stringens buffer (
Top1 Twitter /CEN-2:63 ° C,
Top1 Twitter /CEN-20:65 ° C). Lysbilder ble vasket, dehydrert, lufttørket og montert.
Top1 Twitter /CEN-2 FISH hybridisering til FFPE- prøver (tykkelse: 3 mikrometer) ble utført i henhold til produsentens anbefalinger (Dako). I korthet, ble objektglassene varme forbehandlet (i mikrobølgeovn) og pepsin spaltet ved 37 ° C. Objektglassene ble deretter denaturert ved 66 ° C i 10 minutter og hybridisert ved 45 ° C i 1-2 timer og deretter behandlet som beskrevet ovenfor.
2.4.1 Skårer.
FISH-signaler var opprinnelig scoret som tidligere beskrevet [14]. Kort fortalt signaler ble talt i 60 relevante ikke-overlappende kjerner hvis signalene var, som et minimum, synlig på 200 × forstørrelse i riktig filter. Skåring ble utført på 1000 × forstørrelse i Texas Red /FITC dobbelt filter. Signal tellinger ble skrevet direkte inn i en elektronisk ark scoring (vennlig levert av A. Schønau, Dako, Glostrup, Danmark). I første omgang ble 60 kjerner scoret for hver prøve følgende
TOP2A
FISH pharmDx ™ retningslinjer (kode K5333, i pakningsvedlegget, en
st utgave 2008.01.18) hvor kjerner husing begge signalene, samt kjerner husing bare referansesignalene ble scoret, noe som letter påvisningen av genet slettinger. For å forbedre analysen følsomhet, bare kjerner husing både generasjo- og referansesignalene ble inkludert for videre analyse.
For å bestemme mekanismen av
Top1
kopiere nummer økning i cellelinjer, signal steder og tallene var kjent for 50 metafaser for hver cellelinje. Det totale antall kromosomer for hver cellelinje ble bestemt ved å ta digitale bilder av tre meta for hver cellelinje og telle det totale antall kromosomer manuelt.
For å bestemme haploid, diploid, triploid og tetraploide områder for CEN -2, 60 kjerner ble tellet i upåvirket epitel inntil tumorvev. Den diploide utvalg ble definert som følger 2n – (n /2) [min] ≤2n 2n + (n /2) [max], hvor 2n tilsvarer gjennomsnitts CEN-2 tellinger per kjerne i (diploid) upåvirket epitel. Den triploid og tetraploide områder ble funnet ved hjelp av 3n eller 4n stedet for 2n, henholdsvis. De haploide og høye ploidinummer nivå områder ble definert som under diploid rekkevidde og over tetraploide områder, henholdsvis. Definisjon av ploidinummer områder har tidligere blitt beskrevet [18].
2,5 statistiske metoder
Alle beskrivende og overlevelse analyser ble utført ved bruk av SAS 9.2 (SAS Institute, Cary, USA). R versjon 2.15.1 ble brukt i scoring metode optimalisering.
2.5.1 scoring metoder.
Gene til cent forhold ble beregnet ved å inkludere enten de første 10 eller 20 kjerner, bestemme
top1
status og sammenligne dette til status etter inkludering av alle relevante kjerner. Konkordans ble beregnet ved bruk av Kendall tau [tau = (enig-uenig) /(enig + uenig)]. Border intervaller nær cut-off verdier, hvor flere atomkjerner må inkluderes (for 10 kjerner, ytterligere 10 kjerner måtte scores, for 20 kjerner, ytterligere 20 kjerner måtte scores) ble definert som større enn eller lik 1,35 (min) og mindre enn 1,65 (max) når brukt cut-off var 1,5. Ved hjelp av HER2 /CEN-17 retningslinjer, ble grenselinjen intervall som dekker cut-off på 2,0 defineres som er større enn eller lik 1,8 (min) og mindre enn 2,2 (max) [19]. Konkordans og gjennomsnittlig antall kjerner scoret ble beregnet med og uten grense intervaller
2.5.2 Survival analyse
Tre endepunkter ble vurdert:.. Total overlevelse (OS, tid til døde av enhver årsak) , tid til gjentakelse (TTR, tid til ethvert tilfelle i forbindelse med kolorektal kreft), og tid til lokalt tilbakefall i endetarmskreft (LR) (beskrevet i detalj i [15]). Kaplan-Meier estimater for overlevelsessannsynlighet presenteres for de binære variablene og noen kombinasjoner. Multivariabel analyse ble gjort justert for kjønn, alder (per 10 års forskjell i alder) og tumorlokalisering (RC versus CC). Cox regresjonsanalyse ble benyttet for analysen. Modellene ble validert ved å vurdere forholdsmessig fortsatt drift og linearitet for kontinuerlige kovariatene ansette Schönfeld og Martingale rester.
Top1 Hotell og CEN-2 kopiantall, når analysert som en kontinuerlig variabel ble log transformert (base 2) og derfor reflektert en todelt forskjell for disse variates. Resultatene er presentert av hazard ratio (HR) med 95% konfidensintervall (KI) og p-verdier. Alle beregnede p-verdier var tosidig og betraktet som signifikant ved 0,05.
Resultater
3.1 Mekanismer av top1 Gene Kopier Økning i cellelinje Panel
For å finne den underliggende mekanismen (e) av
top1
genkopitallet øker, metafase pålegg ble fremstilt fra et panel på ti CRC-cellelinjer. Metafase-preparat var vellykket for alle unntatt en av cellelinjene (LS-174T). Etter påfølgende hybridisering med
Top1 Twitter /CEN-20 probe, metafase sprer ble analysert med hensyn til totalt antall kromosomer, antall generasjo- og cent-signaler, samt signal beliggenhet, resultatene av disse kan sees i Tabell 1 og Figur 2.
top1
genkopitallet økning ble observert i fire av de ni cellelinjer. I både Colo-205 og SW620, gen vinning så ut til å være knyttet til kromosom 20 aneusomy (fig. 2A og 2D, henholdsvis). I HT-29 (Fig. 2B),
Top1
genet gevinst skjedde på en måte som tyder på 20Q isochromosome formasjon. I KM12,
Top1
gevinst skjedde uavhengig av CEN-20 (Fig. 2C). Nei
Top1
presiseringer ble observert. Som vist i tabell 1, bare
Top1
genet gevinster som ikke innebærer CEN-20 (i en 1:01 mote) er reflektert i
Top1 Twitter /CEN-20-forhold.
A: Colo-205, B: HT-29 (nede til høyre: digitalt forstørret isochromosome), C: KM12, D: SW620. Merk:. På grunn av eksistensen av to kromatider i hvert metafase kromosom, er den observerte antall gener signaler det dobbelte av hva som er observert i en interfase nucleus
3.2 Identifisering av en ny referanse probe
for å identifisere et relevant markør for celle ploidiresultat, dvs. det totale antall kromosomer, NCI og NCBI SKY /M-FISH og CGH Database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky /skyweb.cgi) ble vist. Kromosom 2 syntes å være minst berørt av uavhengige numeriske avvik, som hele kromosom gevinst, og ble derfor valgt for videre analyse i cellelinjen metafase panel. Som vist i tabell 1, ble triploide cellelinjer (Colo-205 og HT-29) finnes for å fremstille tre CEN-2 signaler, mens de diploide cellelinjer produsert bare to. Alle
Top1
genet kopi økninger ble reflektert i
Top1 Twitter /CEN-to forhold med en cut-off verdi på 1,5, noe som representerer en 03:02 situasjon mellom gen og cent og reflektere en ekstra
top1
kopiere i en diploid celle.
3,3 Stage III CRC pasientmateriale
top1 Twitter /CEN-2 FISH hybridisering og evaluering var vellykket for 151 av 154 pasient FFPE-tumorprøver (98%) (se fig. 1). Fordelingen av
Top1 Kjøpe og CEN-2 signaler var homogen i vevsprøver. For å forbedre følsomheten for å detektere prøver å huse flere eksemplarer av
Top1
, bare kjerner husing både
Top1 Kjøpe og CEN-2 signaler ble inkludert i påfølgende analyse, noe som resulterte i en median på 58 kjerner scoret for hver kreftprøve (range: 47-60). I 50 tilfeldig utvalgte prøver, ble CEN-2 signaler telles i upåvirket tykktarmsslimhinnen å bestemme gjennomsnitts signaler teller (gjennomsnitt: 1.37, median: 1,38, Område: 1,20 til 1,62). Disse tellinger ble brukt for å definere den diploide området (se avsnitt 2.4.1).
I tumoren materiale, CEN-2 varierte 1,19 til 2,52 med en median på 1,70. Ved å sammenligne gjennomsnittlig CEN-2 signaler tellinger fra tumor kjernene til de ikke-tumor kjerner, kan de fleste (97,4%) av tumorprøver bli klassifisert som skjuler to (disomic) eller tre (trisomic) kopier av kromosom 2 (tabell 2) . I tumorprøver,
Top1
signaler varierte 1,33 til 6,72 per kjerne med en median på 3,17 signaler mens
Top1 Twitter /CEN-to-forhold varierte 1,01 til 3,39 med en median på 1,92 . Ingen slettinger (
Top1
/CEN-2 0.8) ble observert.
3.3.1 Bestemme
Top1
status.
For å identifisere prøvene skjuler en
top1
genkopitallet økning, en
top1 Twitter /CEN-to-forhold cut-off på 1,5 ble brukt. Som vist på fig. 3, prøver produserer forholdstall lik eller over denne cut-off fått den
Top1
status «Gain », mens de under ble kalt»
Top1
Normal». I første omgang ble 103 pasienter (68,2%) klassifisert som «Gain» ved hjelp av denne cut-off.
Den røde linjen angir
Top1
genet signal og grønn prikk betyr centromeric signal. Eksempler er basert på CRC cellelinje meta resultater – trisomi (SW620), pentasomy (Colo-205), 20Q isochromosome dannelse (HT-29) og 20Q gevinst (KM12)
Når vevsprøver skjuler. en ekstra kopi av
top1
ble identifisert, data på
top1 Twitter /CEN-20 ble brukt til å belyse mekanismen av
top1
genet kopi økning. Ved å bruke en
Top1 Twitter /CEN-20 ratio cut-off på 2,0 til å skille mellom prøvene der
Top1
genet gevinst oppstår uavhengig av CEN-20 (
Top1 Twitter /CEN -20≥2.0) fra de hvor genet gevinst oppstår på grunn av aneusomies eller 20Q isochromosome formasjon (
top1
/CEN-20 2.0), prøver med en
top1
gevinst kan bli ytterligere dikotomisert inn forsterket og ikke-forsterket undergrupper. Derfor prøver å produsere et
Top1 Twitter /CEN-to forhold på lik eller over 1,5 og
Top1 Twitter /CEN-20 ratio over eller lik 2,0 ble kalt «
Top1
Amplification «, mens for de under 2,0 ble gitt en»
top1
Non-forsterket Gain «status (se fig. 3). Som vist i tabell 3, et flertall (58,4%) av tumorprøver mottok en
Top1
Ikke-amplifisert Gain status. Alle prøver som er klassifisert som
Top1
Amplification ble også funnet produsere en
Top1 Twitter /CEN-to-forhold på over 2,0 (se tabell 3).
For å verifisere kategorisering av prøver i undergrupper, betyr CEN-2 og CEN-20 signaler i tumorcellekjerner ble sammenlignet med deres respektive midler i upåvirket tykktarmsslimhinne, er resultatene av disse er oppført i tabell 2. prøver med midlere CEN-2 og CEN-20 i diploid utvalg tilhørte i 21/34 (61,8%) tilfeller til
top1
Normal kategori. Nær-triploid og CEN-20 aneusomic saker ble oftest funnet i prøvene klassifisert som
Top1
Non-forsterket Gain. CEN-2 aneusomy ble observert i 19 (12,6%) tilfeller.
3.3.2 Association med pasientenes prognose.
Forholdet mellom biomarkør status og pasientens utfall ble utforsket i både univariate og multivariate modeller . I denne pasient kohorten var det 112 dødsfall av alle årsaker og 88 tilbakefall blant kreftspesifikke dødsfall innen fem år [15].
Top1
kopiere nummer, av seg selv, var ikke signifikant assosiert med OS, TTR eller LR (se tabell 4). Høyere CEN-2 kopiantall var assosiert med bedre prognose med OS som klinisk endepunkt i multivariat analyse (HR: 0,38, 95% KI: 0,15 til 0,98, p = 0,04), mens bare en tendens ble observert i univariat analyse (HR : 0,49, se tabell 4)
i første omgang pasienter husing
top1
øker (
top1
Gain, se figur 3) ble sammenlignet med de uten (..
top1
Normal). Gevinst av
Top1
var ikke signifikant assosiert med OS eller TTR både i univariate og multivariate analyser (se tabell 4). Pasienter med
Top1
presiseringer (
Top1
/CEN-20≥2.0) ble opprinnelig sammenlignet med ikke-forsterket tilfeller (
Top1
Normal og
Top1
ikke-forsterket Gain undergrupper kombinert). Forsterkning av
Top1
var ikke signifikant assosiert med OS eller TTR, selv nærmet betydning for TTR i multivariat analyse (HR: 0,50, 95% KI: 0,23 til 1,09, p = 0,08). Analyse av
Top1
presiseringer i forhold til LR mislyktes på grunn av et svært begrenset antall hendelser. Andre cut-offs for både probe kombinasjoner ble undersøkt og resultatene er oppført i Tabell 4.
Etter den primære analysen av data, ble prøvene stratifisert i undergrupper avhengig av tilstedeværelse og type
Top1
økning (se fig. 3, som er oppført i tabell 3). Som vist i tabell 5, ble ingen signifikant forskjell observert mellom
Top1
Normal,
Top1
Non-forsterket Gain og
Top1
Amplification undergrupper med OS som endepunkt i både univariat og multivariat analyse. Med TTR som klinisk endepunkt,
Top1
ikke-forsterkede gevinster viste en tendens mot kortere TTR (HR: 1,57, 95% KI: 0,97 til 2,55, p = 0,07) i univariat analyse, og en lignende, men svakere, tendens observert i multivariat analyse (HR: 1,49).
Top1
presiseringer ikke viser noen signifikant sammenheng til TTR sammenlignet med
Top1
Normal baseline gruppen. En Kaplan-Meier plott for disse sammenhengene kan sees i fig. 4B
A (til venstre). OS, B (til høyre). TTR
3,4 Top1 Scoring Retningslinjer
Muligheten for å oppnå færre kjerner ved fastsettelse av
top1
status presenterer en mulighet for å redusere observatør arbeidsmengde. For å finne ut om dette var mulig, status for
Top1 Twitter /CEN-2 og
Top1 Twitter /CEN-20 ble bestemt ved bruk av 10 eller 20 kjerner og sammenlignet med forholdet status etter inkludering av alle relevante kjerner. Som vist i tabell 6, å oppnå en redusert antall kjerner, som for eksempel bare 10 eller 20 kjerner for å bestemme
Top1
/CEN-2-status (cut-off 1,5) klassifisert prøver med moderat samstemmighet (0,76 og 0,91, henholdsvis), som økte med innføringen av grenseintervaller, hvor flere kjerner må scores (se avsnitt 2.5.1). For påvisning av
Top1
amplifikasjoner (cut-off: 2,0), samstemmighet var forholdsvis høy (10 kjerner: 0,96, 20 atomkjerner: 0,99), og ble ikke forbedret ved bruk av grense intervaller. I tillegg alternative cut-offs ble undersøkt, er resultatene av disse er oppført i tabell 6.
Diskusjoner
4.1 Mekanismer av top1 Kopier nummer Øk
I denne studien ble fire ulike mekanismer for
top1
kopiere nummer økning identifisert. I cellelinjen panel mekanismer som involverer
Top1 Hotell og CEN-20 (Colo-205, HT29 og SW620) samt en mekanisme der
Top1
ble oppnådd uavhengig av CEN-20 (KM12) ble observert. I Colo-205 og SW620, ble kromosom 20 aneusomy observert, etter avtale med NCI og NCBI SKY /M-FISH og CGH Database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky/skyweb.cgi). Denne typen økning transpires grunn av missegregation av kromosomer under mitose, noe som resulterer i et unormalt antall kromosomer; en karyotypic tilstand kalt «Aneuploidy «.
I HT29,
Top1
gevinst skjedde på en måte som tyder på dannelsen av en isochromosome, på linje med andre resultater [20]. Denne mekanismen av
Top1
genkopitallet økning oppstår på grunn av et misdivision av cent (tverrgående brudd, i stedet for langsgående) i løpet av kromosom segregering, noe som resulterer i et kromosom med to identiske armer. I KM12, en ekstra
Top1
signalet ble observert på et kromosom som ikke havn en CEN-20 signal. I NCI og NCBI SKY /M-FISH og CGH Database, vises denne cellelinjen til båtplass en fusjon kromosom av 22q og en ekstra kopi av 20Q, hvor CEN-20 (eller i det minste de alfa-satellittsekvenser målrettet av sen- 20 probe) ble det ikke oppnådd sammen med resten av 20Q. Denne type forsterkning kan være et produkt av kromosom 20 aneusomy etterfulgt av en Robertsonske trans hendelse.
Mens genkopitallet økningen kan oppstå på grunn av hendelser som involverer større kromosomale regioner, som for eksempel gevinst på hele kromosomer eller kromosomarmer , kan det også oppstå på grunn av genamplifikasjon. Geneamplifikasjon har blitt foreslått å skje på flere måter, blant annet feil i DNA-replikasjon og gjentatte brudd-fusion-bro sykluser på grunn av dobbel tråd DNA pause eller telomerer dysfunksjon [21] – [23]. En kromosomal region fortrinnsvis oppnådd ved forsterkning er betegnet et «fragment», en tilnærmet 0,5-10 Mb DNA-fragment i lengde, og vanligvis omfatter genet (er) som er involvert i å fremme tumorvekst [24]. Det bør bemerkes at hele kromosom eller kromosom arm endringer generelt oppstå oftere, men i lavere magnitude, enn til mindre kromosom endringer [25].
I denne studien,
Top1
genamplifisering ble definert som
top1 Twitter /CEN-20 forhold lik eller over 2,0. Denne definisjonen innebærer at
finnes Top1
på nivåer det dobbelte av sin vertskromosomet. Derfor er denne typen genkopitallet økning sannsynligvis på grunn av kopiantallet økningen av et amplikon og ikke arm lengde kromosomale regioner, siden dens mekanisme av kopitallet øker er uavhengig av CEN-20. Ingen
Top1
presiseringer ble observert i de ni cellelinjer undersøkt, men ble påvist i 10% av tumorprøver. Dette kan tyde på at enten denne mekanismen er pasientspesifikk, eller at denne mekanismen var ikke til stede i vårt begrenset antall cellelinjer undersøkt. Forsterkning av
Top1
genet har også blitt rapportert i melanom [26] og magekreft [27].
Selv om hver av de nevnte mekanismene for
Top1
genkopitallet øke i oppstå som enkelthendelser i cellelinjer, våre resultater tyder på at de kan forekomme samtidig i vevsprøver. I 4/15 (26,7%) tilfeller av forsterkning (data ikke vist), ble det CEN-20 aneusomy oppdages, som indikerer en forsterkning mekanisme, så vel som en som involverer aneusomy eller isochromosome formasjon. I prøvene som er klassifisert som
Top1
Non-forsterket Gain, er det mulig at både 20Q isochromosomes og flere eksemplarer av kromosom 20 er til stede. Det er imidlertid bare mulig å klassifisere prøver i henhold til dominerende mekanisme.
4,2 rolle 20Q
Forsterkning av kromosom 20 eller 20Q har vært mye rapportert som et tilbakevendende kromosomfeil i tykk- og endetarmskreft [11 ], [28] – [33], som støtter den høye frekvensen av
top1
ikke-amplifiserte gevinster observert i denne studien. In vitro modeller antyder at 20Q gevinst spiller en utløsende rolle i tumordannelse, så vel som i økende cellulære priser spredning [34]. I kolorektal kreft, er 20Q antas å spille en rolle i kolorektal adenom til karsinom progresjon [10] – [13] og er ofte observert i tumorer som oppviser mikro stabile og /eller kromosomal ustabilitet fenotyper [32], [35], [36 ].
