Abstract
Bakgrunn
I Taiwan, har munnkreft som har årsaks vært forbundet med miljøkreftfremkallende. Karboanhydrase 9 (CA9) er angivelig overuttrykt i flere typer karsinomer og er generelt ansett som en markør for malignitet. Den aktuelle studien utforsket den kombinerte effekten av
CA9
genet polymorfismer og eksponering for miljøkreftfremkallende på mottakelighet for å utvikle muntlig plateepitelkarsinom (OSCC) og clinicopathological karakteristikk av svulster.
Metode og hovedfunnene
Fire single-nukleotid polymorfismer (SNPs) i
CA9
genet fra 462 pasienter med kreft i munnhulen og 519 ikke-kreft kontroller ble analysert av en real-time polymerase chain reaction (PCR ). Mens de studerte SNPs (
CA9
rs2071676, rs3829078, rs1048638 og 376 Del) var ikke forbundet med mottakelighet for kreft i munnhulen, GAA haplotype av 3
CA9
SNPs (rs2071676, rs3829078, og rs1048638) var knyttet til en høyere risiko for kreft i munnhulen. Videre er fire
CA9
SNPs kombinert med betel pund tygging og /eller tobakksbruk kan robust heve mottakelighet for kreft i munnhulen. Til slutt, pasienter med oral cancer som hadde minst en G allel av
CA9
rs2071676 var høyere risiko for å utvikle lymph-node metastasering (p
=
0,022), sammenlignet med de pasientene homozygote for AA.
Konklusjoner
Våre resultater tyder på at haplotype av rs2071676, rs3829078, og rs1048638 kombinert har potensial prediktiv betydning i oral karsinogenese. Gene-miljø interaksjoner av
CA9
polymorfismer, røyking, og Betel-pund tygging kan endre munnhulekreft mottakelighet og metastase
Citation. Chien MH, Yang JS, Chu YH, Lin CH, Wei LH, Yang SF, et al. (2012) Konsekvenser av CA9 Gene Polymorfisme og miljøfaktorer på Oral-Cancer Følsomhet og Clinicopathologic Kjennetegn i Taiwan. PLoS ONE 7 (12): e51051. doi: 10,1371 /journal.pone.0051051
Redaktør: Sevtap Savas, Memorial University of Newfoundland, Canada
mottatt: 27 august 2012; Godkjent: 29 oktober 2012; Publisert: 04.12.2012
Copyright: © 2012 Chien et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en bevilgning fra Taipei Medical University-Wan Fang Hospital (gi no. 101swf03 Dr. Chien og Dr. Yang). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Oral kreft kan oppstå i alle vev i munnen, men ca 90% er plateepitelkarsinom (SCCS). Slike kreft er kjent verden over for sin dårlig prognose og store onkologiske problemer [1]. Risikoen for at en person til munnhulekreft er mediert av genetiske faktorer og kreftfremkallende eksponerings atferd [2], [3]. Blant genetiske faktorer, enkelt-nukleotid polymorfismer (SNPs) er den vanligste typen av DNA-sekvensvariasjon som påvirker forekomsten og progresjon av gen-relaterte sykdommer. En SNP er en variasjon i DNA-sekvensen som oppstår når en nukleotid (A, T, C eller G) blir endret i det minste 1% av en viss populasjon. Når en SNP faller i en kodende sekvens, kan den bestemme en endring av en aminosyre i den relaterte proteinsekvensen. En slik SNP kalles nonsynonymous. I samsvar med degenerasjonen reglene for den genetiske koden, kan en SNP også generere den samme aminosyre, som kalles da et synonymt SNP. Av notatet, flere grupper indikerte at en SNP i et ikke-kodende region (3 «uoversatt regionen, UTR) av et gen kan også påvirke biologiske prosesser [4]
Kreft er et gen-defekt sykdom, og SNPs. kan muligens forutsi risikoen for kreft i munnhulen [5]. Derfor er strategier for genotyping relatert SNPs og analysere sine distribusjons frekvenser i et samfunn som ofte brukes til å forutsi risikoen og prognose av kreft. Betel-pund tygging, tobakksbruk og alkoholbruk er 3 vanlige kreftfremkallende eksponerings atferd. Kombinasjoner av disse miljøkreftfremkallende og visse gener polymorfismer kan øke en persons mottakelighet for kreft i munnhulen [5]. Dermed kan SNPs i visse gener påvirker ens respons på stimulering mot kreft fremmet av miljøfaktorer.
Hypoksi er en vanlig funksjon av humane solide svulster [6]. Tumor hypoksi fører til kreftceller til å gjennomgå adaptive endringer som gjør dem i stand til å overleve og formere [7]. Hypoksiske tumorer er forbundet med aggressiv tumorvekst, metastase, og behandlingssvikt i flere typer faste humane tumorer [8]. Utviklingen av en markør for hypoksiske svulster kan tillate vurdering av biologiske aggressivitet enkelte svulster, som kan i sin tur tilrettelegger individuelt skreddersydd behandling.
karbonanhydrasehemmere 9 (CA9), et glykoprotein som tilhører en familie av sink-inneholdende enzymer, ikke kommer til uttrykk i de fleste organer eller vev, men det er rikelig uttrykt i en rekke kreftformer og har vært undersøkt som en endogen markør for tumor hypoksi [9], [10].
CA9
ligger på kromosom 9p12-13, som består av 11 eksoner og koder for 459-aminosyre-protein, CA9. CA9 er et membranassosiert protein som katalyserer den reversible reaksjonen H
2O + CO
2↔H
++ HCO
3
-, som er avgjørende for en rekke forskjellige prosesser, herunder pH-regulering [11]. Gjennom denne aktivitet, bidrar CA9 opprettholde en normal pH på tumorceller i et hypoksisk mikromiljøet, noe som kan gi tumorcelle-proliferasjon [12]. Tidligere studier har vist at CA9 uttrykk representerer biologisk tumor aggressivitet og er assosiert med dårlig kliniske resultater i flere tumorer inkludert hode og nakke, livmorhals, nyre og lunge kreft [13] – [16]. Mer nylig, avvikende ekspresjon av CA9 i OSCC ble også demonstrert å være korrelert med nodal metastase og dårlig prognose [17] – [19]. Disse ulike funnene tyder på at CA9 spiller en viktig rolle i OSCC progresjon.
Før forskning rapportert at polymorfe variasjoner i ekson regionen
CA9
var assosiert med total overlevelse for metastatisk nyrecellekarsinom [11 ]. Bortsett fra den studien, ingen rapporter fokusert på sammenhengen mellom
CA9
polymorfismer og utvikling av solide tumorer. Den aktuelle studien undersøkte sammenhenger mellom SNPs (rs2071676, rs3829078 og 376del393) i ekson og 3′-UTR (rs1048638) regioner av
CA9
gen og risikoen for kreft i munnhulen (figur 1). Påvirkninger av disse SNPs kombinert med betelnøtt og tobakk, som fører til en mottakelighet for kreft i munnhulen, ble evaluert. Vi har også undersøkt sammenhengen mellom genetisk påvirkning og clinicopathological karakteristikker av kreft i munnhulen. Så vidt vi vet, er dette den første studien som viser en signifikant sammenheng mellom
CA9
polymorfismer og oral kreftutvikling i Taiwan.
Tall i diamanter representerer parvis
D
verdier. Denne tomten ble generert av Haploview programmet.
Resultater
Den statistiske analyser av demografiske kjennetegn er vist i tabell 1. Vi fant signifikant forskjellige distribusjoner av alder (
p
= 0,023), kjønn (
p
0,001), betel-pund tygging (
p
0,001), alkoholforbruk (
p
0,001 ), og tobakksbruk (
p
0,001) mellom kontroll deltakere og OSCC pasienter. For å redusere faren for interferens av miljøfaktorer, ble AORs med 95% konfigurasjons anslått av flere logis regresjonsmodeller etter kontroll for andre kovariater i hver sammenligning.
Alle analysert genmarkører i vår kontrollgruppen var statistisk bekreftet å være i HWE (
p
0,05). Dataene i Tabell 2 viser at etter både OSCC pasienter og kontroller, alleler med høyest frekvens fordeling var som følger: heterozygot A /G til 201 (rs2071676) locus og homozygot for A /A, C /C, og Ins /Ins henholdsvis for 1081 (rs3829078), 1584 (rs1048638) og 376 (376del393) loci av
CA9
genet. Etter å ha justert for variablene, var det ingen signifikant forskjell i å ha kreft i munnhulen hos personer med rs2071676, rs3829078, rs1048638, og 376del393 polymorfismer av
CA9
gen i forhold til villtype (WT) individer.
samspilleffekter mellom miljørisikofaktorer og genetisk polymorfisme av
CA9
er vist i tabell 3 og 4. Blant 598 røykere, fag med minst ett G allel av rs2071676, en G-allelet av rs3829078 , en A-allelet av rs1048638, eller en Del allel av
CA9
376 og betel-nut-chewing vane hadde respektive risikoene ved 23.90- (95% CI: 8.84-64.61), 14.25- (95% KI: 5,18 til 39,17), 16.80- (95% KI: 5,82 til 48,46), og 12,85 ganger (95% KI: 6,19 til 26,68) for å ha kreft i munnhulen. Personer med enten minst en G allel av rs2071676, en G allel av rs3829078, 1 Et allel av rs1048638, eller en del av allel
CA9
376 eller som tygges mutter hadde respektive risiko for 4.36- (95 % KI: 1,67 til 11,42), 15.18- (95% KI: 8,92 til 25,83), 10.65- (95% KI: 6,39 til 17,77), og 11,30 ganger (95% KI: 6,50 til 19,64) for å ha kreft i munnhulen i forhold til personer med WT homozygote som ikke tygge betelnøtter (Tabell 3).
Blant 444 betel-nøtt forbrukere i vår årsklasse, tobakksrøyking signifikant forhøyet munnkreftrisiko hos deltakerne polymorfe for rs2071676, rs1048638, og 376del393 polymorfismer av
CA9
, sammenlignet med personer med WT-genet som ikke røyker sigaretter (tabell 4). Dessuten, folk som enten var polymorfe for
CA9
i fire loci (201, 1081, 1584, og 376) eller som røykte var på en 4.13~22.71-fold risiko (
p
0,001) for å utvikle kreft i munnhulen, sammenlignet med personer med WT-genet som ikke røyker (tabell 4). Ovennevnte Resultatene tyder på at
CA9
genet polymorfismer utøve en sterk innflytelse på oral-kreft mottakelighet som tygger betel mutter og /eller røyker sigaretter.
Vi ytterligere utforsket haplotyper å evaluere kombinerte effekten av de 3 polymorfismer på oral-kreft mottakelighet. Distribusjons frekvensene til
CA9
rs2071676, rs3829078 og rs1048638 haplotyper i våre rekruttert personer ble analysert. Den vanligste haplotype i kontrollen var AAC (46,6%), og det ble derfor valgt som en referanse. Sammenlignet med referanse, en
CA9
haplotype, GAA, signifikant (
p
0,001) økte risikoen for OSCC av 5,27 ganger (95% KI: 1,13 til 24,55) (tabell 5).
for å undersøke effekten av polymorfe genotyper av
CA9
på kliniske status OSCC, klassifisert vi OSCC pasienter inn i 2 undergrupper. I den første undergruppen, pasienter hadde homozygot WT alleler; i den andre undergruppen hadde de i det minste en polymorfe allel. For de genotypiske frekvenser av SNPs, bare
CA9
rs2071676 viste en signifikant sammenheng med kliniske patologiske variabler i OSCC pasienter. Sammenlignet med WT genotype (A /A), pasienter med minst en polymorfe G allel av rs2071676 viste en høyere risiko (1,69 ganger; 95% KI: 1,00 til 2,84). For lymfeknutemetastase (tabell 6)
Diskusjoner
i forhold til kontrollgruppen, en høyere andel av oral-kreftpasienter brukes betel pund, tobakk eller alkohol (tabell 1). Dette funnet tyder på at disse 3 miljømessige kreftfremkallende kan være forbundet med risiko for kreft i munnhulen. Betel-pund og tobakk syntes å være spesielt sterkt assosiert med kreft i munnhulen, et funn som er sammenfallende med tidligere forskning [20]. Betel-pund tygging ble funnet å stimulere proteinnivået matriksmetalloproteinase (MMP) -9 i spyttet til friske mennesker [21]. Lime-piper betel quid kan også øke protein nivåer av c-fos og c-Jun proto-onkogener [22]. Forbruket av tobakk kan betydelig indusere ekspresjon av kjernefysisk hypoksi-induserbar faktor (HIF) -1α, som er en ugunstig prognostisk faktor i munnhulen [23]. Disse linjene av bevis tyder på at miljøkreftfremkallende eksponering er involvert i dannelsen eller patogenesen av munnhulekreft.
CA9 uttrykk er svært følsom for hypoksiske forhold [24]. Den avvikende ekspresjon av CA9 ble observert i kreftcellene i seg selv eller tumorassosierte stromale vev i OSCC pasienter og korreleres med en dårlig prognose og knutemetastase [17], [18], [25]. CA9 katalyserer den reversible hydratisering av karbondioksyd til karbonsyre. Dette fører til intracellulær alkalose og ekstracellulære acidose i svulsten mikromiljøet, noe som gjør det mulig for tumorer for å overleve under hypoksiske betingelser. Videre kan ekstracellulære acidose bidra til invasivitet og dårlig prognose av høy-stromal CA9-uttrykkende tumorer ved å aktivere ekstracellulære proteaser og forstyrre celleadhesjonsmolekyl funksjon [26] – [28]. CA9 reduserer E-cadherin-mediert celleadhesjon ved en konkurrerende interaksjon med beta-catenin [28]; Dette kan øke metastatisk fenotype og bidra til sammenhengen mellom høy stromal CA9 uttrykk og lymfe-metastaser. Således kan CA9 ekspresjon av tumorer indikerer tilstedeværelse av hypoksiske celler med mer aggressiv adferd og behandling motstand på grunn av hypoksi-indusert celleforandringer [29], [30].
Økende bevis indikerer at genomiske forandringer gradvis forandre den cellulære fenotype og kan føre celler til å utvikle seg fra en preneoplastiske scenen til kreft lettere [31]. Det ble rapportert at munnslimhinnen av individer med
murine dobbel minutt 2 (MDM2)
SNP 309 GG genotype er mer utsatt for miljøkreftfremkallende eksponering og resultater i et tidligere angrep av tumordannelse [32]. Jo lenger alleliske polymorfisme av GT dinucleotide i
heme oxygenase (HO) -1
promoter og funksjonell polymorfisme i
nukleær faktor kappa B1 (NFKB1)
promoter er begge knyttet til risikoen for betel-quid- eller røykerelaterte OSCC [5], [33]. Polymorfismer av flere gener ble identifisert som å være assosiert med risiko for munnhulekreft [34], [35]. Det er klart at genetiske komponenter spille sentrale roller i kreftutvikling. I vår studie,
CA9
genet SNPs (rs2071676, rs3829078, rs1048638, og 376del393) alene ikke bidrar til oral-kreft mottakelighet (tabell 2). Den synergistisk effekt av miljøfaktor (betel pund og røyking) og
CA9
genet polymorfismer på risikoen for kreft i munnhulen (tabell 3 og 4) er godt demonstrert. Betel-pund og tobakk karsinogener kan forbedre HIF-1α uttrykk, og deretter endre
CA9
promoter aktivitet og oppregulere CA9 uttrykk. Følgelig kan det oppregulere ekstracellulære proteaser eller nedregulere E-cadherin å fremme utvikling av kreft i munnhulen.
Det ble rapportert at høy uttrykk for CA9 var hyppigere med lymfe-metastaser i flere typer solide tumorer inkludert kreft i munnhulen [25], [36], [37]. I denne studien ble det en betydelig høyere fordeling frekvens av lymph-node metastase utstilt i OSCC pasienter med minst en polymorfe G allel av
CA9
201 sammenlignet med dem med WT genotype (tabell 6). Den 201 A /G polymorfisme er kjent for å forårsake en nonsynonymous substitusjon (valin til metionin), men uttrykket og funksjon av CA9 som er berørt av denne SNP er fortsatt ubekreftet. Selv om en studie av de Martino et al. viste at dette nonsynonymous SNP hadde ingen signifikant effekt på CA9 protein uttrykk [11], tror vi at størrelsen på utvalget i de Martino studie (
n
= 54) var for liten til å avgjøre om
CA9
201 SNP hatt en betydelig effekt på CA9 uttrykk og må bekreftes i større prospektive studier.
en rekke SNPs kan være stille, det vil si, med ingen direkte effekt på genprodukter. Imidlertid, på grunn av koblingsulikevekt (LD) som eksisterer tvers over det humane genom, de kan likevel anvendes som genetiske markører for å lokalisere tilstøtende funksjonsvarianter som bidrar til sykdom. Når hver SNP konstruksjonen av haplotypene har en sann bidrag til mottakelighet for sykdom, selv om unapparent kan haplotype analyser gi større statistisk styrke og er noen ganger fordelaktig sammenlignet analyse av enkelt SNP for detektering av en assosiasjon mellom alleler og sykdoms fenotype [38]. Vi analyserte bidrag av forskjellige haplotype kombinasjoner av 3
CA9
SNPs (rs2071676, rs3829078, og rs1048638) til risikoen for kreft i munnhulen og til slutt fant at
GAA
haplotype viste en høy risiko for OSCC (tabell 5). Det er mulig at
GAA
haplotype av
CA9
er i LD med andre funksjonelle polymorfismer som er ansvarlig for mottakelighet for OSCC.
Tolkninger av denne studien er begrenset fordi informasjon om visse oral-kreft risikofaktorer, som marihuana (cannabis) røyking, medisinske nikotinbruk, arvelighet, og familiære risiko, var ikke tilgjengelig for de rekruttert eksemplarer, og denne begrensningen kan begrense justering av disse muligens konfunderende faktorer. I denne studien, men de viktigste risikofaktorene for kreft i munnhulen, alkohol og tobakk og betel-pund tygging, ble justert for for å anslå effekten av genet polymorfismer på clinicopathological utvikling av OSCC. Noen indirekte justeringer, for eksempel for alder, kjønn og geografisk område, ble også brukt til å evaluere effekten av genet polymorfismer på kreft i munnhulen mellom friske kontrollpersoner og OSCC pasienter for å redusere muligheten for falske positive resultater. I en fremtidig studie, øker prøven (blod og tumorvev) tall og å ta flere OSCC risikofaktorer i betraktning ved analyse kan bekrefte nettopp disse funnene.
Som konklusjon, våre resultater antyder at gen-miljø interaksjoner mellom
CA9
polymorfismer og betel-pund tygde med røyking kan endre mottakelighet for oral-kreftutvikling.
GAA
haplotype av 3
CA-9
SNPs (rs2071676, rs3829078, og rs1048638) kombinert viste også en høy risiko tilknytning OSCC. Oral-kreftpasienter med
CA9
201 A /G polymorfisme har en høyere risiko for å få halsen lymph-node metastaser enn gjør WT bærere.
Materialer og metoder
fag og Prøvetaking
Vi rekrutterte 462 pasienter (444 menn og 18 kvinner, med en gjennomsnittsalder på 54,4 ± 11,4 år) på Chung Shan Medical University Hospital i Taichung, og Changhua Christian Hospital og Show Chwan Memorial Hospital i Changhua, Taiwan. Pasientene ble registrert som en sak gruppe i 2007-2010. Blant de 462 tilfellene tumorer ble plassert i munnslimhinnen (n = 189), tunge (n = 148), gingiva (n = 48), gane (n = 30), gulvet i munnen (n = 21), og andre (n = 26). I mellomtiden, kontroller ble inkludert fra den fysiske undersøkelsen i løpet av de tre sykehusene, som også fasiliteter som saker ble hentet fra. På slutten av rekruttering, ble til sammen 519 deltakere (425 menn og 94 kvinner, med en gjennomsnittsalder på 52,4 ± 14,7 år) som hadde verken selvrapportert historie av kreft for noen nettsteder inkludert. I tillegg ble pasienter med oral forstadier sykdom som oral submucous fibrose, leukoplaki, erythroplaki, verrucous hyperplasia, etc. ekskludert fra kontrollgruppen. Før oppstart av denne studien ble det vedtatt hentet fra Institutional Review Board of Show Chwan Memorial Hospital, og informert skriftlig samtykke til å delta i studien ble innhentet fra hver person.
For begge tilfeller og kontroller, brukte vi en spørreskjema for å få informasjon om pasientens eksponering for betel-pund tygging, tobakksbruk og alkoholforbruk. Medisinsk informasjon for sakene ble hentet fra deres journaler, og inkludert TNM klinisk staging, primær tumor størrelse, spredning til lymfeknuter, og histologisk grad. Oral-kreftpasienter ble klinisk iscenesatt ved diagnosetidspunktet i henhold til TNM staging system av amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) Staging Manual (7. utg.) [39]. Svulster er klassifisert som trinn I og trinn II (n = 213) og stadium III + stadium IV (n = 249). Metastaser til lymfeknuter ble påvist i 164 tilfeller (35,5%). Fullblodsprøver innsamlet fra kontroller og OSCC pasienter ble plassert i rør som inneholder ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA), umiddelbart sentrifugeres, og lagret ved -80 ° C.
Valg av CA9 Polymorfisme
I dbSNP database, har over 30 SNPs er dokumentert i 11 eksoner regionen i
CA9
genet, inkludert tre SNPs ligger i de kodende sekvensene av genet (eksoner 1, 7 og 11). For å få tilstrekkelig kraft for å vurdere potensialet foreningen, undersøkte vi rs2071676 (G201A i ekson 1), rs3829078 (A1018G i ekson 7) og rs1048638 (C1584A i 3’UTR), de med mindre allelfrekvensene ≥ 5%. Videre, en annen SNP av
CA9
genet (en 18-bp sletting /innsetting; 376 Del). Ble valgt i denne studien siden dette SNP ble funnet i kreftpasienter [11]
genomisk DNA Extraction
genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp QIAamp DNA blod mini-sett (Qiagen, Valencia, CA, USA) etter produsentens anvisninger. Vi oppløste DNA i TE-buffer (10 mM Tris og 1 mM EDTA; pH 7,8) og deretter kvantifisert ved å måle den i OD260. Den endelige forberedelser ble lagret ved -20 ° C og ble brukt til å fungere som maler for polymerase chain reaction (PCR).
Real-time PCR
Allelic diskriminering av
CA9
201 (rs2071676), 1081 (rs3829078) og +1584 (rs1048638) allele polymorfismer ble vurdert med en ABI StepOne ™ real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), og analysert med SDS vers. 3.0 programvare (Applied Biosystems) under anvendelse av TaqMan analysen. Videre ble 376del393 allele polymorfismer vurderes med PCR. Produktene ble separert på en 3% agarosegel og deretter farget med etidiumbromid. Primersekvensene og prober for analyse av
CA9
gen-polymorfismer er beskrevet i tabell 7. Sluttvolumet for hver reaksjon ble 5 ul, inneholdende 2,5 ul TaqMan genotyping Master Mix, 0,125 mL TaqMan probe blanding, og 10 ng genomisk DNA. I vår foreløpige studien har en slik reaksjonsblanding (5 mL) vist seg å gi identiske resultater til det av med et sluttvolum på 20 mL anbefalt i produsentens anvisninger. Den real-time PCR inkludert et innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 15 s og deretter ved 60 ° C i 1 min. For å validere resultatene fra real time PCR og PCR, ble rundt 10% av analysene gjentas og flere tilfeller av hver genotype ble bekreftet ved DNA sekvensanalyse.
Statistical Analysis
Forskjeller mellom de 2 gruppene ble betraktet som signifikant hvis
p
verdier var 0,05. Hardy-Weinberg likevekt (HWE) ble vurdert ved hjelp av en godhet-of-fit
Χ
2
-test for biallelic markører. Mann-Whitney
U
-test og Fishers eksakte test ble brukt for å sammenligne forskjeller i fordelingene av pasientens demografiske kjennetegn mellom kreft-fri (kontroll) og oral-kreft grupper. De justerte odds ratio (AORs) og 95% konfidensintervall (CIS) av sammenhengen mellom genotypefrekvensene og risiko pluss clinicopathological karakteristika ble beregnet ved hjelp av flere logistikk regresjonsmodeller, etter kontroll for andre kovariatene. Vi analyserte alle data med Statistiske Analytic System (SAS Institute, Cary, NC, USA) programvare (vers. 9.1, 2005) for Windows.
