Abstract
kunnskap om rollen som caveolin-en (Cav-1) protein på endotelet adhesjon av kreftceller er uklart. Denne studien viste at Cav-en spiller en negativ regulerende rolle på kreft-endotelet interaksjon. Endogen Cav-1 ble vist å ned-regulere under celle løsgjøring og nivået på et slikt protein er omvendt assosiert med tumor-endotel-adhesjon. Videre ektopisk overekspresjon av Cav-en svekket evne til kreftceller til å følge endotelet mens shRNA-mediert Cav-en knock-down utstilt motsatt effekt. Vi fant at cellen løsgjøring økt cellulær hydrogenperoksyd og hydroksylradikal generering og slike reaktive oksygenarter (ROS) var ansvarlige for å øke interaksjonen mellom kreftceller og endotelceller gjennom vaskulær endotelial celleadhesjonsmolekyl-1 (VCAM-1). Viktigere, Cav-1 ble vist å undertrykke hydrogenperoksyd og hydroksyl radikaler dannes ved å opprettholde nivået av aktiverte Akt som var avgjørende for rollen av Cav-en i å dempe celleadhesjon. Sammen med denne studien avslørte romanen rollen Cav-en og underliggende mekanisme på tumor adhesjon som forklarer og markere en viktig rolle Cav-en på lungekreft celle metastase
Citation. Chanvorachote P, Chunhacha P ( 2013) Caveolin-en Regulerer endotel Adhesjon av lungekreft celler via reaktive oksygenforbindelser avhengige mekanismen. PLoS ONE 8 (2): e57466. doi: 10,1371 /journal.pone.0057466
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan
mottatt: 18 oktober 2012; Godkjent: 21 januar 2013; Publisert: 27 februar 2013
Copyright: © 2013 Chanvorachote, Chunhacha. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet med tilskudd fra Thailand forskningsfond (P. Chanvorachote) og postdoktorstipend (Ratchadaphiseksompot Endowment Fund, Chulalongkorn University). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nylig roller caveolin-en (Cav-1) i regulering av kreft progresjon og metastasering i ulike typer kreft har blitt avslørt [1] – [4] og slikt protein kanskje fått mest oppmerksomhet i kreftrelatert forskning. Selv om noen studier antydet at Cav-1 kan spille en rolle ved inhibering av progresjon av kreft i visse kreft [5], i lungekreft, Cav-en forsterker kreft aggressivitet, så vel som metastase [6]. Sammen med det faktum at Cav-1 uttrykk i lungekreft ble vist å forholde seg til dårlig prognose [2], og det meste av kreftrelaterte dødsfall i denne kreften ble vist å knytte kontakter med metastaser, er det av stor interesse å undersøke hele regulerende rolle av dette proteinet på kreft metastase [7]. Metastase er en flertrinnsprosess av kreftceller sprer seg fra sine opprinnelige plasseringer til de fjerne sekundære områder. Starter med kreftcellen avløsning fra sin primære svulst cellene invadere vaskulær vegg, reise i sirkulasjonssystemet, og holder seg til endotelet å danne sekundære svulster. Selv om rollene til Cav-en på lungekreftcelle adferd har vært intensivt utforsket, er rollen av et slikt protein på lungekreft celle adhesjon til endotelet overflaten i stor grad ukjent. Vi og andre har foreslått den viktige rollen til Cav-1 i gjengivelsen av kreftceller som er resistente mot anoikis etter celle løsgjøring [6], [8], [9], [10], styrke invasjon og migrasjon [11], og legge til rette for vekst i krings-uavhengig måte, [12]. Endogen Cav-1-nivå som ble vist i de foregående studier for å bli styrt av de reaktive oksygenarter (ROS). I frittliggende celle tilstand, ble hydrogenperoksid vist seg å øke cellulært nivå av Cav-1 ved å hemme nedbrytning [6]. Mens i de heftende celler, hydroksyl radikal viste seg å være en sentral aktør i opp regulerende Cav-1 uttrykk og økt celle migrasjon [11]. Disse funnene fremhevet regulerende rolle ROS på Cav-1 uttrykk og deres følge roller på kreft metastasering.
I biologi, eksisterer negative tilbakemeldinger regelverk for å hindre overdreven stimulering. Likeledes ble Cav-1-proteinet er vist å undertrykke oksidativt stress forårsaket av hydrogenperoksyd eksponeringer [13]. Imidlertid er det fortsatt ukjent om Cav-1 regulerer ROS nivå i frittliggende celler og slik regulering er kritisk for kreft lim eiendom. Ved hjelp av farmakologiske og genetiske metoder, denne studien viste at Cav-en spiller en nøkkelrolle i hemming av kreft-endotelet heft ved å dempe hydrogenperoksid og hydroksyl radikal generasjoner etter celle løsrivelse. Denne studien fant også at Cav-en undertrykket slik ROS dannelse gjennom Akt avhengig mekanisme. Sammen med den observasjon at Cav-en redusert i en tidsavhengig måte etter celle løsrivelse, fant vi at i senere tid poeng, kreft-endotelet vedheft betydelig økt samtidig med at Cav-en utarming. Således vår undersøkelse avslørte eksistensen av en ny mekanisme for kreft celleadhesjon av Cav-en som kan bli utnyttet i metastaser og medikament utforming.
Materialer og metoder
Celler og reagenser
, ikke-liten celle lungekreft (NSCLC) -H460 og vaskulær endotel Humant (HUV-EC-C-celler) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). H460-celler ble dyrket i RPMI 1640 mens HUV-EC-C-celler ble dyrket i M199 medium. RPMI 1640 supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, og 100 enheter /ml penicillin /streptomycin. M199 ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 10 mM L-glutamin, og 100 enheter /ml penicillin /streptomycin, 0,1 mg /ml heparin, 0,05 mg /ml endotelial cellevekstsupplement (ECGS). Hele kulturen ble inkubert i en 5% CO
2 miljø ved 37 ° C. 2 «, 7»-dichlorofluorescein diacetat (DCFH
2-DA), Dimethysulfoxide (DMSO), caveolae isolasjonskit, Calcein AM, heparin natrium ble oppnådd fra Sigma Chemical, Inc. (St. Louis, MO); Kanin caveolin-1-antistoff og peroksidase-konjugert sekundært antistoff fra Abcam (Cambridge, MA); Hydrophenyl fluorescein (HPF), LY294002, Amplex Red, Lipofectamine 2000 var fra Invitrogen (Carlsbad, California); Antistoff for β-aktin fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA); Antistoff for pan-Akt, p473-Akt, PTEN, EGFR, Phospho-PTEN (Ser380 /Thr382 /383) var fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA); Endotelial cellevekst supplement var fra Millipore Corporation (Rica, MA)
Plasmid og Transfeksjon
Cav-1 uttrykk plasmid pEX_Cav-en og dens kontroll vektor.; pDS_XB-YFP ble ervervet fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) og Cav-en knockdown plasmid shRNA-Cav-en og dens kontroll vektor; kontroll shRNA plasmid A ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Stabile transfeksjoner av Cav-1 ekspresjonsplasmid eller Cav-1 knockdown plasmid ble dannet ved dyrkning av H460-celler i en 6-brønns plate inntil de nådde 60% konfluens. 15 pl av Lipofectamine-reagens og 2 ug av Cav-1, og shRNA-CAV-1-plasmid ble anvendt for å transfektere celler i fravær av serum. Etter 12 timer ble mediet erstattet med dyrkingsmedium inneholdende 5% føtalt bovint serum. Omtrent 36 timer etter begynnelsen av transfeksjon ble cellene spaltet med 0,03% trypsin, og cellesuspensjonen ble sådd ut på 75-ml kulturflasker og dyrket i 24 til 28 dager med G418 eller puromycin for seleksjon av Hcav-1 og shCav- 1, henholdsvis. De stabile transfektanter ble slått sammen og ekspresjon av Cav-1-proteinet i de transfektanter ble bekreftet ved western-blotting. Cellene ble dyrket i antibiotisk RPMI 1640 medium i minst to passeringer før anvendt i hvert eksperiment.
ROS Detection
Intracellulær ROS ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av DCFH
2-DA som en fluorescerende probe. I korthet ble cellene inkubert med 10 pM DCFH-DA, HPF i 30 minutter ved 37 ° C, hvoretter de ble vasket, trypsinert, resuspendert i fosfatbufret saltvann, og umiddelbart analysert med hensyn til fluorescensintensitet ved FACScan-strømningscytometer (Beckton Dickinson, Rutherford, New Jersey) ved hjelp av en 488-nm eksitasjon bjelke og en 538-nm band-pass filter. Median fluorescens intensitet ble kvantifisert ved Cellquest-programvare (Becton Dickinson) analyse av de registrerte histogrammer.
H
2o ble bestemt
2 av Amplex Red reagens (Invitrogen). I korthet, ble reaksjonsblandingen inneholdende 50 uM Amplex Red reagens, og 0,1 U /ml HRP i Krebs-Ringer-fosfat (KRPG) tilsatt til hver mikroplate brønnen. Deretter ble 20 pl av 1,5 x 10
4 H460-celler suspendert i KRPG ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Etter 30 min inkubering, fluorescens signal som oppnås fra den fluorescens mikroplateavleser utstyrt for eksitering i området 530-560 nm og emisjon påvisning ved 590 nm ble overvåket og målt over 3 timer etter løsgjøring.
Monolayer celleadhesjonsanalyse
HUV-EC-C ble stimulert med 10 ng /ml IL-en
β
for 0-4 timer. H460-celler (2,5 x 10
4 celler /ml) ble merket med 15 uM av calcein AM (Sigma) i 45 minutter ved 37 ° C og 5% CO
2, og deretter lagt på en semi-konfluente monolagskultur av HUV-EC-C, inkubert i 20 minutter ved 37 ° C med rotasjon ved 120 opm, og vasket grundig for å utelukke ikke-spesifikk cellebinding. Antallet festede celler ble tellet direkte under et fluorescens mikroskop som rapportert tidligere [14]. For antistoff-mediert blokkering av celleadhesjon, var IL-1β stimulert HUV-EC-C-inkubert med antistoff mot VCAM-1, ICAM-1 og E-selektin (ved en endelig fortynning på 1:400 for hvert antistoff) for tre h ved 37 ° C i fuktet CO2-inkubator, og deretter H460-celler ble tilsatt.
Caveolae isolering
Caveolae ble isolert fra shCav-1, H460 og Hcav-1-celler ved hjelp av en caveolae isolasjon kit (Sigma). ShCav-1, H460 og Hcav-1-celler ble oppsamlet og lysert med lyseringsbuffer inneholdende 1% Triton X-100. Lysatene ble sentrifugert ved 10 000
g
i 15 min. Detergent-resistente membranfraksjoner ble isolert på OptiPrep Density Gradient Medium (0, 20, 25, 30, og 35%). Caveolae ble samlet inn fra caveolin-en-beriket fraksjoner, som har vært brukt i etterforskningen av Cav-en og PTEN uttrykk.
Western blotting
Etter spesifikke behandlinger ble cellene inkubert i lyseringsbuffer inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1% Triton X-100, 150 mM natriumklorid, 10% glycerol, 1 mM natriumortovanadat, 50 mM natriumfluorid, 100 mM fenylmetylsulfonylfluorid, og en kommersiell protease inhibitor cocktail (Roche molekylære Biochemicals) i 30 minutter på is. Cellelysater ble oppsamlet og bestemt for proteininnhold ved anvendelse av Bradford fremgangsmåten (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Lik mengde av proteinene av hver prøve (40 mikrogram) ble denaturert ved oppvarming ved 95 ° C i 5 minutter med Laemmli lastebuffer, og deretter lastet på 10% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese. Etter separering ble proteinene overført på 0,45 um nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). De overførte Membranene ble blokkert i 1 time i 5% fettfri tørrmelk i TBST (25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 0,05% Tween 20) og inkubert med de passende primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Membranene ble vasket to ganger med TBST i 10 min, og inkubert med pepperrotperoksydase-koplede isotype-spesifikke sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. De immunkomplekser ble oppdaget av forbedret med chemiluminescence underlaget. (Supersignal West Pico, Pierce) og kvantifisert ved hjelp av analytiker /PC densitometry programvare (Bio-Rad)
Statistical Analysis
Mean data fra uavhengige eksperimenter ble normalisert for å resultere fra celler i kontrollen. Alle forsøkene ble gjentatt minst tre ganger. En statistisk analyse mellom to grupper ble verifisert ved Students t test, i forhold til flere grupper, ble det gjennomført en analyse av variant (ANOVA) med post hoc test. Styrken i relasjoner, korrelasjonskoeffisient (
r
), mellom hvert protein nivå etter løsrivelse ble bestemt med SPSS versjon 16 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). En P-verdi på mindre enn 0,05 ville bli betraktet som statistisk signifikant.
Resultater
Caveolin-en Nedbryting etter Cell Detachment Forbedrer Tumor-endothelial celle adhesjon
Cav-en ble vist å assosiere med metastatiske potensialer av lungekreftceller [6], [12], mens dens rolle på kreftcelle vedheft er fortsatt uklart. For å studere rollen til Cav-1-proteinet på kreft celleadhesjon, vi først frittliggende kreftcellene for å etterligne den tidlige trinn av metastaser, og evaluert ekspresjonsprofilen av Cav-1 etter løsgjøring celle over tid. Lungekreft H460-celler dyrket i ultralav festeplatene ble analysert for CAV-1-protein-ekspresjon ved Western-blotting ved angitte tidspunkter. Figur 1A viser at etter løsgjøring celle, Cav-en gradvis ble redusert på en tidsavhengig måte og signifikant reduksjon ble påvist så tidlig som 6 timer etter celle løsgjøring. Deretter ble de suspenderte celler ved sammenfallende tidspunkter utsettes for den monolaget celleadhesjon analyse som beskrevet i
Materialer og metoder
. Figurene 1A og B viser at etter løsgjøring celle, Cav-1-ekspresjonen gradvis redusert over tid samtidig med økningen av kreft celleadhesjon på endoteliale overflatene, noe som antyder den potensielle rollen til Cav-1 i kreft klebemiddel regulering. Vi støttet ytterligere en slik sammenheng, ved å generere en korrelasjon mellom plott Cav-1-ekspresjonen og kreft celleadhesjon (fig. 1 C). Ikke bare gjorde reduksjon av disse proteinene korrelerer godt med forbedret evne til kreftceller til å følge på endotel flater, men plottet også avdekket et høyt korrelert profil med korrelasjonskoeffisient på 0,922
A.:
H460-celler ble suspendert i poly-HEMA-belagte plater for forskjellige tider (0-12 h) og Cav-1-ekspresjon ble analysert ved western blotting. Kolonner er midler ± SD (
n =
5). *
P
0,05 vs.
tid 0. B:
Enebolig H460 celler ble utsatt for en monokultur av HUV-EC-C. Interaksjonen av H460 og HUV-EC-C-celler ble undersøkt i nærvær av IL-1
β plakater (10 ng /ml). Fase kontrast mikroskopiske bilder av representative eksperimenter er vist.
C:
korrelasjonsanalyse av mobilnettet Cav-1 nivå versus H460-HUV-EC-C adhesjon (
n
= 5).
D:
Cav-1 overexpressed Hcav-1 eller kort hårnål Cav-1-transfekterte shCav-1-celler ble konstruert og analysert for CAV-1-ekspresjon ved Western blotting. Blottene ble probet på nytt med β-actin-antistoff for å bekrefte lik lasting av prøver. Immunoavtrykket signaler ble kvantifisert ved densitometri, og midlere data fra uavhengige eksperimenter ble normalisert til resultatene. Kolonner er midler ± SD (
n =
3), *
P
0,05 vs. H460 celler.
E:
Hcav-1, H460, og shCav-1 celler ble frittliggende i 3 timer og lagt inn en kultur for HUV-EC-C. Kolonner er midler ± SD (
n =
3), *
P
. 0,05 vs. H460 celler
For å bekrefte at Cav-en demper kreft celle adhesjon til endotelceller, utforsket vi effekten av ulike ektopisk Cav-1 ekspresjonsnivåene for H460-celler adhesjon til endotel. Vi etablerte Cav-en overekspresjon (Hcav-1) celler, short-hårnål (sh) -mediert Cav-en knockdown (shCav-1) celler ved stabil transfeksjon. De transfektant kloner ble analysert for CAV-1-ekspresjonen sammenlignet med foreldre H460-celler ved western blotting (fig. 1D). Det er bemerkelsesverdig at kontroll transfekterte celler ble generert fra kontroll plasmider, pDS_XB-YFP og kontroll shRNA plasmid A, ble også evaluert for CAV-1-ekspresjon, men; nivået av proteinet var sammenlignbar med den for H460-celler (data ikke vist). CAV-1 overuttrykt, CAV-1 knockdown, og H460-celler ble løsnet og utsatt for endotelial adhesjonsassayet og kreftcellene fester seg på HUV-EC-C-endotelceller ble observert. Som forventet, analyse av celleadhesjon viste at Cav-1 overuttrykt celler oppviste den laveste evne til å feste til de HUV-EC-C-celler, mens den shCav-1-celler hadde den høyeste evne. Også, vektor transfekterte celler ble likeledes undersøkt for klebeevne og vi fant ingen signifikant endring i forhold til det av parentale celler (data ikke vist). Dette indikerer at Cav-1 regulerer negativt kreftcelle vedheft til vaskulærendotelet.
Caveolin-en Undertrykker Hydrogenperoksid og hydroksylradikalet Generasjon etter Cell Detachment
Vår tidligere studie har vist at i holdt tilstand , Cav-1-funksjonen i dempning av oksidativt stress forårsaket av hydrogenperoksyd-behandling [13]. Derfor er det mulig at Cav-1-proteinet kan virke til å regulere redox-status av kreftceller under metastase. For å studere effekten av Cav-1-proteinet på løsgjøring-indusert ROS generasjon, Cav-1 overexpressed (Hcav-1), ble Cav-1 knock-down (shCav-1), og kontrollceller (H460) frittliggende og inkubert i adhesjon -resistente plater inntil bestemte tidspunkter. De suspenderte celler ble så analysert for intracellulære ROS-nivåer ved hjelp av strømningscytometri DCFH
2-DA som en fluorescerende probe. Figur 2A viser at celle løsgjøring induserte en økning i celle ROS i en tidsavhengig måte som i flukt med vår tidligere rapport [6]. Denne studien viste for første gang at Cav-en fungerte i dempe løsrivelse indusert ROS i disse cellene. ShCav-1 celler som innehar den laveste Cav-1 uttrykk ble vist å utvise den høyeste ROS induksjon og slikt induksjons kan oppdages så tidlig som en time etter løsrivelse (Fig. 2A), mens mobilnettet ROS i Cav-en overexpressed (Hcav- 1)-celler ble ikke forandret som respons på celle løsgjøring
A:.
Cellular ROS nivå av frittliggende H460, shCav-1, og Hcav-1-celler ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri H
2DCF-dA som en fluorescerende probe. Kolonner er midler ± SD (
n =
3), *
P
0,05 vs.
tid 0. B:
H460, shCav-en, og Hcav- 1-cellene ble behandlet med Mn (III) tetrakis (4-benzosyre) porfyrin klorid (MnTBAP, 50 uM), Catalase (Katt, 7500 U /ml), natrium-formiat (NaF, 2,5 mM), eller Deferoxamine (DFO, 1 mM). Den intracellulære ROS nivå av disse celler, ble bestemt ved H
2DCF-DA probe. Kolonner er midler ± SD (
n =
5), *
P
0,05 vs. festet kontroll (
tiden 0
), og #
P
0,05 vs. ikke-behandlet kontroll på tilsvarende tid.
C:
Hydrogenperoksid nivået av cellene ble bestemt ved mikroplateleser hjelp Amplex Red. Kolonner er midler ± SD (
n =
3), *
P
0,05 vs. kontrollceller på
tids 0. D:
hydroksylradikalet induksjon ble bestemt av HPF. Kolonner er midler ± SD (
n =
3), *
P
0,05 vs. kontrollceller på
tid 0.
Videre kan de spesifikke ROS-inhibitorer ble anvendt for å bedømme spesifikk ROS som var oppregulert i disse celler. CAV-1 overuttrykt, CAV-1 slå ned, og H460-celler ble forbehandlet med spesifikke ROS-inhibitorer som var MnTBAP (en superoksid anion-inhibitor), katalase (en hydrogenperoksyd-inhibitor), deferoksamin (et hydroksyl-radikal-inhibitor), og natrium-formiat ( en hydroksyl-radikaler), og ROS-nivåer etter løsgjøring i 0-3 timer ble bestemt. Figur 2B viser at behandling med katalase, natriumformiat, og deferoksamin kunne blokkere induksjonen av ROS i disse cellene, noe som tyder på at hydrogenperoksyd og hydroksylradikal som primært er bestemt ROS oppregulert etter celle løsgjøring.
Effekten av CAV-1 på hydrogenperoksyd og hydroksylradikal produsert av disse cellene ble deretter evaluert. Amplex rød, en spesifikk påvisning sonde for hydrogenperoksyd, og HPF, en spesifikk påvisning sonde for hydroksylradikalet, ble anvendt for å bestemme en slik spesifikk ROS i de frigjorte celler. Figurene 2C og D viser at celle løsgjøring øket signalene hydrogenperoksyd og hydroksyl-radikal-spesifikke prober i en tidsavhengig måte. Viktigere, signalet fra enten hydrogenperoksyd eller hydroksylradikal var knapt synlig i Cav-1 overuttrykt celler, mens slike ROS-signaler ble forsterket i cellene som uttrykker et lavt nivå av Cav-1. Resultatene indikerte at Cav-en svekket hydrogenperoksid og hydroksyl radikal generasjoner i suspendert lungekreftceller.
Hydrogenperoksid og hydroksylradikalet Regulering Cancer Cell Adhesjon til endotelceller via VCAM-1-avhengige Mechanism
ROS ble vist i mange studier for å spille en sentral rolle i reguleringen av kreft celle atferd [11]. Sammen med den ovennevnte funn indikerer at Cav-en svekket hydrogenperoksyd og hydroksylradikal formasjonene under celle løsgjøring, undersøkte vi hvorvidt hydrogenperoksyd og hydroksylradikal spille en rolle i regulering av kreft celleadhesjon. Lungecancerceller ble inkubert med forskjellige kjente spesifikk ROS modulerende midler som er beskrevet, og cellene ble underkastet klebetester. Figur 3A viser at behandling av cellene med en superoksid-inhibitor MnTBAP hadde bare en minimal og ubetydelig virkning på kreftcelle klebemiddel-aktivitet, mens tilsetningen av katalase, deferoksamin, og natriumformiat i betydelig grad hemmet adhesjonen av H460-celler til endotel overflate. Disse resultatene antydet at hydrogenperoksid og hydroksyl radikal, men ikke superoksid anion er ROS at forsterke klebeevne av disse kreftcellene til vaskulære endotelceller
A:.
H460 celler ble ubehandlet eller forbehandlet med Mn (III) tetrakis (4-benzosyre) porfyrin klorid (MnTBAP, 50 uM), Catalase (Katt, 7500 U /ml), natrium-formiat (NaF, 2,5 mM), eller Deferoxamine (DFO, 1 mM) og deretter frittliggende i 3 timer før adhesjonsanalysen. Kolonner er midler ± SD (
n =
3), *
P
0,05 vs. ikke-behandlet kontroll.
B:
H460-celler ble behandlet med 100 uM H
2o
2 eller 100 uM H
2o
2 og 50 uM FeSO
4 og underkastes den HUV- EC-C-overflate som er blokkert av VCAM-1, ICAM-1 eller E-selektin antistoffer. Fase kontrast mikroskopiske bilder av representative eksperimenter er vist. Kolonner er midler ± SD (
n =
3), *
P
. 0,05 vs. ikke-behandlet kontroll
Bevis har antydet at endotelceller adhesjonsmolekyler (ECAMer) spiller en viktig rolle i kreft-endotelial celle-interaksjon [15]. Aktivering av endotelceller med IL-1
β
indusert ekspresjon av ECAMer nemlig VCAM-1, ICAM-1 og E-selektin på endotelcelle-overflaten, og disse proteinene lettes bindingen av kreftceller [15]. For å bekrefte rollen av hydrogenperoksyd og hydroksylradikal på kreft-endotelial celleinteraksjon og for å definere de berørte adhesjonsmolekyler, blokkert vi de endoteliale overflatene med spesifikke antistoffer mot VCAM-1, ICAM-1 og E-selektin, forut for kreftcelle adhesjon . Også, kreftcellene ble behandlet med eksogen hydrogenperoksyd i fravær eller nærvær av ferrosulfat for å bekrefte rollen av hydrogenperoksyd og hydroksylradikal, respektivt.
Figur 3B viser at hydrogenperoksyd og hydroksylradikal betydelig forbedret cancer celle adhesjon til endotelceller, noe som bekrefter rollen til nevnte ROS på kreft celleadhesjon. Interessant nok kan blokkere endotel med VCAM-1-antistoffer oppheve virkningen av hydrogenperoksyd og ferrosulfat på den klebende egenskap av disse kreftceller, mens antistoffer mot ICAM-1 og E-selektin hadde ingen signifikante effekter. Disse resultatene indikerte at hydrogenperoksyd og hydroksylradikal kan, i det minste delvis, regulere interaksjonen av kreftcellene til endotele overflaten gjennom VCAM-1-avhengig mekanisme. Dessuten kan Cav-en redusere limet eiendom av kreftceller ved å dempe hydrogenperoksid og hydroksyl radikal.
Cav-en undertrykker ROS Generasjon etter Cell Detachment gjennom PI3K /Akt Pathway
Etter å ha vist at Cav-1 svekkede kreft evne til å feste til en endotelium ved å redusere cellulær hydrogenperoksyd og hydroksyl-radikal-up-forskrifter, og bevis indikerte at Cav-1 regulerer flere celle oppførsel under celle løsgjøring gjennom PI3K /Akt sti [11]. For å bekrefte rollen Cav-en på Akt signal videre, overvåket vi Akt aktivisering i form av fosforylert (serin 473) Akt. Etter avtale med tidligere funn [16], fant vi økt nivå av Akt aktivering i Hcav-1 celler i forhold til at av H460 og shCav-1 celler (fig. 4A). Dessuten har vi funnet at celle løsgjøring betydelig redusert nivå av aktiverte Akt i nesten alle celler. Mens fosforylert (serin 473) Akt i shCav-1 celler funnet å være mest berørt av en slik celle løsrivelse, nivået av aktivert Akt i Hcav-en var knapt endret (fig. 4A).
A:
H460, shCav-1, og Hcav-1-celler ble løsnet og suspendert i poly-HEMA-belagte plater i 0-3 timer. p473-Akt og pan-Akt nivået i disse cellene ble bestemt av antistoffer som er spesifikke for p473-Akt og pan-Akt. Kolonner er midler ± SD (
n =
3), *
P
0,05 vs. H460 celler på
tiden 0
,
#P
0,05 vs. tilsvarende kontrollceller på
tiden 0
.
B:
Lysate av H460, shCav-en, og Hcav-1 celler ble brukt for etterforskningen av PTEN, fosfor-PTEN (Ser380 /Thr382 /383) uttrykk. Caveolae mikrosomal fraksjon (M) ble fremstilt som beskrevet i materialer og fremgangsmåter og anvendt for undersøkelse av PTEN (M). EGFR ble anvendt som en markør for den caveolae fraksjon. Kolonner er midler ± SD (n = 3), *
P
0,05 vs. H460 celler.
C:
H460-celler ble etterlatt ubehandlet eller forbehandlet i 2 timer med 10 og 50 uM LY294002 da cellene ble løsnet i 3 timer og analysert for p473-Akt og Akt nivåer. Kolonner er midler ± SD (
n =
3), *
P
0,05 vs. ikke-behandlet kontroll.
D:
H460 celler ble behandlet med LY294002 og bestemt for ROS, hydroksyl radikal, og hydrogen peroxide produksjon av DCFH 2-DA, HPF, Amplex Red henholdsvis
. Kolonner er midler ± SD (
n =
4), *
P
0,05 vs. ikke-behandlet kontroll på
tiden 0
, #
P
0,05 vs. ikke-behandlet kontroll på
3 timer. E:
ShCav-1 og Hcav-1 celler ble behandlet med LY294002 og analyser for cellulær ROS hjelp DCFH
2-DA. Kolonner er midler ± SD (
n =
3), *
P
. 0,05 vs. ikke-behandlet kontroll
Siden fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom ti (PTEN) er en stor negativ regulator av PI3K /Akt signalveien, også utførte vi forsøket å belyse rollen til Cav-en på PTEN. Våre resultater viste at PTEN var oppregulert i det cytoplasmatiske del (C), men nedregulert i caveolae mikrosomale fraksjon (M) i Cav-1 overexpressed (Hcav-1) celler sammenlignet med de av H460-celler (Fig. 4B ). I motsetning til dette, Cav-1-knock down-celler utviste de motstående profiler, noe som tyder på at Cav-en regulert compartmentalization av PTEN. For å vurdere aktiviteten av PTEN, Western blot analyse av det C-terminale fosforylert PTEN ved Ser380, Thr382, Thr383 og som fremmer PTEN stabilitet, men avta PTEN aktiviteter [17], ble utført. Figur 4B viser at aktiverte PTEN ble betydelig redusert i Hcav-1 celler med observasjonene at det fosforylert PTEN (på Ser380, Thr382, og Thr383) ble betydelig økt. Sammen med det funn tyder på at fosforylering av et slikt protein i ShCav-1-celler ble redusert, ble Cav-1 demonstrert i nærvær studien som negativt regulert aktivert status av PTEN, og en slik regulering kan, i det minste delvis, vedvarende nivået fosforylert Akt.
for å teste om endring i fosforylert Akt påvirker celle oksidativt stress, en PI3K inhibitor LY294002 ble brukt til å undertrykke Akt aktivering. H460-celler ble inkubert med PI3K-inhibitor LY294002 ved konsentrasjoner på 10 og 50 uM, og Akt og fosforylert Akt-nivåer ble bestemt ved Western-blotting (fig. 4C). LY294002 10 og 50 uM var i stand til å redusere p473-Akt (fig. 4C). Effekten av LY294002 på ROS indusert av cellen avløsning ble overvåket av DCFH
2-DA, HPF og Amplex rødt. Tilsynelatende PI3K inhibitor var i stand til å øke cellulært oksidativt stress som antydet ved den betydelige økningen av DCF fluorescenssignal. Videre er den spesifikke ROS, nemlig hydroksylradikal og hydrogenperoksyd, ble funnet å være signifikant øket i respons til behandlingen av PI3K inhibitor i H460-celler (fig. 4D).
Interessant, behandling av LY294002 ved 10 og 50 uM kunne reversere effekten av Cav-1 undertrykke ROS reduksjon i Hcav-1-celler. Figur 4E viser at ROS-signal i Hcav-1-celler behandlet med LY294002 ble merkbart øket, sammenlignet med ikke-behandlede Hcav-1-celler. I motsetning til dette ble ROS nivå i shCav-1-celler knapt påvirket av behandling av LY294002. Samlet utgjør disse funnene antydet at Cav-1 regulerer ROS dannelse etter celle avløsning ved å opprettholde aktivering av PI3K /Akt sti.
Diskusjoner
Så langt, en rekke kreftrelaterte proteiner har blitt identifisert og brukes til bestemte programmer, inkludert biomarkører for tidlig deteksjon, prognose og molekylære mål for anti-kreft utforming [18]. I henhold til den allment akseptert hypotese at ikke alle primære tumorer er i stand til å holde fast på de endoteliale overflatene, men visse kreftceller som besitter en iboende eller adaptiv evne er i stand til å følge på overflaten av vaskulære endotelceller og til å danne metastaser [19]. Mange regulatoriske proteiner ble identifisert som tumor suppressor eller svulst promoter proteiner; imidlertid, i tilfelle av Cav-1, ble begge funksjoner rapportert. CAV-1 ble først beskrevet som et tumor suppressor protein siden nedregulering av CAV-1 ble funnet i løpet av celletransformasjon [7]. I kontrast, ble Cav-en vist å forsterke kreft progresjon og økende bevis har signalisert sin rolle som en kreft promoter [20]. CAV-1 ble vist å fungere som en viktig mediator for flere pro-overlevelsessignalveier [21] – [23]. I tillegg ble Cav-1-ekspresjonen vist seg å øke i flere typer humane cancere, inkludert lunge, bryst, prostata og bukspyttkjertel cancer, og dette oppregulering var assosiert med en høy grad av metastase [20], [24] – [28]. Selv om Cav-1 ble vist å forsterke lungekreft metastase ved å forbedre anoikis motstand [9] og invasjon og migrasjon [11] Den foreliggende studien gitt den hemmende effekten av Cav-1 på kreft-endotel adhesjon som ikke er vist. <
