Abstract
Mer enn 90% av kreftdødsfall skyldes kreft som har spredning. Derfor er det viktig å intensivere forskning på metastasedannelse og terapi. Her beskriver vi for første gang den metastaserende evne av den humane livmorhalskreft cellelinje C33A i atymiske nakne mus etter subkutan implantasjon av tumorceller. I denne modellen, demonstrerte vi en jevn progresjon av lumbar og renal lymfeknutemetastaser i løpet av tumorutvikling. Foruten overveiende forekommende lymfatisk metastaser, visualisert vi dannelsen av hematogene metastaser benytter rød fluorescerende protein (RFP) uttrykker C33A-RFP celler. RFP positive cancerceller ble funnet å migrere i blodkar og å danne mikrometastaser i lungene av tumor-bærende mus. Deretter setter vi ut for å analysere påvirkning av onkolytiske virotherapy i C33A-RFP-modell og viste en effektiv virus-mediert reduksjon av tumorstørrelse og metastatisk byrde. Disse resultatene tyder på C33A-RFP livmorhalskreft modellen som en ny plattform å analysere kreftmetastaser, samt å teste nye behandlingsalternativer for å bekjempe metastaser
Citation. Donat U, Rother J, Schäfer S, Hess M, Hartl B, Kober C, et al. (2014) Karakterisering av metastaser Dannelse og Virotherapy i Human C33A livmorhalskreft Model. PLoS ONE 9 (6): e98533. doi: 10,1371 /journal.pone.0098533
Redaktør: Hiroshi Miyazaki, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 06.09.2013; Godkjent: 05.05.2014; Publisert: 02.06.2014
Copyright: © 2014 Donat et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskning og utvikling Avdeling for Genelux Corporation, San Diego, USA, og en service Grant til Universitetet i Würzburg, Tyskland finansiert av Genelux Corp. UD og SW mottatt postdoktorstipend. JR, CK, SS, og MH fikk en utdannet fellesskap fra Genelux Corporation tildelt Universitetet i Würzburg. AAS, JS, NGC, og RJA er lønnede ansatte i Genelux Corporation og har økonomiske interesser i Genelux Corporation. BH er en lønnet ansatt i Genelux GmbH. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Dette arbeidet ble støttet av forskning og utvikling Avdeling for Genelux Corporation, San Diego, USA, og en service Grant til Universitetet i Würzburg, Tyskland finansiert av Genelux Corp. UD og SW mottatt postdoktorstipend. JR, CK, SS og MH mottatt utdannet fellesskap fra Genelux Corporation tildelt Universitetet i Würzburg. AAS, JS, NGC og RJA er lønnede ansatte i Genelux Corporation og har økonomiske interesser i Genelux Corporation. BH er en lønnet ansatt i Genelux GmbH. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. I tillegg til alle konkurrerende interesser som er angitt før forfatterne legger til at de ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
metastatisk spredning av svulster er en flertrinnsprosess hvorunder ondartede celler sprer fra den primære tumor til fjerntliggende organer [1]. Tumorceller vandrer via to hovedveier: Den lymfesystemet og blodsirkulasjonen. Under lymfatisk metastasering, et fellestrekk for de fleste karsinomer, kreftceller forlate den opprinnelige svulsten nettstedet og migrere etter oppgjør i regionale lymfeknuter til fjerne seg [2]. Diagnostisering av lymfeknutemetastaser er av stor betydning. Selv om metastaser lymfeknute selv er sjelden livstruende de angir statusen for tumorprogresjon [3]. De fleste kreftdødsfall skyldes utvikling av metastaser. Derfor er det nødvendig med en bredere forståelse av biologi metastaser. Tre store plattformer er i dag brukes til å utvikle
in vivo
metastasemodeller. Disse innbefatter kjemisk induksjon, hvorved kreftfremkallende blir administrert for å indusere tumorgenese og metastase, syngene og xenograft transplantasjonsmodeller hvor transplantasjon av tumorceller /vev inn i muse-verter og genetisk konstruerte musemodeller [4] – [5]. Her jobber vi med en xenogene spontan transplantasjon modell for metastasering. Et antall xenogene metastasemodeller har blitt generert i løpet av de siste årene, for eksempel, for prostata [6] – [8], kolorektal [9] – [10], bryst [11] – [12], gastrisk [13] – [14] eller nyrecelle [15] karsinomer. I tillegg er det også noen modeller av human papillomavirus (HPV) positiv livmorhalskreft beskrevet [16] – [18]
I løpet av en livmorhalskreft screeningundersøkelse (HPV-positive og HPV-negative cellelinjer) for. onkolytisk virotherapy effektene av onkolytiske vacciniavirus GLV-1h68 på følgende cellelinjer ble analysert. Resultatene tyder på at tilstedeværelsen og kopiantallet av HPV DNA i livmorhalskreftceller ikke har en innvirkning på den terapeutiske effekten av GLV-1h68 (tabell S1). Videre oppdaget vi dannelsen av lymfeknutemetastaser etter subkutan implantasjon av C33A HPV-negative menneskelige livmorhalskreftceller hos immunsupprimerte mus. Derfor, i denne studie fokuserte vi på karakteriseringen av metastasering evne til denne cellelinje, som ikke er blitt beskrevet i litteraturen hittil. Vi analyserte lymfesystemet og hematogenous spredning av C33A-RFP celler i hårløse mus etter subkutan implantasjon av tumorceller, der lymfatisk sirkulasjon representert den viktigste ruten for metastasetumorceller. Dessuten ble en jevn progresjon av lymfeknutemetastaser i korrelasjon med tumorvekst demonstrert.
I tillegg, analyserte vi onkolytisk virotherapy av C33A tumorer og metastaser som en ny behandling alternativ. Onkolytiske virus er i stand til selektivt å replikere i kreftceller, noe som resulterer i destruksjon av tumorvev, men etterlater friskt vev uskadd [19]. Her har vi fokusert på å studere effekten av de tidligere beskrevne svekket, rekombinant vacciniavirus GLV-1h68 [20] – [21]. Den terapeutiske effekt av dette viruset på primære tumorer har blitt vist i mange karsinomer så som bryst, pankreatisk eller prostatakreft [21] – [23]. Videre har vi nylig viste et terapeutisk potensial i GLV-1h68 i behandling av lymfesystemet og hematogene metastaser som stammer fra den humane prostata carcinoma cellelinje PC-3 [22], noe som indikerer at GLV-1h68 kan være i stand til å utrydde metastaser i C33A-modellen som godt. Ja, her viste vi en drastisk virus-mediert reduksjon av C33A-RFP tumorer og deres metastatisk byrde.
Materialer og metoder
Cellelinjer
HPV-negative menneskelige livmorhals cancercellelinje C33A ble dyrket i DMEM høy glukose (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland) supplert med 10% FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland) og 1% gentamicin oppløsning (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland). Den C33A cellelinjen ble vennlig levert av Frank Stubenrauch, PhD (UKT, Universitetet i Tübingen, [24]). Ektheten av C33A celler ble bekreftet av DSMZ GmbH (Leibniz Institute DSMZ-tysk Innsamling av mikroorganismer og cellekulturer, Braunschweig, Tyskland). C33A-RFP-celler ble dyrket under samme betingelser med unntak av tilsetning av 5 ug /ml blasticidin. Humane epitelceller nyreceller (293ft) ble oppnådd fra Invitrogen GmbH (Karlsruhe, Tyskland) og dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FCS og 2 mM L-glutamin (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland).
generasjon C33A-RFP-celler
cDNA-sekvensen av det røde fluorescerende protein (
mRFP1
) ble innsatt i C33A cellegenomet ved hjelp av Vira strøm Lentiviral Expression System Kit (Invitrogen GmbH, Tyskland) i henhold produsentens instruksjoner.
mRFP1
kodende plasmid PCR TK-SEL-mRFP ble gitt av Q. Zhang (Genelux Corporation, San Diego) og brukes til å generere
mRFP1-
inneholder lentiviral vektorer som beskrevet tidligere [25]. Replication-inhabil
mRFP1
kodende lentiviruses ble produsert i 293ft celler ved co-transfeksjon av plasmidene pLP1, pLP2, PLP /VSVG som leverer lentiviral strukturelle og replikering proteiner og pLENTI6 /V5-MÅL-mRFP uttrykk plasmid bruker Lipofectamine ™ 2000. Etter transduksjon av C33A celler med mRFP-koding lentiviruses og blasticidin (5 mikrogram /ml) valg, en stabil RFP uttrykker C33A klonen ble valgt.
Virus belastning
svekket vaccinia virusstamme GLV- 1h68 ble tidligere beskrevet av Zhang
et al
. [21]. Tre ekspresjonskassetter som koder for
Renilla
luciferase-GFP fusjonsprotein, β-galaktosidase, eller β-glucuronidase ble rekombinert inn i
F14.5L
,
J2R Hotell og
A56R
loci, henholdsvis av foreldre LIVP virus genomet.
Etikk uttalelse
Alle dyr ble tatt vare på og håndtert i henhold til god dyr praksis som definert av nasjonale og lokale dyrevern organer (guide for omsorg og bruk av forsøksdyr publisert av National Institutes of Health og den tyske dyrevernloven «TierSchG»). Eksperimentelle protokoller ble godkjent av regjeringen i Unterfranken, Tyskland (protokollnumre 55.2-2531.01-17 /08 og 55.2-2531.01-25 /12) og /eller Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Explora BioLabs, som ligger i San Diego Science Center (San Diego, USA) (protokollnumre: EB08-003; EB11-025).
Tumor implantasjon og virus administrasjon
Svulster ble generert ved å implantere 5 × 10
6 C33A-RFP celler i 100 mL PBS subkutant i høyre abdominal flanken av 6-8 uker gammel kvinne atymiske nakne
Foxn1
nu
mus (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Tyskland). Tumor og lymfeknute volumet ble overvåket i to dimensjoner ved hjelp av en digital caliper og beregnet som [(lengde) x (bredde)
2 × 0,52]. Tumor volum ble målt i levende mus, mens lymfeknute volum ble målt
post mortem
, etter å ha åpnet buken. En lymfeknute ble definert til å være forstørret når den maksimale diameter oversteg 3 mm. For å studere effekten av onkolytiske virotherapy en enkelt dose av 5 x 10
6 plakkdannende enheter (pfu) av GLV-1h68 i 100 ul PBS ble injisert intravenøst (iv) inn C33A-RFP tumor-bærende mus, etter at svulsten volumet nådd 200-250 mm
3. Mus ble ofret i henhold til retningslinjer for Avliving av gnagere ved hjelp av karbondioksid.
fluorescens bildebehandling
Bilder av C33A-RFP tumorbærende mus ble tatt med Maestro EX Imaging System (Sylinder, Hopkinton , MA, USA). Fluorescens avbildning av tumorer, nyrer, lunger og lymfeknuter C33A-RFP tumor-bærende mus ble utført med en MZ16 FA Stereo-fluorescens mikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland). For avbildning av mus med Maestro EX Imaging System, ble dyrene bedøvet ved hjelp av 2-3% isofluran. Digitale bilder ble behandlet med Photoshop 7.0 (Adobe Systems, Mountain View, USA).
Måling av fluorescens intensitet
Måling av fluorescens intensiteten av RFP signal i lymfeknuter og nyrer av C33A- RFP tumor-bærende mus ble utført ved anvendelse av ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij). RGB-bilder av RFP signal av nyrer og lymfeknuter ble omgjort til 8-bits gråskala med en intensitet varierer fra 0-255. Fluorescensintensiteten representerer den gjennomsnittlige lysstyrken på alle RFP relaterte piksler.
Immunohistochemistry
for histologi, svulster, lymfeknuter og nyrer ble skåret ut og fiksert i 16 timer i 4% paraformaldehyde /PBS, pH 7,4. Fremstilling av 100 um seksjoner og merkingsfremgangsmåter ble utført som beskrevet tidligere [26] fra Leica VT1000 Vibratom (Leica, Heerbrugg, Sveits). Etter merking ble vevssnitt montert i Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland). For utarbeidelse av 10 mikrometer seksjoner vevsprøver ble seksjonert med kryostaten 2800 Frigocut (Leica, Wetzlar, Tyskland). Etter dehydrering i 10% og 30% sukrose (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) prøver ble innebygd i Tissue-Tek O.C.T. (Sakura Finetek Europa B.V., Alphen aan den Rijn, Nederland). Cryo-seksjoner ble lagret ved -80 ° C og inkubert med primære antistoffer i 1 time. Etter vask med PBS, ble seksjonene farget i 1 time med sekundære antistoffer og endelig montert i Mowiol 4-88.
Antistoffer og reagenser
endotelceller blodkar ble farget med en hamster monoklonalt anti-CD31 antistoff (Chemicon International, Temecula, USA; MAB1398Z) og endothelial lymfeårer med en kanin polyklonale anti-LYVE-1 antistoff (Abcam, Cambridge, UK, ab14917). Nuclei var Hoechst 33342-merkede (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland). DyLight488-konjugert sekundære antistoffer (esel) ble hentet fra Jackson Immunoresearch (Pennsylvania, USA). Primære og sekundære antistoffer ble fortynnet 1:100 i PBS /0,3% Triton-X-100
Fluorescensmikroskopi
Bilder av tumor, lymfeknute og nyreseksjoner ble tatt med følgende mikroskoper.: en stereo-fluorescens mikroskop MZ16 FA (Leica) er utstyrt med en digital CCD kamera og Leica IM1000 4.0-programvaren (1300 × 1030 pikslers RGB-fargebilder), AOBS en TCS SP2 confocal laser mikroskop (Leica) er utstyrt med LCS 2,16 programvare ( 1024 × 1024 pikslers RGB-fargebilder) og en Axiovert 200 M mikroskop (Zeiss) med Axiovision 4.5 programvare (1388 × 1040 piksler gråtonebilder), henholdsvis. Digitale bilder ble behandlet med Photoshop 7.0 (Adobe Systems, USA) og slått sammen for å gi pseudo-farget bilder. Bilder av celler utsådd i 24 brønners plater ble tatt enten med stereo-fluorescens mikroskop MZ16 FA (Leica) eller med den Axiovert 200 M mikroskop (Zeiss).
Fremstilling av enkeltcellesuspensjoner og FACS-analyse
for å forberede enkeltcellesuspensjoner av svulster, lumbar og nyrenes lymfeknuter, lunger og nyrer av C33A-RFP tumorbærende mus vev ble veid, hakket og inkuberes individuelt i DMEM høy glukose media supplert med 2% FCS, 10.000 U /ml Collagenase i (Sigma, Steinheim, Tyskland) og 5 MU /ml DNase i (Calbiochem, Darmstadt, Tyskland) ved 37 ° C. Tumorvev ble inkubert i 35 min, LN og RN vevet i 30 min, nyrer i 20 minutter og lungene i 15 min. Deretter vev ble passert gjennom 70 mikrometer nylon mesh filtre (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia) og overført til DMEM høy glukose media supplert med 2% FCS. Etter sentrifugering (1000 g, 10 min) pellets ble resuspendert i 2 x volum av PBS /2% FCS, med hensyn til vekt vev. Påfølgende, 100 mL av enkeltcellesuspensjoner ble analysert ved hjelp Accuri C6 cytometeret og FACS analyse programvare CFLOW versjon 1.0.227.4 (Accuri cytometere, Inc. Ann Arbor, MI, USA). Celler ble gated henhold til deres størrelse (FSC) og detaljnivå (SSC). Videre ble 100 pl av en enkelt cellesuspensjon sådd på 24 brønners plater i en x 10
-1 til 1 x 10
-4 fortynninger. Fortynninger ble utarbeidet i DMEM høy glukose media supplert med 10% FCS. Tre dager etter cellesuspensjon poding media ble supplert med 5 ug /ml blasticidin, for å velge C33A-RFP-celler. Celle vasking og media fornyelse ble utført to ganger i uken. Etter en uke fra blasticidin seleksjons C33A-RFP celler i 24 brønners plater ble farget med krystallfiolett i 3 timer, vasket og tørket. Etterpå ble cellekolonier telles.
Statistisk analyse
En to-tailed Student
t
test ble brukt for statistisk analyse.
P
verdier av ≤0.05 ble ansett som statistisk signifikant. Stjernene viser en signifikant forskjell mellom forsøksgruppene. (* Indikerer p≤0.05; ** indikerer p≤0.01; *** indikerer p≤0.001)
Resultater
Vekst kinetikk subkutan C33A- RFP tumorer og lymfeknutemetastaser formasjon
en observert forstørrelse av lumbar og renal lymfeknuter i C33A tumorbærende mus indikerte tilstedeværelse av metastasized tumorceller. For å muliggjøre visualisering av metastatisk C33A celle spredning, cDNA-sekvensen av det røde fluorescerende protein (
mRFP1
) ble innsatt i C33A cellegenomet. Uttrykk av RFP i C33A celler ble bekreftet av fluorescens mikroskopi (Fig. 1a). Deretter ble 5 x 10
6 C33A-RFP-celler ble subkutant (s.c.) implantert inn i den høyre flanken til nakne mus. Hver uke opp til 49 dager etter implantasjon seks-syv C33A-RFP tumorbærende mus ble undersøkt. Som en del av disse analysene volumer av tumorer, lumbar (LN1, LN2) og renal (RN1, RN2) lymfeknuter ble målt (fig. 1 b + c) og fluorescens-avbildning av tumorer og lymfeknutemetastaser ble utført (fig. 1d) . Vi viste en jevn økning av tumorvolumet fra uke til uke etter implantasjon av C33A-RFP celler. På samme tid, ble mengdene av lumbar og nyre lymfeknuter øker også, noe som indikerer en mulig tumorcelle kolonisering prosess som resulterer i lymfeknute volumekspansjon. Fluorescens bildebehandling bekreftet RFP signaler i de forstørrede lymfeknuter, viser C33A-RFP metastaser. Spesielt, volumet av LN1, lumbar lymfeknute som ligger nærmest den primære C33A-RFP tumor, var økende første og største, som ville være forventet for regionale lymfeknutemetastaser.
svulster og lymfeknutene til seks syv mus pr tidspunkt ble analysert (7 og 21 dpti: n = 7; 14, 28, 35 og 49 dpti: n = 6). en Bright feltet (BF), RFP og overlay bilder av C33A-RFP celler, skala bar representerer 100 mikrometer. b Tid kurve av C33A-RFP tumorvekst. c Volum av lumbale og renal lymfeknuter over tid. d Representative bilder av svulster (øverste rad) og tilhørende lymfeknuter (nedre rad) av C33A-RFP tumorbærende mus ved de angitte dager etter tumorcelle implantasjon. Bilder av svulster (T) ble tatt av levende mus ved hjelp av Maestro EX Imaging System. Imaging av lumbar (LN1, LN2) og renal (RN1, RN2) lymfeknutemetastaser i magen av tumorbærende mus ble utført
post mortem
, etter å ha åpnet magen og fjerne organer. Skala barer representerer 2 mm. e Andel av alle lymfeknuter positivt for RFP over tid. f Andel LN1, LN2, RN1 og RN2 henholdsvis positivt for RFP per tidspunkt.
Videre fluorescens bildebehandling i den tiden løpet av 49 dager avdekket en jevn økning av mengden av lymfeknuter positive for RFP etter tumorcelle implantasjon, som starter med 21% RFP positive lymfeknuter på dag 7. Mengden økes til 88% lymfeknuter var positive for RFP ekspresjon ved slutten av eksperimentet (fig. 1E). Videre ble andelen av RFP positiv LN1, LN2, RN1 og RN2 analysert per tidspunkt. På dag 7 etter implantasjon var 86% av alle registrerte LN1s positivt for RFP, mens ingen RFP signal påvises i LN2, RN1 eller RN2 fører til antagelsen om at metastatisk kolonisering med C33A-RFP celler oppstår først i det regionale lymfeknute LN1. Fjorten dager etter tumorcelle implantasjon (dpti) alle oppdagede LN1s (100%) og 50% av RN1s var positive for RFP, noe som indikerer at etter metastasizing til LN1 de C33A-RFP celler spre seg til neste lokale lymfeknute (nedsatt lymfeknute RN1) . Spredning C33A-RFP celler i LN2 og RN2 ble først oppdaget på dag 28 etter implantasjon (Fig. 1f). Til sammen viste vi en kontinuerlig progresjon av metastasering av korsryggen og nyrenes lymfeknuter sammenfallende med den C33A-RFP tumorvekst fra uke til uke etter subkutan tumorcelle implantasjon.
C33A-RFP tumorceller metastaserer via både lymfesystemet og hematogene ruter
Under våre mikroskopiske undersøkelser vi oppdaget tilstedeværelsen av C33A-RFP celler i lymfeårer forbinder korsryggen og nedsatt lymfeknutemetastaser i C33A-RFP tumor-bærende mus, og dermed viser lymphatics som rute for sekundærmetastaser i denne modellen (fig. 2a, b) .I tillegg sirkulerende C33A-RFP-celler ble også påvist i erytrocytt-inneholdende blodkar som ligger ved siden til LN-RN-tilkobling lymfeårer, reflekterer hematogenous ruten for metastatisk migrering av tumorceller (fig. 2c). Spesielt, fluorescens bildebehandling avslørt RFP signaler i lungene av C33A-RFP tumorbærende mus som vanligvis er den første orgel for å få spredning i tilfelle av metastatisk spredning via hematogenous ruten. Opp til dag 28 post tumorcelle implantasjon ikke lunge ble funnet å være positive for RFP, mens ved dag 35 tre av seks og ved dag 49 fem av seks lungene ble testet positive for RFP flekker (fig. 2d).
en migrering av C33A-RFP celler i en lymfe fartøy koble LN1 og RN1 42 dpti. Skala barer representerer 2 mm. b LYVE-1-farging av 100 um tverrsnitt av delen mellom LN1 og RN1. Skala barer representerer 200 mikrometer. c Migrering av C33A-RFP celler i en lymfe (fylt pilspiss) og i en rød blodcelle som inneholder blodkar (åpen pilspiss) 32 dpti. Skala barer representerer 2 mm (til venstre) og 500 mikrometer (høyre). d RFP signaler i lungene av C33A-RFP tumorbærende mus. Over: representant bilde av en lunge 42 dpti. Scale bar representerer 2 mm. Under: Prosent av lungene testet positivt for RFP flekker over tid. Lungene av seks til syv mus per tidspunkt ble undersøkt (7 og 21 dpti: n = 7, 14, 28, 35 og 49 dpti: n = 6)
I sammendraget, vi tydelig demonstrert. at C33A-RFP celler bruker lymfesystemet samt hematogene ruter for metastatisk spredning i fm implantert tumor-bærende nakne mus.
Videre observerte vi en akkumulering av RFP signal i nyrene til disse mus ved fluorescens avbildning i løpet av tiden løpet av 49 dager (fig. 3). Histologisk analyse av tumorer, LNS og RNS av tumorbærende mus 31 dpti avslørt en organisert struktur av RFP uttrykk C33A celler i tumorer og lymfeknutemetastaser, som ikke var tilfelle for RFP i nyrene (fig. 4a). Videre viste vi at nyre RFP signaler ble plassert hovedsakelig i cortex og CD31 merkede blodårer i medulla og bekkenet av nyrene (fig. 4b). Bilder av nyrebarken med høyere forstørrelse avslørte RFP opphopning i nephrons, hvor RFP syntes å være plassert celle-uavhengig i spot-lignende mønstre (fig. 4C). Det er ingen mikrometastaser ble observert i nyrer. Derfor antar vi at den sterke RFP signal i nyrene av C33A-RFP tumorbærende mus kan være forårsaket av deponering av RFP i nyrebarken, etter blod filtrering i nephrons. I motsetning til hva vi har observert i nyrene, ble mikrometastaser påvist i lungene av C33A-RFP tumorbærende mus 42 dpti (Fig. 4d venstre). Videre ble enkelt C33A-RFP celler som finnes i blodårene i lungene samt RFP fragmenter som ligner på de som ble observert i nyrebarken av nyrene (Fig. 4d høyre).
Seks-syv mus ble analysert per tidspunkt (7 og 21 dpti: n = 7, 14, 28 og 35 dpti: n = 6). En representant bilder av RFP signal i nyrene. Øvre rad: overlapping av lyse felt og RFP bilder. Nedre rad: bilder av RFP signal. Skala barer representerer 2 mm. b Gjennomsnitt fluorescensintensitet av RFP signal i nyrene av C33A-RFP tumor-bærende mus over tid.
Kjerner i a, b og c ble farget med Hoechst fargestoff. et overlegg av lyse felt, RFP og Hoechst bilder av 10 mikrometer deler av en svulst, LN, RN og nyre 31 dpti. Skala barer representerer 50 mikrometer. b Bilder av 100 mikrometer deler av en nyre 31 dpti, farget med anti-CD31 antistoff og Hoechst fargestoff. Scale bar representerer 2 mm. c 10 mikrometer nyreseksjonen farget med Hoechst fargestoff. Høyre: confocal bilde. Skala barer representerer 100 mikrometer (til venstre) og 10 mm (til høyre). d CD31 og Hoechst farging av 100 mikrometer lunge §§ 42 dpti. Fylt pilspiss: i en blodåre migrerer C33A-RFP celle; tom pilspiss: RFP positive fragmenter. Skala barer representerer 250 mikrometer (til venstre) og 50 mikrometer (til høyre). Alle bilder er representative eksempler.
Til sammen histologiske analyser viste en klar, organisert struktur av RFP uttrykke C33A celler i svulster og lymfeknutemetastaser, mens RFP signal i nyrene så ut til å være i hovedsak et resultat av protein avsetning og ikke bare av metastasized RFP positive tumorceller. RFP signal i lungene syntes å være forårsaket av begge, spredning og avgjort C33A-RFP celler og RFP avsetning.
Påvisning av levedyktige C33A-RFP celler i svulster, LNS, RNS, lunger og nyrer av tumorbærende mus
for ytterligere å undersøke om RFP signal i svulster, LNS, RNS, lunger og nyrer av C33A-RFP svulst bærende mus resulterte fra levedyktige C33A celler, enkelt celle suspensjoner av disse vev av 5 mus 49 dpti ble utarbeidet og analysert ved FACS. Vi fant at 83% av cellene i tumorcellesuspensjoner var positive for RFP, 42% i LN, 32% i RN, 11% i lunge og 18% i nyresuspensjoner (fig. 5a). Derfor RFP positive tumorceller var detekterbare i alle analyserte vev av C33A-RFP tumor-bærende mus.
vev i alle 5 mus ble analysert (n = 5). en Mengde RFP positive (RFP +) og negative (RFP-) celler i enkeltcellesuspensjoner av svulst, LN, RN, lunge og nyrer. 10.000 hendelser ble analysert ved FACS. b Vekst av forskjellige fortynninger (10
-1 til 10
-4) av C33A-RFP enkeltcellesuspensjoner i brønner på 24-brønners plater etter en uke med blasticidin utvalg. Venstre bilde: media forbruket i brønner som inneholder 2 dager gamle medier. Bilde til høyre: brønner etter farging med krystallfiolett. c Numbers av kolonidannende C33A-RFP celler per gram tumor, LN, RN, lunger og nyrer, henholdsvis. Cellekolonier ble talt for hvert organ etter blasticidin-utvalget og krystallfiolett farging.
For å finne ut hvor mange av disse RFP positive celler var faktisk levedyktige kreftceller, utførte vi en blasticidin utvalg analysen. Etter en uke fra blasticidin seleksjonsmedium forbruk (indikert ved endring av fargen av fenolrødt fra rød til gul) korrelert med mengden av levedyktige celler (Fig. 5b, venstre). Krystallfiolett farging viste i tillegg at svulsten, LN og RN suspensjoner inneholdt mer levedyktige C33A-RFP celler enn lunge- og nyresuspensjoner (Fig. 5b, høyre). Bare noen få positive C33A-RFP cellekolonier ble observert i brønner av lunge og nyre suspensjoner i 10
-1 fortynninger, mens RFP-positive celler ble lagt merke til i alle fortynninger av svulsten, LN og RN suspensjoner.
Deretter farget C33A-RFP cellekolonier ble tellet i de passende fortynninger og antallet kolonidannende C33A-RFP celler per gram vev ble bestemt for tumorer, metastaser og organer. Det viste seg at 8,6 × 10
6 (± 2,9 × 10
6) kolonidannende C33A-RFP celler ble påvist per gram svulstvev, 1,7 × 10
7 (± 5,9 × 10
6 ) i LN og 1,5 × 10
7 (± 1,7 × 10
7) i RN. I motsetning til dette er bare 4,8 × 10
3 (± 9,7 × 10
3) kolonidannende C33A-RFP celler ble påvist i lungene og 8,1 × 10
3 (± 1,7 × 10
4) i nyrene (fig. 5c).
Derfor viste vi et betydelig lavere beløp av levedyktige C33A-RFP celler i lungene og nyrene enn i tumorer og lymfeknutemetastaser av tumorbærende mus, avsløre at C33A-RFP metastaser dannelse skjer hovedsakelig via lymfesystemet ruten.
Bekjempelse av metastaser i C33A-RFP modell
en gang, metastatisk spredning av C33A-RFP celler i hårløse mus etter sc implantasjon av tumorceller ble karakterisert, vi dro ut for å analysere muligheten for en onkolytiske virotherapy som en roman behandlingsalternativ for C33A-RFP svulster og metastaser. Nylig har det blitt vist at onkolytisk vacciniavirus GLV-1h68 er et effektivt middel for å bekjempe hematogenous samt lymfatiske metastaser i den humane prostatacancer PC-modell-3 [22], [27]. Basert på dette, synes GLV-1h68 til å være en lovende kandidat for å utrydde C33A-RFP metastaser. Til å begynne med ble 12 C33A-RFP tumor-bærende mus som injisert 11 dpti med 5 x 10
6 plakkdannende enheter (pfu) av GLV-1h68 eller PBS som kontroll, respektivt. Så tidlig som 14 dager etter virus /PBS injeksjon (dpi) tumor volum i GLV-1h68 behandlede gruppen begynte å avta. Fra 18 ppt på en statistisk signifikant reduksjon av de C33A-RFP tumorvolumer ble oppnådd på grunn av virus behandling sammenlignet med PBS-behandlede kontroll-tumorer (fig. 6a). Tumorvolumene ble redusert til den opprinnelige størrelse. Histologisk analyse av tumorer virus behandlede og kontroll 21 ppt viste en massiv spredning av GLV-1h68 i svulster i virusgruppen, assosiert med en lavere fluorescens-intensitet av RFP og Hoechst, noe som indikerer virus-mediert, markert nekrose i tumorvevet (Fig. 6b ). Videre volumer av lumbar og nyre lymfeknuter i PBS-gruppen var signifikant høyere sammenlignet med de i viruset behandlede gruppe 21 ppt, noe som indikerer en metastase-inhiberende virkning av GLV-1h68 (fig. 6c). I videre analyser, noder lymfe positivt for C33A-RFP ble bestemt ved fluorescens mikroskopi. Det viste seg at 16 av 22 forstørrede lymfeknuter (72,3%) var positive for RFP i PBS-gruppen, mens bare en av 15 forstørrede lymfeknuter (6,7%) ble testet positivt for RFP i GLV-1h68 behandlede gruppe ( fig. 6d), noe som viser at viruset-mediert terapeutisk effekt på lymfeknutemetastasedannelse. Videre mikroskopiske analyser av lumbale lymfeknutemetastase seksjoner viste at verken RFP eller virus kodet GFP kan påvises 21 dager etter virus injeksjon. I kontrast til dette, ble en sterk RFP signal som detekteres i lymfeknuter i PBS behandlede C33A-RFP tumorbærende mus. Til slutt, RFP i nyrene og lungene av C33A-RFP tumorbærende mus ble analysert mikroskopisk og sammenlignet i PBS og virus-behandlede grupper. I begge tilfeller ble det observert en drastisk reduksjon av RFP på grunn av virus-behandling (fig. 6f, g).
en tidskurve for C33A-RFP tumorvekst hos 12 mus etter administrering av onkolytiske vaccinia virus GLV-1h68 og PBS, henholdsvis (n = 6). Analyser av C33A-RFP svulster og metastaser i b-g ble gjort 32 dpti og 21 dager etter administrering av GLV-1h68 eller PBS (dpi). Seks mus ble undersøkt per gruppe (n = 6). b Venstre: C33A-RFP tumor-bærende mus 21 dpi. Høyre: 100 mikrometer deler av et PBS og en GLV-1h68 behandlede tumor. Kjerner ble farget med Hoechst fargestoff, er GFP uttrykt av GLV-1h68 og RFP ved C33A celler. c Volum av korsryggen og nyrenes lymfeknuter og d andel av RFP positive lymfeknuter i PBS og GLV-1h68 behandlet C33A-RFP tumorbærende mus (til venstre). Høyre: Bilder av lumbale og renal lymfeknuter i PBS og GLV-1h68 behandlet mus. e 100 mikrometer deler av et PBS (til venstre) og en GLV-1h68 (høyre) behandlet korsrygglymfeknutemetastase. f Venstre: Prosentandel av nyrer positive for RFP i PBS og GLV-1h68 behandlede mus. Høyre: Bilder av nyrene i PBS og virusgruppen. g Andel av lungene positive for RFP i PBS og GLV-1h68 gruppe. Alle bilder er representative eksempler. Alle skala barer representerer 2 mm.
Til sammen viste vi en effektiv virus-mediert reduksjon av tumorstørrelse og metastatisk belastning i C33A-RFP tumorbærende mus 21 dpi.
Diskusjoner
Siden metastatisk spredning av karsinomer representerer den viktigste årsaken til kreft dødsfall, er det et sterkt behov for å intensivere forskning med fokus på feltet av tumormetastaser.
