Abstract
Blærekreft er den femte vanligste kreftformen i USA, og identifisere genetiske markører som kan forutsi mottakelighet i høy-risiko befolkning er alltid nødvendig. Formålet med studien er å bestemme hvorvidt genetiske variasjoner i den transformerende vekstfaktor-beta (TGF-β) reaksjonsveien er forbundet med blærekreft risiko. Vi identifiserte 356 single-nukleotid polymorfismer (SNPs) i 37 viktige gener fra denne veien og evaluert deres tilknytning til kreftrisiko i 801 tilfeller og 801 kontroller. Førti-en SNPs var signifikant assosiert med kreftrisiko, og etter å ha justert for multiple sammenligninger, 9 forble signifikant (
Q
-verdi ≤0.1). Haplotype analyse ytterligere avdekket tre haplotyper innenfor
VEGFC Hotell og to haplotyper i
EGFR
var signifikant assosiert med økt blærekreft risiko i forhold til den vanligste haplotype. Klassifisering og regresjon treet analyse videre avdekket potensielle høy-order gen-gen-interaksjoner, med
VEGFC:
rs3775194 å være den første splittet, noe som tyder på at denne varianten er ansvarlig for den mest variasjon i risiko. Personer som bærer felles genotype for
VEGFC
: rs3775194 og
EGFR
: rs7799627 og varianten genotype for
VEGFR
: rs4557213 hadde en 4,22 ganger høyere risiko, en mye større effekt omfang enn det som gitt av felles genotype for
VEGFR
: rs4557213. Vår studie gir den første epidemiologiske bevis som støtter en sammenheng mellom TGF-beta pathway varianter og blærekreft risiko
Citation. Wei H, Kamat AM, Aldousari S, Ye Y, Huang M, Dinney CP, et al. (2012) genetiske variasjoner i transformerende vekstfaktor beta Pathway som predikator for blærekreft Risk. PLoS ONE 7 (12): e51758. doi: 10,1371 /journal.pone.0051758
Redaktør: Yan Gong, College of Pharmacy, University of Florida, USA
mottatt: 9 mai 2012; Godkjent: 05.11.2012; Publisert: 12.12.2012
Copyright: © 2012 Wei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (U01 CA 127 615, R01 CA 74880, P50 CA 91846, og R01 CA 131 335) (www.NIH.org). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft ofte påvirker eldre og menn, med anslagsvis 73,510 nye tilfeller og 14,880 dødsfall i USA i 2012 [1]. Viktigste risikofaktorene for blærekreft inkluderer mannlige kjønn, alder, tobakksrøyking, og yrkesmessig eksponering for aromatiske aminer [2]. Det er i økende grad anerkjent som genetisk disposisjon kan bidra til blærekreft kreftutvikling [3]. Derfor identifisere personer mottakelige for kreft ved hjelp av genetiske markører kan redusere helsekostnader, øke kost-nytte av screening og overvåking, og bedre behandling og overlevelse av kreftpasienter.
transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) veien har blitt etablert som spiller viktige roller i ulike krefttyper og innblandet i tumorigenesis av blæren overgangsordning celle carcinoma. Mange studier har indikert at TGF-β signalering bidrar til epitel-mesenchymale overgang, angiogenese, migrering og metastaser i mange typer av maligne tumorer [4] [5], [6]. I normale celler, regulerer TGF-β cellevekst, differensiering, matriksproduksjon, og apoptose [7]. TGF-β indusert apoptose er ofte mediert av Smad-avhengige reaksjonsveien, men kan også forekomme gjennom begge p53-avhengig og p53-uavhengige mekanismer [8], [9], og innebærer caspaseaktivering, oppregulering av proapoptotiske faktorer (dvs. Bax) og /eller nedregulering av antiapoptotic faktorer (dvs. Bcl-2 og Bcl-xL) [10] – [12]. Disse faktorer er alle integrerte deler av det humane immunsystem. TGF-β receptor en variant rs11466445 (TGFBR1 * 6A) har blitt assosiert med en øket risiko for bryst- og eggstokk-kreft, men ikke kolorektal eller blærekreft [13] – [16]. Men en annen studie på effekten av 7 ulike genetiske varianter i to sentrale medlemmer av TGF-β pathway (
TGFB1 Hotell og
TGFBR1
) og klinisk utfall av muskel invasiv blærekreft indikerte at
TGFBR1:
rs868, som ligger i 3′-utranslaterte område, ble signifikant assosiert med sykdomsspesifikk dødelighet [17]. Det er også rapportert at genetiske varianter i
RUNX3
, en tumor suppressor av TGF-β vei, kan modulere blærekreft risiko [18].
Siden TGF-β pathway spiller en viktig rolle i cellulære prosesser, hypotese vi at polymorfismer til TGF-β pathway gener kan modulere risikoen for blærekreft. For å teste denne hypotesen, gjennomførte vi en stor case-control studie for å evaluere effekten av enkelt-nukleotid polymorfismer (SNPs) i viktige gener fra denne veien. Så vidt vi vet, er dette den første studien å utforske sammenhengen mellom et omfattende panel av polymorfismer i TGF-β pathway gener og blærekreft risiko og for å identifisere undergrupper som ville være mer sannsynlig å ha høyere kreftrisiko.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter før innmelding i denne studien. Studien ble godkjent av Institutional Review Boards på MD Anderson Cancer Center, Baylor College of Medicine, og Kelsey-Seybold Clinic.
Studiepopulasjon og datainnsamling
Dette case-control studie startet pasient rekruttering i 1999 og er for tiden pågår. Blærekreftpasienter ble rekruttert fra University of Texas MD Anderson Cancer Center og Baylor College of Medicine. Sakene var pasienter med nylig diagnostisert, histologisk bekreftet blærekreft. Ingen av pasientene hadde gjennomgått kjemoterapi eller strålebehandling før studere innmelding. Det var ingen restriksjoner for alder, kjønn, eller sykdom scenen på rekruttering. De kontrollpersoner var friske personer uten tidligere historie med kreft (unntatt nonmelanoma hudkreft). De ble rekruttert fra Kelsey-Seybold klinikken, den største private multispecialty gruppepraksis i Houston byområde. Saker og kontroller ble matchet i forhold til alder (± 5 år), kjønn og etnisitet. Alle deltakerne i studien forutsatt signert informert samtykke og fullførte en 45-minutters personlig intervju av utdannet MD Anderson ansatte intervjuere. Etter hvert intervju, ble en 40 ml perifer blodprøve trukket inn kodede og hepariniserte rør for påfølgende DNA isolering og analyse. Personer som hadde røykt mindre enn 100 sigaretter i sin levetid ble definert som aldri-røykere, enkeltpersoner som hadde røykt mer enn 100 sigaretter, men hadde sluttet mer enn ett år før diagnose eller intervju ble definert som tidligere røykere og personer som var i dag å røyke eller hadde stoppet mindre enn 1 år før ble definert som nåværende røykere. I denne studien ble tidligere og nåværende røykere definert som noensinne røykere. Siden mer enn 90% av våre rekruttert tilfeller var ren overgangsordning celle carcinoma, vi bare tatt med dette histologi i studien. Siden mer enn 90% av våre studiepopulasjonen var selvrapportert ikke-spanske kaukasiere basert på spørreskjemaet dato, begrenset vi analysen til kaukasiere å begrense konfunderende effekt av befolkningen stratifisering og samtidig beholde det meste av statistisk styrke.
SNP Seleksjon og genotyping
Et panel av 356 SNP i 37 gener (tabell S1) ble valgt på basis av følgende kriterier. Kort fortalt, vi utnyttet Oppfinnsomhet System Pathway Analysis programvare (https://www.ingenuity.com) og Nasjonalt senter for Bioteknologi Information (NCBI) PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) for å identifisere en liste over TGF-B sti-relaterte gener. For hvert gen, valgte vi tagging SNPs ved binning algoritme av LDSelect programvare (https://droog.gs.washington.edu/ldSelect.pl, versjon 1.0) (r
2 0,8, MAF 0,05) innen 10 kb oppstrøms for transkripsjonsstartsetet eller 10 kb nedstrøms transkripsjonsstoppstedet. SNP frekvens og LD data var basert på den internasjonale HapMap Prosjektarkiv, slipper 22, menneskelige genom build 36. Vi inkluderte også potensielt funksjonelle SNPs med mindre allel frekvens (MAF) større enn 0,01 i kodingen (synonymt og ikke-synonymt SNPs) og regulatoriske regioner (promoter, spleising språk, 5′-utranslaterte område, og 3′-uoversatt region). Den genotyping ble utført ved hjelp av Illumina er IVelg tilpasset SNP array (Illumina, San Diego, California). Genotyper ble analysert og eksportert ved hjelp av Illumina BeadStudio programvare. Eventuelle SNPs med en takst 95% ble ekskludert fra videre analyse
Statistical Analysis
Laboratory og epidemiologiske data ble slått sammen og de fleste analysene ble utført ved hjelp av Stata 10,0 (Stata Corporation, College Station. , TX) og HelixTree (gylne Helix, Bozeman, MT) programvare. Utdeling av egenskaper i saker og kontroller ble evaluert av χ
2 test (for kategoriske variabler) eller t-test (for kontinuerlige variabler). For hver SNP, testet vi Hardy-Weinberg likevekt med godhet-of-fit χ
2 test for å sammenligne observert med en forventet frekvens av genotyper i kontrollpersoner. Effektene av genotyper av SNPs på blærekreft risiko ble beregnet som odds ratio og 95% konfidensintervall (95% KI) ved hjelp av multivariate ubetinget logistisk regresjon under dominerende, recessive, og additive modeller av arv justert for alder, kjønn og røykestatus der det er hensiktsmessig. Den beste sittende modell var den med de minste
P
verdi blant de tre modellene. En
Q
-verdi ble beregnet å ta høyde for multiple sammenligninger.
Q
-verdi målt andelen falskt positive påløper (false funnrate) når en SNP vist betydelig. Bootstrap resampling ble utført 100 ganger til internt validere resultatene [19]. Analyse av den kombinerte effekten av ugunstige genotyper innebærer en sum av alle risiko genotyper fra disse SNPs som viser statistisk signifikans i hovedanalysen (
P
0,05) med lik bidraget fra hver variant. Haplotype analyse ble utført ved hjelp av maksimering algoritmen implementert i HelixTree programvare. Høyere ordre gen-gen-interaksjoner ble evaluert ved bruk av klassifisering og regresjon treet (CART) analyse implementert i HelixTree programvare. Alle statistiske analyser ble tosidig.
Resultater
Kjennetegn på studiepopulasjonen
Som vist i tabell 1, 801 kaukasiske tilfeller og 801 kaukasiske kontroller ble inkludert i studien . Det var ingen signifikante forskjeller i blærekreft risiko på grunn av kjønn (
P
= 1) eller alder (
P
= 0,051). Som spådd, tilfeller rapportert en høyere Antall sigaretter /dag enn kontrollene (25,6 versus 22,5,
P
0,001). Blant røykere, tilfeller rapportert høyere pakke-år med røyking enn kontrollene (43,0 versus 29,9,
P
0,001). Det var en signifikant forskjell mellom saker og kontroller etter røykestatus (
P
0,001) med en høyere prosentandel av nåværende røykere i saker og høyere prosentandel av som aldri har røykt i kontrollene (
P
0,05). Blant de 356 SNPs undersøkt, ble 41 SNPs signifikant assosiert med kreftrisiko (
P
0,05), og etter å ha justert for multiple sammenligninger, 9 forble signifikant, med en
Q
-verdi ≤ 0,1. Disse SNPs ble plassert i tre gener i TGF β vei, inkludert
VEGFC
, epidermal vekstfaktor reseptor genet (
EGFR
), og
SMAD3
.
å internt validere disse resultatene, ved siden utførte vi tilfeldig bootstrap prøvetaking av de betydelige SNPs for 100 iterasjoner og notert antall ganger at
P
verdien var mindre enn 0,05. Åtte av disse ni topp SNPs hadde svært konsistente resultater, med bootstrap
P
verdier og 0,05 for mer enn 90% av samplings (tabell 2)
kumulative effekten av flere Ugunstige genotyper på. kreftrisiko
Fordi unormal TGF-β signalering kan resultere i aktivering av flere nedstrøms-gener og 9 SNP’er nådde statistisk signifikans etter multiple sammenligninger i hovedeffektanalyse, som vi anvendte kombinert analyse for å bestemme om flere ugunstige genotyper i TGF-β veien har en additiv effekt på blære kreftrisiko. Det var en betydelig dose-respons trend med økt risiko for blærekreft med økende antall ugunstige genotyper. Sammenlignet med referansegruppen bestående av individer med 0~2 ugunstige genotyper, grupper med 3 eller 4 ugunstige genotyper hadde en betydelig forhøyet risiko med ORS av 1,73 (95% KI, 1,28 til 2,33,
P
0,001), henholdsvis, mens høyrisikogruppen med 5~9 ugunstige genotyper hadde en betydelig forhøyet risiko med OR på 2,57 (95% KI, 1,92 til 3,43,
P
0,001). (
P
trend = 1,07 × 10
-10) (tabell 3)
haplotype analyse av VEGFC og EGFR SNPs
Som flere SNPs i
VEGFC Hotell og
EGFR
gener viste signifikante sammenhenger, neste utførte vi haplotype analyse for 8 topp SNPs i disse genene i vår studiepopulasjonen. Vi observerte tre haplotyper betydelig forbundet med blærekreft risiko (tabell 4). Haplotype H7 var sammensatt av SNPs rs1485762-rs6828869-rs17697515-rs3775194-rs4557213, og fagene bærer rs1485762 hvete, rs6828869 variant, rs17697515 hvete, rs3775194 variant, og rs4557213 hvete lene viste en signifikant 78% økning i risiko (OR 1,78; 95% CI, 1,13 til 2,82;
P =
1,4 × 10
-2) sammenlignet med de som bærer haplotype H0. Haplotyper H11 andH15 også nådd signifikant sammenheng med blærekreft risiko med OR på 1,63 (95% KI, 1,09 til 2,43;
P
= 1,6 × 10
-2) og OR på 1,78 (95% CI, 1,23 til 2,57;
P
= 2,0 × 10
-3) (Tabell 4). Siden tre SNPs i
EGFR
genet viste signifikant sammenheng etter gjentatte sammenligninger (
Q
≤0.1, tabell 2), også utførte vi haplotype analyse for disse tre SNPs i
EGFR
i totalbefolkningen og identifiserte to betydelige haplotyper (
P
0,05) (Tabell 5). Haplotype H3 var sammensatt av SNPs rs11238349- rs7799627- rs6593205, og fagene bærer rs11238349 hvete, rs7799627 variant, og rs6593205 variant lene viste en signifikant 25% reduksjon i risiko (OR, 0.75; 95% CI, 0,56 til 1,00;
P
= 0,05) sammenlignet med haplotype H0. Haplotype H4 også nådd en signifikant sammenheng med blærekreft risiko med en OR på 1,41. (95% KI, 1,09 til 1,83;
P
= 1,0 × 10
-2) (tabell 5)
høyere ordens Gene-genet Interactions
neste utforsket høyere orden gen-gen-interaksjoner for å avgjøre hvorvidt komplekse samspill mellom disse betydelige SNPs ytterligere kan modulere blærekreft risiko. Den endelige trestruktur identifisert flere potensielle interaksjoner blant de ni beste SNPs (figur 1).
VEGFC
: rs3775194 ble identifisert som den første split, noe som antyder sin viktige rolle i gen-genet interaksjon og potensial til å forutsi kreftrisiko. Den endelige trestruktur også identifisert fire terminalnodene med betydelig høyere risiko enn lav risiko genetiske profilen til node 1 (figur 1). Spesielt node fem hadde en signifikant forhøyet risiko med OR av 3,28 (95% KI, 1,88 til 5,72), mens node 6 hadde en enda høyere signifikant forhøyet risiko med OR av 4,22 (95% KI, 1,46 til 12,17).
Merk: Hver node betegner antall og andel av tilfellene og OR med 95% konfidensintervall i parentes. * Signifikant på
P
. 0,05
Diskusjoner
Blærekreft gjenstår å være en utfordrende sykdom på grunn av den høye frekvensen av tilbakefall og ledsaget høy medisinsk kostnader. Ved hjelp av genetiske markører for å bestemme risiko kan bidra til å identifisere høy risiko befolkningen for tidlig screening, diagnostisering og behandling, noe som kan forbedre kliniske utfall. Dette er den første studien å utforske sammenhengen mellom et omfattende panel av polymorfismer av TGF-beta pathway gener og blærekreft risiko og for å identifisere undergrupper som vil mer sannsynlig har høyere kreftrisiko. Vi identifiserte og evaluert 356 SNP’er i 37 nøkkelgener fra TGF-β veien for sine forbindelser med blærekreft risiko. Våre resultater identifisert 41 SNPs betydelig forbundet med blærekreft mottakelighet, og ni av dem forble signifikant etter justering for multiple sammenligninger (
Q
≤0.1). Spesielt SNPs i
VEGFC
viste de mest signifikante sammenhenger i enkelt SNP og haplotype analyser. KJØP analyse ytterligere avdekket potensielle høy-order gen-gen-interaksjoner og kategorisert fagene i ulike risikogrupper i henhold til deres spesifikke polymorfe signaturer. Vår studie gir den første epidemiologiske bevis som støtter en sammenheng mellom en omfattende TGF-β pathway SNPs og blærekreft risiko.
Fem av de beste ni betydelige SNPs var i
VEGFC
, som er kjent for å har viktige funksjoner som bidrar til blærekreft risiko (tabell 2). VEGFC er et medlem av den blodplate-avledet vekstfaktor /vaskulær endotelial vekstfaktor (PDGF /VEGF) familie. Dette genet funksjoner i angiogenese, lymphangiogenesis, endotel-cellevekst og overlevelse, påvirker permeabiliteten av blodårene, og letter også lymfeknutemetastase. Flere studier har korrelert forhøyet VEGF uttrykk med tilbakefall av sykdommen eller progresjon, ofte som en selvstendig prediktor på multivariat analyse. Det er en positiv sammenheng mellom
VEGF-C
uttrykk og lymfatisk invasjon hos pasienter med brystkreft, mage, og livmorhalskreft [20] – [22]. VEGF-C-ekspresjon ble funnet i cytoplasma i overgangs carcinoma celler og var forbundet med lymfeknutemetastase i blærekreft [23] – [24] og er også blitt funnet å korrelere med kliniske parametere som tumorstørrelse, patologisk T stadium, patologisk karakter , lymfatisk-venøs engasjement, og bekken lymfeknutemetastase i blærekreftpasienter [23]. Haplotype analyse ytterligere identifisert tre viktige haplotyper av
VEGFC
, noe som tyder på at haplotype basert analyse kan være mer informativ enn én SNP analyser og resequencing DNA-prøver bærer høy risiko og lav risiko haplotyper kan være i stand til å forbedre risikovurdering. De fem mest betydningsfulle (
Q
0,1)
VEGFC
SNPs identifiserte vi er alle lokalisert i intron regionen, noe som kan bidra til endringer i genuttrykk eller spleising. Alternativt er det også mulig at disse SNPs er knyttet til andre årsaks varianter i
VEGFC
.
Tre av de ni mest betydelige SNPs var i
EGFR plakater (tabell 2) . EGFR er et tyrosinkinase-transmembran reseptor i Erb familien av reseptorer uttrykt på overflaten av epitelceller [25]. EGFR regulerer viktige prosesser i kreftutvikling, inkludert celle overlevelse, tumorinvasjon, og angiogenese og er involvert i mange maligniteter, inkludert blærekreft [26]. EGFR overekspresjon er hyppig observert i tumorer og forstadier til kreft og induserer tumordannelse i dyrestudier. EGFR uttrykk i blærekreft uavhengig spår sykdomsutvikling og dødelighet, og både VEGF og EGFR er fremstår som viktige mål for behandling av metastatisk blærekreft [25]. . Det er mulig at disse EGFR SNPs kan påvirke gentranskripsjon, dermed endrer protein nivå, eller de kan være knyttet til andre årsaks varianter i
EGFR
I tillegg har vi også identifisert
SMAD3
: rs12324036 signifikant assosiert med kreftrisiko. Det er vel kjent at TGF-β /aktivin /knutepunktet signalering blir omformet ved SMAD2 og SMAD3, og økt TGF-β1 nivå kan tilbakestille en ondartet fenotype til en mindre aggressiv fenotype i rotte blærekarsinom-cellelinje som mangler TGF-β1 [27]. Vår tidligere studie også identifisert
SMAD3
: rs11632964 blir signifikant assosiert med lungekreft total overlevelse [28], som også fremhever den viktige rollen SMAD3 i kreft. Det er mulig at den variant allelet av
SMAD3:
rs12324036 kan påvirke gentranskripsjon dermed endrer proteinnivå. Alternativt kan det være knyttet til andre årsaks varianter i
SMAD3
. Samlet sett fremhever vår studie foreningen av
EGFR VEGFC
, og
SMAD3
polymorfismer med blærekreft risiko.
neste påføres en vei basert tilnærming til omfattende evaluere effekten av de ni betydelige SNPs (
Q
0,1) på risiko for blærekreft. Vi identifiserte et gen-dose effekt for de ni SNPs som var betydelig etter multippel sammenligning justering. De med 5~9 risiko genotyper hadde høyest risiko for blærekreft, tyder flere varianter innenfor denne tasten veien var uheldig og hadde en større effekt enn en enkelt variant. Videre er omfanget av hver enkelt SNP var beskjeden, men risikoen for enkeltpersoner med fem-ni av disse risiko genotyper var mer enn doblet. Dette understreker også viktigheten av å inkludere flere SNPs i en felles vei for å undersøke felles effekter i risikovurderingen.
Innenfor rammen av en vei, vi hypotese at genet-genet interaksjoner vil ytterligere modulere risiko for blærekreft . Potensielle gen-gen-interaksjoner mellom tre varianter ble observert, med
VEGFC:
rs3775194 å være den første splittelsen i vår CART analyse, noe som tyder på sin betydning i å bestemme den mest variasjon i risiko. Personer som bærer felles genotype for
VEGFC
: rs3775194 og
EGFR
: rs7799627 og varianten genotype for
VEGFR
: rs4557213 hadde en 4,22 ganger høyere risiko, en mye større effekt omfang enn det som gitt av felles genotype for
VEGFR
. rs4557213
i sammendraget, har vi utført en vei basert analyse av TGF-beta pathway gener og blærekreft risiko. Disse dataene gir viktig genetisk informasjon for å forutsi individer med risiko for blærekreft og identifisering av tumorer ved et tidlig behandlingstrinn. I tillegg er våre relativt omfattende spørring av TGF-beta pathway polymorfismer og vår store befolkning med detaljert informasjon om risiko gir betydelige bevis for involvering av SNPs som predikator eller modulatorer av blærekreft risiko. Det er imidlertid noen begrensninger i vår studie. For eksempel, ytterligere finkartlegging og funksjonelle analyser er nødvendige for å avsløre mulige molekylære mekanismer for disse SNPs eller andre tilknyttede kausale polymorfismer. I tillegg er bare Kaukasiere ble inkludert i denne studien. Det ville være interessant å eksamen disse SNPs i minoritetsbefolkningen. Til slutt, selv om våre data er i stor grad internt validert, fremtidige replikering studier i uavhengige populasjoner for å validere noen av resultatene.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
utvalgte gener fra TGF-β vei for denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0051758.s001 plakater (DOC)
