Abstract
TRAIL er et lovende terapeutisk middel for menneske maligniteter. TRAIL krever ofte mitokondriell dysfunksjon, referert til som type II-reseptoren død vei, for å fremme cytotoksisitet. Imidlertid, mange ondartede cellene er resistente TRAIL grunn av hemming av denne mitokondrielle veien. Bruke kolangiokarsinom celler som en modell av TRAIL motstand, fant vi at Hedgehog signale blokade lysfølsomt disse kreftcellene til TRAIL cytotoksisitet uavhengig av mitokondriell dysfunksjon, referert til som Type I døden reseptor signalisering. Denne bryteren i krav TRAIL fra Type II til type I hjel reseptorsignalisering ble demonstrert ved mangelen på funksjonell avhengighet av bud /Bim og Bax /Bak, proapoptotiske komponenter i mitokondrie pathway. Pinnsvin signale modulert ekspresjon av X-bundet hemmer av apoptose (XIAP), som tjener til å undertrykke den type I-reseptor død pathway. siRNA målrettet knockdown av
XIAP
ligner allergi til mitokondriene uavhengig TRAIL drap oppnås ved Hedgehog hemming. Regulering av XIAP uttrykk ved Hedgehog signalering mediert av gliom-assosiert onkogen 2 (GLI2), en nedstrøms transkripsjonsfaktor på pinnsvin. I konklusjonen, disse dataene gi ytterligere mekanismer moduler celledød av TRAIL og foreslå Hedgehog hemming som en terapeutisk tilnærming for TRAIL-resistente svulster
Citation. Kurita S, Mott JL, Cazanave SC, Fingas CD, Guicciardi ME, Bronk SF, et al. (2011) Hedgehog Hemming Fremmer en bryter fra Type II til Type I celledød Receptor signale i kreftceller. PLoS ONE 6 (3): e18330. doi: 10,1371 /journal.pone.0018330
Redaktør: Andreas Bergmann, University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 04.01.2011; Godkjent: 25 februar 2011; Publisert: 31 mars 2011
Copyright: © 2011 Kurita et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health R01 Grants DK59427 (GJG), Seksjon for onkologi Research, Mayo Clinic Cancer Center, Mayo Clinic bukspyttkjertelen SPORE P50 CA102701, og Mayo Clinic Senter for Cell Signaling i Gastroenterology NIDDK P30 DK084567 (MEF-Z) og Mayo Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL), en potent død ligand som fortrinnsvis induserer apoptose i transformerte celler, initierer signalisering kaskader ved ligering av to døds reseptorer, DR4 (TNFRSF10A, også referert til som TRAIL-reseptor 1) og DR5 (TNFRSF10B, også referert til som TRAIL-reseptor 2 /KILLER /trick-2) [1]. TRAIL-indusert clustering og oligomerisering av DR4 og DR5 resultater i konformasjonsendringer av døds domener i deres cytoplasmatiske haler, tilrettelegging rekruttering og aktivering av caspases 8 og 10 i løpet av en død indusere signale kompleks (DISC) [2], [3], [ ,,,0],4]. Hvis aktiveringen av disse initiator caspaser er tilstrekkelig robust, de direkte aktiverer kaspase 3, som i sin tur resulterer i cellulær død ved såkalt type I reseptor død pathway av apoptose [5], [6]. Dersom imidlertid størrelsen av kaspase 8 og 10 aktivering er ikke tilstrekkelig til å direkte aktivere kaspase 3, kan TRAIL likevel indusere apoptose ved spalting av proapoptotiske BH3-bare protein Bud å generere avkortet Bud (tBID). tBid protein utløser mitokondrie ytre membran permeabilization ved å fremme oligomerisering av den pro-apoptotiske Bcl-2 familien proteiner Bak og /eller Bax innenfor denne membranen. Mitokondrie ytre membran permeabilization resulterer i utslipp av pro-apoptotiske proteiner fra mitokondrie intermembrane plass (dvs., cytokrom c, Smac /DIABLO, HtrA2, AIF, og endonuklease G), som kulminerer i den mitokondrielle vei av apoptose [7], [8 ]; avhengigheten av mitokondriell dysfunksjon for celledød betegnes som type II-reseptoren død vei av apoptose [6]. Type I død reseptorsignalisering ser ut til å bli regulert i høyde med caspase-3-aktivering, mens type II død reseptorsignalisering reguleres på nivået av mitokondrier av medlemmer av antiapoptotic Bcl-2-protein familien [7], [8], [ ,,,0],9], [10]. TRAIL signaliserer vanligvis gjennom Type II, mitokondrier-avhengige reaksjonsveien [11], en bane som ofte hemmet in cancer som fører til TRAIL motstand [12], [13].
Heri viser vi at inhibering av onkogene Hedgehog pathway undertrykker uttrykk for XIAP og sensitizes kreftceller til TRAIL cytotoksisitet, ved hjelp kolangiokarsinom celler som en modell for å studere TRAIL motstand. Disse kreftceller uttrykker klink antiapoptotic Bcl-2-familieproteiner, spesielt MCL-1, som medierer resistens TRAIL [14], [15]. MCL-en hemming av mitokondrie vei av celledød er spesielt relevant for kolangiokarsinom celler som de paradoksalt uttrykke TRAIL
in vivo
, og sannsynligvis må kontinuerlig omgå TRAIL cytotoksiske system for å overleve [16]. Gitt den nye data impliserer onkogene Hedgehog signalisering i gastrointestinal tumorbiologi [17], [18], vi utforsket Hedgehog signalering som en mekanisme som bidrar til TRAIL motstand av kreftceller. Vi har tidligere rapportert at pinnsvin reaksjonsvei er konstitutivt aktiv i disse cellene, og at dens inhibering sensitizes kolangiokarsinom celler til TRAIL cytotoksisitet sammenfallende med oppregulering av TRAIL reseptoren DR4 [19]. Imidlertid var det uklart hvordan oppregulering av DR4 alene kan overvinne den Mcl-en blokade av mitokondriell vei av apoptose. I denne studien har vi vist at nedregulering av XIAP av Hedgehog hemming konverterer Type II TRAIL signalering til et Type I sti. Dermed våre data definere en mekanisme som Hedgehog signale modulerer TRAIL-indusert celledød i kreftceller og foreslå hemming av denne kaskade som potensiell terapeutisk tilnærming for TRAIL-resistente svulster ..
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
The Mayo Clinic IRB komiteen gjennomgått og godkjent for studier på mennesker i protokollen med tittelen «Genome uttrykk analyse av menneskelig kolangiokarsinom (CCC).» Utvalget fastslått at dette utgjør minimal risiko forskning. Data ble analysert anonymt.
Cell Kultur
Den menneskelige kolangiokarsinom cellelinjer, KMCH, HuCCT-en, og Mz-cha-en, ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum, 100.000 enheter /l penicillin, 100 mg /l streptomycin og 100 mg /l gentamicin som tidligere beskrevet [20], [21].
kvantitativ revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT- PCR)
Total RNA ble isolert fra celler ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), og cDNA ble fremstilt ved anvendelse av tilfeldige primere og Moloney murin leukemivirus revers transkriptase som tidligere er beskrevet i detalj [22]. CDNA-produktet ble amplifisert ved PCR med Taq DNA-polymerase ved bruk av standardprotokoller. PCR-primere er vist i tabell 1. Primere for 18S ribosomal RNA (rRNA) ble anskaffet fra Ambion Inc. (Austin, TX). Real-time PCR ble utført med Roche LightCycler hjelp SYBR grønt som fluorophore som tidligere beskrevet [20]. Kopien antall målet mRNA i hver prøve ble normalisert som et forhold med kopiantallet for 18S rRNA i nevneren.
immunoblotanalyse
Hel-cellelysater ble oppnådd som tidligere beskrevet av oss i detalj [21]. Proteinprøver ble oppløst ved SDS-PAGE-geler, overført til nitrocellulosemembraner, og blottet med de angitte primære antistoffer ved en fortynning på 1: 500 til 1: 1000. Peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer (Biosource International, Camarillo, CA) ble inkubert i en fortynning på 1: 3000 til 1: 5000. Bundet antistoff ble visualisert ved hjelp av forbedrede Chemiluminescence reagenser (Amersham, Arlington Heights, IL) og Kodak X-OMAT film (Eastman Kodak, Rochester, New York). Primær sera ble de hevet til aktin, BCL-2, Bcl-x, Mcl-en, og glattes (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA: C11, B19, S18, S19, og H-300, henholdsvis), Bud og CIAP-en (R
Bax, etter 5′-AAG ACG AAC TGG ACA GTA ACA CCT GTC TC-3 «(delvis T7-promoter sekvens er fet). Som en kontroll ble cellene transfektert med en kodet RNA-dupleks med den følgende sekvens: 5»-AAC GTG ATT TAT GTC ACC AGA-3 «. Kort, celler dyrket i 6-brønners skåler ble transient transfektert med 30 nM siRNA bruker 5 mL /ml SIPORT
TM NeoFX
TM (Ambion Inc.). Target protein uttrykk ble vurdert av immunoblot analyse etter transfeksjon med siRNA.
Kort hårnål RNA (shRNA) for Bud var fra Sigma Aldrich [MISSION kort hårnål RNA lentiviral plasmid, målretting nukleotider 376-396, Genebank tiltredelse # NM_001196 ]. For å generere Bim målrettet shRNA-konstruksjon, ble det pSSH1 plasmid inneholdende den humane H1 promoter for ekspresjon av shRNA anvendes. Et dobbeltkjedet DNA-templat (5′-GAT CCC CGC AAT AGG CTT TAG GAA AAT TCA AGA GAT TTT CCT AAA GCC TAT TGC TTT TTG GAA A-3 «) ble innsatt i plasmidet pSSH1 etter H1 RNA promoter. DNA-innskuddet inneholder fornuft og antisense sekvenser (fet skrift) for Bim mRNA og en 9-nukleotid linker sekvens, som gir transkripsjon av en shRNA targeting Bim. For stabil transfeksjon ble KMCH-celler transfektert ved hjelp av OPTI-MEM I (GIBCO-Invitrogen, Carlsbad, CA) inneholdende 5 pl /ml LipofectAMINE 2000 (Invitrogen), og 3 ug /ml plasmid DNA. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble frisk medium som inneholder 2 mg /ml puromycin tilsatt for shRNA plasmid målretting Bud eller 1,2 g /l neomycin ble lagt for shRNA plasmid målretting Bim. Overlevende kloner ble separert ved hjelp av kloning ringer og ble individuelt dyrket. Lentiviral partikler som inneholder shRNA til SMO ble bygget ved hjelp av BLOCK-iT induserbar H1 Lentiviral RNAi System (Invitrogen), etter produsentens protokoll. Sekvenser (satt inn pLenti4 /BLOCK-iT-MÅL) ble avbildet som tidligere beskrevet av oss [19]. For stabil transfeksjon, friskt medium inneholdende 10 mikrogram /ml Blasticidine-S og 500 mikrogram /ml Zeocin (Invitrogen) ble tilsatt til cellene 48 timer etter transduksjon. Overlevende kloner ble separert ved hjelp av kloning ringer og ble individuelt dyrket. Expression ble indusert med 1 mg /ml tetracyklin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Etter ytterligere 48 timer ble cellene anvendt for eksperimenter. Target undertrykkelse ble vurdert av immunoblot analyse.
Elektro mobilitet shift analyse (EMSA)
Nuclear celle ekstrakter ble fremstilt ved bruk NE-PER kjernefysiske og cytoplasma utvinnings reagenser (Pierce, Rockford, IL) i henhold til produsentens instruksjoner. For EMSA, ble 20 ug av nukleære proteiner inkubert ved romtemperatur i 20 min i bindingsbuffer (25 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM EDTA, 6% glycerol, 0,1% Triton X-100, 0,1 mM fenylmetylsulfonyl fluorid, 0,4 mM ditiotreitol, 0,5 ug /ul poly (di-dC), 0,5 ug /ul laksesperma) med 0,04 pmol av Cy5.5-merket dobbelttrådet DNA oligonukleotid (syntetisert ved Mayo Clinic Advanced Technology Genomics Core, Rochester MN) inneholdende villtype putative GLI-bindende sekvenser innenfor promoter-regionen av humant
XIAP
genet. Protein-DNA-kompleksene ble separert fra det ubundne DNA-probe ved elektroforese gjennom 5% innfødte polyakrylamidgeler inneholdende 0,5 x Tris-borat EDTA. Fluorescens ble visualisert direkte på gel ved hjelp av en Odyssey fluorescerende imager (Licor biovitenskap, Lincoln, NE). For konkurrerende analyser, ble en 200-gangers molart overskudd av umerket dobbeltkjedet oligonukleotid tilsatt til reaksjonsblandingen 20 minutter før tilsetning av den fluorescerende probe.
Chromatin Immunoutfelling
brikken ble utført fra KMCH celler behandlet med 250 nM rekombinant Sonic Hedgehog i 5 timer med totalt cellulært DNA skåret til ca. 500 bp fragmenter, ved hjelp ExactaCHIP kromatin immunoprecipitation kit (R Rev:. 5 «CATCTCTCCATGCTCTGAACTC
Statistical Analysis
Alle data som representere i det minste tre uavhengige forsøk og er uttrykt som gjennomsnitt ± SE. Forskjeller mellom grupper ble sammenliknet med ANOVA med Bonferroni post hoc korreksjon
Materialer
reagenser ble kjøpt fra følgende leverandører:. DAPI var fra Sigma; rekombinant humant TRAIL og rekombinant Sonic Hedgehog var fra R anti-humant Fas-antistoff (CH-11) var fra MBL International (Nagoya, Japan); cyclopamine var fra LC Laboratories (Woburn, MA).
Resultater
glattet hemming nedregulerer CIAP-en og XIAP uttrykk
Gitt en sentral mekanistisk rolle for inhibitor av apoptose proteiner (RSU) i døden reseptor signalisering [23] og rollen Hedgehog i mobilnettet overleve, må vi først konstatert hvis inhibering glattet (SMO), signalkomponenten i Hedgehog reseptor kompleks, modulerer uttrykk for tilgangspunkter. Behandling med cyclopamine, et veletablert farmakologiske inhibitor av SMO [24], [25], nedsatt cellulær IAP-1 (CIAP-1) og X-bundet IAP (XIAP) proteinnivåer, men hadde ingen virkning på CIAP-2-proteinet uttrykk. Nedregulering av XIAP var raskere, forekommer i løpet av 4 timer, mens tap av CIAP-1-proteinet oppstått bare etter 24 timer (fig. 1A). Den farmakologiske effekten av cyclopamine ble validert ved å benytte shRNA målrettet knockdown av SMO, en signalkomponent av pinnsvin-reseptoren, noe som også ble redusert både CIAP-1 og XIAP cellulær proteinnivåer, men ikke CIAP-2 (Fig. 1B). For å avgjøre om SMO hemming påvirkes mRNA nivåer eller handlet utelukkende etter transcriptionally,
CIAP-en
,
CIAP-2
, og
XIAP
mRNA uttrykk ble bestemt etter cyclopamine behandling eller shRNA til SMO. Begge
XIAP Hotell og
CIAP-en
mRNA nivåer ble redusert med SMO hemming (Fig 1C.). Den kliniske relevansen av IAP regulering ble vurdert i svulsten og tilstøtende godartede prøver fra pasienter med kolangiokarsinom. En to-fold økning i
XIAP
mRNA nivåer ble observert i svulstvev (Fig. 1 D). Nivåene av
CIAP-en
og
-2
var ikke signifikant forskjellig. Det
CIAP-en
står ikke på tumorprøver til tross for regulering av Hedgehog (Fig. 1C) kan indikere ytterligere som ennå-ukjente faktorer bidrar også til kontroll av IAP uttrykk i svulsten. Disse dataene antyder the Hedgehog signalveien regulerer
CIAP-1 Hotell og
XIAP
uttrykk, men som bare
XIAP
nivåer er forhøyet i kliniske prøver. Derfor har vi i stor grad fokusert på
XIAP
for resten av våre studier.
A; Eksporter Cellelysater fra KMCH celler behandlet med cyclopamine (5 mm) i de angitte tidsrom ble immunoblottet for CIAP-1, CIAP-2 og XIAP. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting.
B, etter KMCH celler ble transfektert med et tetracyklin-induserbar shRNA ekspresjonsvektor målretting glattet (shSMO) eller en kryptert shRNA vektor; shRNA-ekspresjon ble indusert i 48 timer etter behandling med tetracyklin (1 mg /ml) fulgt av immunoblotting for CIAP-1, CIAP-2 og XIAP ved hjelp av helcellelysater.
C
, Cellene ble behandlet med kjøretøy, cyclopamine (5 mm) i 24 timer, eller transfektert med shSMO som i panelet
B, etter deretter analysert ved real-time RT-PCR for
CIAP-en
,
CIAP-2 Hotell og
XIAP
hjelp total RNA.
D
, Total RNA fra vevsprøver av enten kolangiokarsinom (CCA) eller ved godartet leveren ble brukt for å vurdere
XIAP, CIAP-en, og CIAP-2
mRNA uttrykk, normalisert til 18S og uttrykt som fold endring fra godartet. Gjennomsnitt ± SEM, * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 sammenlignet med kjøretøy
GLI2 binder til
XIAP
promoter og regulerer uttrykket
For å finne ut om
XIAP
er transcriptionally regulert av Hedgehog-responsive GLI transkripsjonsfaktorer, vi søkte på 5 Kb 5′-flankerende område av den menneskelige
XIAP
genet for 5′
GACCACCCAXXXXG
-3 «GLI konsensus bindende motiv. To lovende kandidat GLI-bindingsseter (Fig. 2A) ble identifisert oppstrøms for
XIAP
transkripsjon start hotellet (NM_001167) i posisjonene -2820 /-2807 (Site I) og -1594 /-1581 (Site II ). Hver hadde to mistilpasninger i forhold til konsensussekvensen [26]; Side I er identisk med den validerte 9-nukleotid-Bcl-2 GLI-bindingssete, BS1 [27], mens Side II er identisk med den bekreftede DR4 GLI-bindingssete [19]. Vi utførte elektro mobilitet skift analyse eksperimenter. Binding til begge antatte GLI bindende sekvenser ble observert i atom ekstrakter fra KMCH celler. Mobiliteten forskyvning av CY 5,5-merket probe kan forhindres ved tilsetning av et 200-gangers molart overskudd av umerket probe (konkurrent, Fig. 2B). Av de tre GLI familiemedlemmer, siRNA til GLI2 forårsaket en signifikant reduksjon i XIAP proteinekspresjon mens siRNA til GLI1 eller GLI3 endret ikke XIAP nivåer (Fig. 2C). For å fastslå om GLIS binder seg til
XIAP
arrangøren, vi utførte kromatin immunoutfellingsstudier eksperimenter for å vurdere okkupasjon av endogen
XIAP
arrangøren bruker antistoffer mot GLI1, GLI2, og GLI3. Binding av GLI2 ble observert ved bruk av primere som forsterker Side I (fig. 2D). Kontroll IgG ga ikke et produkt, viser spesifisiteten av antisera som brukes, og positiv-kontroll promoter områder demonstrerte forventet okkupasjon av GLI1 og GLI2 (
BCL-2
promoter), og GLI3 (
GLI1
promoter). Disse dataene antyder at Hedgehog direkte regulerer
XIAP
uttrykk ved GLI2 transkripsjonsfaktor binding til nettstedet jeg i
XIAP
promoter.
A, etter Antatte GLI bindingsseter i XIAP promoter regionen. Nukleotid posisjonene ble regnet fra transkripsjon start hotellet (TSS). Potensielle bindingsseter ble observert som antydet med piler på skjematisk (I og II).
B; Eksporter Nuclear proteinekstrakter ble isolert fra KMCH celler. EMSA ble utført ved anvendelse Cy5.5-merkede dobbelt-trådede oligonukleotider inneholdende de antatte GLI bindingssekvenser innenfor den humane XIAP promoteren, og konkurrerende eksperimenter med 200-gangers molart overskudd kald oligonukleotider som beskrevet under «MATERIALER OG METODER».
C
, totalt, cellulært protein, ble isolert 48 timer etter transient transfeksjon med den angitte siRNA mot GLI familiemedlemmer. XIAP proteinekspresjon ble bestemt ved immunblotting og signalet ble kvantifisert ved densitometri som et forhold til aktin uttrykk.
D, etter Chromatin immunoprecipitation bruker antiserum til GLI1, GLI2, GLI3, eller en kontroll IgG ble utført etterfulgt av PCR hjelp primere flankerer stedet jeg (341 bp) i
XIAP
promoter-regionen, som indikert. Som en positiv kontroll, ble ChIP utført ved hjelp av primere flankerer
BCL-2
promoter GLI-bindingssetet (GLI1 og GLI2), eller primere flankerer GLI3 bindingssetet i
GLI1
promoter.
Sensibilisering av Hedgehog hemming er uavhengig av mitokondrielle apoptotiske meklere, Bud /Bim eller Bax /Bak
XIAP er en viktig discriminator for å konvertere Type II til Type i døden reseptor signalisering [9 ], derfor vurderte vi tap av XIAP protein som en mekanisme som Hedgehog hemming sensibiliserte kolangiokarsinom celler til Trail-indusert apoptose. Bud og Bim er viktige signalmellomprodukter i Type II proapoptotiske død reseptor signalisering [28], [29]. Basert på denne informasjonen, vi neste konstatert hvis Hedgehog hemming sensibilisert celler til TRAIL cytotoksisitet i fravær av Bud eller Bim. shRNA konstruerer målretting Bud og Bim effektivt slått ned de respektive cellulære protein nivåer (Fig. 3A). Den nesten fullstendig taushet av bud eller Bim protein nivåer ble funksjonelt bekreftet ved å dra nytte av den observasjon at Fas Type II død reseptor signalisering er avhengig av Bud eller Bim [30]. Faktisk, Bud eller Bim knockdown var tilstrekkelig til å hemme Fas-indusert celledød av den agonistiske antistoff CH-11 (Fig. 3B og 3C), et klassisk type II veien til celledød [31]. Dermed, hvis TRAIL-indusert celledød i cyclopamine-sensibiliserte celler var avhengig av type II signalering, så Bud eller Bim lyddemping bør likeledes beskytte mot TRAIL cytotoksisitet. Men til tross for fraværet av Bud eller Bim, the Hedgehog inhibitor cyclopamine fortsatt lysfølsomt menneskelige kolangiokarsinom celler til TRAIL-indusert celledød (Fig. 3D og 3E).
A, etter immunoblotanalyse ble utført på helcellelysater hentet fra KMCH celler stabilt transfektert med den spesifikke shRNA rettet mot
Bud
eller
Bim, etter å bruke angitte sera. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting.
B
, KMCH celler som er stabilt transfektert med salgskurser eller Bim-shRNA og utransfekterte paren KMCH-celler ble behandlet med Fas-agonistisk antistoff CH-11 (100 ug /ml) i 5 timer etterfulgt av DAPI farging. Celler med apoptotisk morfologi ble talt opp. Gjennomsnitt ± SEM, *** p 0,001 sammenlignet med foreldre celler behandlet med CH-11.
C, etter Parallelt caspase-3/7 aktivitet ble målt i celler behandlet som i panelet
B
. Gjennomsnitt ± SEM, *** p 0,001.
D
ble KMCH celler stabilt transfektert med salgskurser eller Bim-shRNA forbehandlet med bil eller cyclopamine (5 mm) i 24 timer, og deretter behandlet med TRAIL (5 ng /ml) i 5 timer fulgt av DAPI farging. Celler med apoptotisk morfologi ble talt opp. Gjennomsnitt ± SEM, *** p 0,001 sammenlignet med celler behandlet med TRAIL alene.
E
, KMCH stabile cellelinjer ble behandlet som i panelet
D
, og etter 5 timer caspase-3/7 aktivitet ble målt. Gjennomsnitt ± SEM, *** p 0,001 sammenlignet med celler behandlet med TRAIL alene.
F
, helcellelysater fra KMCH, HuCCT-en, og Mz-cha-1 celler behandlet med kjøretøy eller cyclopamine (5 mm) i 24 timer ble analysert ved immunoblot hjelp av anti-BCL-2, Mcl- 1, eller Bcl-x antisera. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting.
G
, Whole cellelysater ble oppnådd fra shBid-, shBim- og utransfekterte paren KMCH celler behandlet med bærer eller cyclopamine (5 uM) i 24 timer og ble analysert ved immunblot ved anvendelse av anti-Bcl-2, Mcl- 1, eller Bcl-x antisera. Actin ble brukt som en lasting kontroll.
Fordi en ubalanse mellom anti- og proapoptotiske Bcl-2 familien proteiner ved cyclopamine kunne forklare dens virkninger på sensibiliserende celler til TRAIL drap, vi profilert denne klassen av proteiner ved immunoblotanalyse. Bcl-x
L protein uttrykk var betydelig lavere i KMCH celler enn HuCCT-en eller Mz-cha-1 celler, men ingen av de tre antiapoptotic proteiner (BCL-2, MCL-en, eller BCL-x
L) ble endret ved cyclopamine behandling (fig. 3F). Cyclopamine også endret ikke cellulære protein nivåer av antiapoptotic Bcl-2 familien proteiner i KMCH celler stabilt transfektert med shRNA targeting Bud eller Bim (Fig. 3G). Likeledes gjør SMO hemming ikke endre BH3 kun proteiner eller pro-apoptotiske Bcl-2 familien proteiner, Bax og Bak [19]. Samlet utgjør disse data tyder på at hemming av Hedgehog veien sensitizes menneskelige kolangiokarsinom celler til TRAIL cytotoksisitet av en prosess uavhengig av Bud eller Bim eller endringer i uttrykket av multidomain Bcl-2 familien proteiner. Uavhengigheten til Bud eller Bim foreslo spennende mulighet for at cyclopamine kan sensitiv kolangiokarsinom celler til TRAIL ved å konvertere apoptotisk signalering fra en Type II til en Type I død reseptor sti.
For å teste denne hypotesen, neste fastsatte vi om Hedgehog hemming konverterer Type II død reseptor signalisering til Type i signale. Sine qua non for type I døden reseptorsignalisering er dens mangel på avhengighet av Bax og Bak [32]. Effektiv knockdown av Bax og Bak proteinnivåer ble oppnådd ved siRNA rettet mot (Fig. 4A). Målrettet knockdown av Bax pluss Bak protein virket til å inhibere Fas-mediert apoptose av CH-11 (fig. 4B og 4C), i samsvar med type II signalering. TRAIL alene hadde en liten apoptotisk effekt på KMCH celler som ble effektivt blokkert av Bax /Bak stanse, noe som indikerer at TRAIL normalt dreper kolangiokarsinom celler av Type II pathway (fig. 4D). Men TRAIL-indusert apoptose ble dramatisk økt med cyclopamine (fig. 4D og 4E). Den økte apoptose var helt (Fig. 4E) eller nesten helt (fig. 4D) ufølsom for Bax /Bak lyddemping. Disse dataene antyder at Hedgehog hemming omgår mitokondrie motstand mot TRAIL cytotoksisitet ved å konvertere et Type II signale til et Type I signalveien.
A; Eksporter Hele cellelysater fra KMCH celler transient transfektert med spesifikke siRNA målretting Bax og /eller Bak eller egge siRNA ble oppnådd 48 timer etter transfeksjon og analysert ved immunoblot ved anvendelse av anti-Bax eller anti-Bak antisera. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting.
B
, KMCH celler transient transfektert med Bax- og Bak-siRNA eller egge siRNA ble forbehandlet (24 timer) med middels eller cyclopamine (5 mikrometer) som angitt, deretter behandlet med Fas agonistisk antistoff CH-11 (100 ug /ml) i 5 timer. Celler med apoptotisk kjernefysisk morfologi ble talt opp. Mean +/- SEM; *** P 0,001.
C,
KMCH celler ble behandlet som i panel
B
og caspase-3/7-aktivitet ble målt etter 5 timer. Mean +/- SEM; *** P 0,001
D
ble KMCH celler transient transfektert med Bax- og Bak-siRNA eller egge siRNA forbehandlet med bil eller cyclopamine (5 mm) i 24 timer, og deretter behandlet med TRAIL (5 ng /ml) i 5 timer. Celler med apoptotisk kjernefysisk morfologi ble talt opp. Gjennomsnitt ± SEM, # p 0,05 og *** p 0,001 sammenlignet med celler transfektert med egge siRNA og behandlet med TRAIL.
E
, KMCH celler transient transfektert med angitt siRNA og behandlet som i panelet
D
, ble analysert etter 5 timer for caspase-3/7 aktivitet. Gjennomsnitt ± SEM; *** P. 0,001
knockdown av
XIAP
sensibilisert kolangiokarsinom celler til Trail-indusert apoptose tross hemming av Bud
Deretter bestemmes vi den funksjonelle relevansen av XIAP uttrykk i disse kreftcellene ved hjelp av siRNA-målrettet knockdown av
CIAP-en
eller
XIAP.
Effektiv målretting av CIAP-en og XIAP protein uttrykk ble bekreftet av immunoblot analyse (fig. 5A ). I samsvar med tidligere rapporter [33], [34], [35], [36], knockdown av
XIAP
betydelig sensitivisert cellene til TRAIL cytotoksisitet, mens knockdown av
CIAP-en
bare beskjedent sensibiliserte cellene til TRAIL-fremkalt celledød, målt enten morfologisk (fig. 5B) eller biokjemisk (fig. 5C). Dermed regulering av XIAP uttrykk er en potensiell mekanisme som Hedgehog signale hindrer TRAIL cytotoksisitet.
KMCH celler ble transfektert med egge siRNA eller spesifikke siRNA for
CIAP-en
eller
XIAP
.
En
, helcellelysater var forberedt på immunblot fra KMCH celler 48 timer etter siRNA transfeksjon.
B
, Førti-åtte timer etter transfeksjon som i panelet
En
, celler ble behandlet med humant rekombinant TRAIL (5 ng /ml) eller medium i 5 timer. Cellene ble deretter farget med DAPI og celler med apoptotisk kjernefysisk morfologi ble talt og uttrykt som en prosentandel av det totale kjerner.
C, etter Parallelt celler ble transfektert og behandlet med TRAIL som i panelet
B
, og etter 5 timer caspase-3/7 aktivitet ble målt. Gjennomsnitt ± SEM, * p 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001
Dataene ovenfor er konsistent med en bryter fra Type II til type I reseptor-mediert apoptose av SMO hemming; SMO hemming ser ut til å mekle denne bryteren ved å nedregulere
XIAP
genuttrykk. For å teste denne tolkningen av dataene, har vi designet eksperimenter for å finne ut om knockdown av XIAP protein var tilstrekkelig til å konvertere TRAIL signale til mitokondriene uavhengig, Type I veien. Vi benyttet et lite molekyl hemmer av Bud, BI-6C9, for å omgå mitokondriene avhengig celledød [37]. Først, for å bekrefte at BI-6C9 inhiberte funksjonelt celledød i dette system, KMCH-celler ble forbehandlet med BI-6C9 eller bærer (DMSO), fulgt av Fas-agonistisk antistoff. Faktisk farmakologisk hemming av Bud ved BI-6C9 var tilstrekkelig til å undertrykke Fas-indusert apoptose. Igjen, SMO-inhibering ikke påvirke apoptose av CH-11-behandling (fig. 6A). I motsetning til dette ble BI-6C9 ikke funksjonelt hemme TRAIL-fremkalt celledød i cyclopamine-behandlede celler (Fig. 6B). Viktigere, siRNA rettet mot XIAP også sensibiliserte celler til TRAIL-indusert apoptose, og BI-6C9 ikke redusere celledød (Fig. 6C). Dermed SMO hemming, ved å redusere mobilnettet XIAP protein nivåer, konverterer Type II TRAIL død reseptor signalisering til en Type I sti; en effekt rekapitulert av siRNA målrettet knockdown av
XIAP
.
A, etter KMCH celler ble inkubert i 24 timer i middels eller cyclopamine (5 mm), etterfulgt av behandling med enten bærer (DMSO, sluttkonsentrasjon 0,1% v /v) eller den Bud-inhibitor, BI-6C9 (10 pM) i 1 time.
