Abstract
oppregulert Sirtuin 1 (SIRT1), en NAD
+ – avhengig klasse III histondeacetylase, deacetylates p53 og hemmer dens transkripsjonen aktivitet, noe som fører til celle overlevelse. SIRT1 overekspresjon har vært rapportert å forutsi dårlig overlevelse i enkelte kreftformer, blant annet magekreft. Men antitumoreffekten av SIRT1 hemming forblir unnvikende i magekreft. Her undersøkte vi antitumor mekanismer av et Sirtuin inhibitor, tenovin-6, i syv menneskelige mage kreft cellelinjer (fire cellelinjer med vill-type
TP53
, to med mutant-type
TP53
, og ett med null
TP53
). Interessant, tenovin-6 indusert apoptose i alle cellelinjer, ikke bare de med villtype
TP53, etter men også mutant-type og null versjoner, ledsaget av oppregulering av død reseptor 5 (DR5). I KatoIII cellelinje (
TP53
-null), DR5 lyddemping markert svekket tenovin-6-indusert apoptose, noe som tyder på at den sentrale mekanismen bak sine antitumor effekter er basert på aktivering av død reseptor signalveien. Selv endoplasmatiske retikulum stress forårsaket av Sirtuin hemmere ble rapportert å indusere DR5 oppregulering i andre kreftcellelinjer, kunne vi ikke finne markert aktivering av relaterte molekyler, for eksempel ATF6, ekstra fordel, og CHOP, i magekreftceller behandlet med tenovin- 6. Tenovin-6 i kombinasjon med docetaxel eller SN-38 som utøves en svak til moderat synergistisk cytotoksisitet mot magekreftceller. Som konklusjon, har tenovin-6 potent antitumoraktivitet mot humane magecancerceller via DR5 opp-regulering. Våre resultater bør være nyttig for den fremtidige kliniske utviklingen av Sirtuin hemmere
Citation. Hirai S, Endo S, Saito R, Hirose M, Ueno T, Suzuki H, et al. (2014) Antitumor Virkninger av Sirtuin Inhibitor, Tenovin-6, mot magekreft Cells via Død reseptor 5 Up-forordning. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10,1371 /journal.pone.0102831
Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 28 oktober 2013, Godkjent: 23 juni 2014; Publisert: 17.07.2014
Copyright: © 2014 Hirai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi fra Japan (til IH). Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall rundt om i verden [1], [2]. Selv om ulike chemotherapies for avansert magekreft har blitt utviklet, er fortsatt dårlig og nye kreftmedisiner for magekreft er nødvendig prognosen. Magekreft er en biologisk og genetisk heterogene kreft som involverer en rekke genetiske mutasjoner og epigenetiske alter [3]. Blant disse abnormiteter i
TP53
tumorsuppressorgenet spiller en viktig rolle i tumorigenesis [4], [5]. Omtrent 30% av pasienter med magekreft har
TP53
mutasjon [6]. Selv i kreftceller med villtype (wt)
TP53
, har det blitt rapportert at funksjonen av
TP53
undertrykkes av negativ regulering inkludert ubiquitinering, metylering, og deacetylering [7], [8]. I denne sammenheng ville det være en lovende strategi for å anta at inhibering av disse negative regulatorer resulterer i forbedring av antitumor-effekter ved aktivering av p53 i vekt-
TP53
kreft. Murine dobbel minutt 2 (MDM2) er en viktig fysiologisk antagonist av p53 [7]. Vi har tidligere rapportert at en MDM2 inhibitor, nutlin-3, demonstrerte potente antitumor effekt mot magekreftceller gjennom aktivering av p53 pathway [9]
Sirtuin 1 (SIRT1), en NAD
+ -. Avhengig histondeacetylase (HDAC), har en rekke funksjoner som er involvert i kromatin stanse, lang levetid, og genomisk stabilitet. Det er funnet i kjernen og virker som en sensor for celle metabolske status med hensyn til overlevelse og begynnende alderdom henhold genotoksiske og oksidativt stress [10], [11]. Foruten histone deacetylering, disse funksjonene blant annet avhenge av deacetyleringen av ulike ikke-histonproteinene som inkluderer transkripsjonsfaktorer: p53, gaffelhode boks (FOXO) familie proteiner, nukleær faktor kB, c-myc, N-myc, E2F1, og hypoksi-induserbar transkripsjonsfaktorer (HIF) 1α /2α; kromatin relaterte enzymer: histone acetyltransferase, P300, DNA-avhengig kinase subenhet Ku80, og TIP60; DNA reparasjon av fottøy: Ku70, RAD51, og NBS1; og celle-signal faktorer: STAT3, β-catenin, og Smad7 [11] – [13]. SIRT1 fysiologisk interagerer med p53 og demper dens funksjoner gjennom deacetylering ved sin C-terminale rest Lys382 [12]. Overekspresjon av SIRT1 ble funnet i mange kreftformer, slik som mage og tykktarm [10], [14], og rapportert å virke som en svulst promoter. SIRT2 er en av de cytoplasmatiske NAD
+ – avhengige histon deacetylases og deacetylates histon H3 lysin 56 (H3K56) og α-tubulin. Den deler også ikke-histone substrater av FOXO1, FOXO3 og p53 med SIRT1 [11]. Imidlertid gjenstår det eksakte rolle SIRT2 unnvikende i kreft biologi.
På denne bakgrunn, undersøkte vi om tenovin-6, en liten molekyl forbindelse som hemmer SIRT1 og SIRT2 funksjoner [15], [16], som utøves antitumor effekter gjennom aktivering av p53 sti i magekreftceller. Nylig er det blitt rapportert at SIRT inhibitorer oppregulert døden reseptoren 5 (DR5), et medlem av tumornekrosefaktor-reseptor-familien, ved noen kreftformer [17], [18]. Vi har i tillegg studerte involvering av denne reseptor i antitumoraktivitet av tenovin-6 for magekreft. Videre undersøkte vi synergien av tenovin-6 med konvensjonelle cytotoksiske medikamenter for fremtiden klinisk utvikling i magekreft.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Seven magekreftcelle linjer ble anvendt: fire cellelinjer med wt
TP53 plakater (MKN-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), to cellelinjer med mutant-type (mt)
TP53
(NUGC-3, STKM-1), og en cellelinje med null
TP53 plakater (KatoIII) [19] – [21]. Cellelinjer med wt
TP53 plakater (MCF-7 brystcancer, HEK293 humane embryonale nyreceller) og MRC-5 normale humane fibroblaster ble inkludert som kontroller i denne studien. MKN-45, NUGC-4, KatoIII, og MRC-5 cellelinjer ble hentet fra Riken BRC Cell Bank (Tsukuba, Japan). SNU-1 og MCF-7 cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). NUGC-3 og HEK293 cellelinjer ble innhentet fra helsevitenskap Forskning Resources Bank (Osaka, Japan). STKM-en og STKM-2 cellelinjer ble vennlig levert av Dr. Shunsuke Yanoma (Yokohama City University, School of Medicine, Japan).
Kjemi
Tenovin-6 ble kjøpt fra Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Docetaxel, SN-38, cisplatin, 5-fluoruracil (5-FU), doksorubicin og thapsigargin ble oppnådd fra Wako (Osaka, Japan). De ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) ved en konsentrasjon på 20 mM, og aliquoter ble lagret ved -20 ° C. Stamløsninger ble fortynnet til de ønskede sluttkonsentrasjoner med vekstmedium før bruk.
Antistoffer og Western blot-analyse
SDS-polyaclylamidegel elektroforese og Western blotting ble utført som tidligere beskrevet [22]. De primære og sekundære antistoffer som ble brukt var som følger. Kanin polyklonale antistoffer mot SIRT1 (D739), acetylert (Ac) -p53 (Lys382), fosforylert (Phospho) -p53 (Ser15), BCL-2, Ac-α-tubulin (Lys40), død reseptor 5 (DR5), Fas -associated død domene (FADD), kløyvde poly (ADP) -ribose polymerase (PARP) (Asp214) og mus monoklonale antistoffer mot p21
Waf /Cip1 plakater (DCS60), histon H3 (96C10) , β-aktin (8H10D10), α -tubulin (DM1A) og C /EBP homolog protein (CHOP) (L63F7), og kanin monoklonale antistoffer mot TRAIL (C92B9), caspase-3 (8G10), inositol-krever enzym (IRE ) 1α (14C10), og fosfo-RNA-avhengig proteinkinase-lignende endoplasmatiske retikulum kinase (PERK) (16F8) ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Monoklonalt antistoff mot p53 (BP53-12) ble kjøpt fra Cell Science (Canton, MA), anti-SIRT2 (4B11) monoklonalt antistoff var fra Sigma-Aldrich. (St. Louis, MO), og anti-aktiverende transkripsjonsfaktor 6 (ATF6) monoklonalt antistoff (70B1413.1) var fra Enzo Life Science (Farmingdale, New York). Kanin polyklonale antistoff mot Ac-histon H3 (Lys18) var fra Merck Millipore (Rica, MA). Både pepperrot peroksidase (HRP) konjugert anti-mus IgG sau og anti-kanin-IgG esel sera var fra GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Antistoffbinding ble påvist ved hjelp av en ECL Prime Western blotting Detection System (GE Healthcare), i samsvar med produsentens protokoll. Signalet intensiteten ble kvantifisert ved hjelp av Ez-fangst II chemiluminescence bildesystem (Atto, Tokyo, Japan).
Real-time kvantitativ PCR for analyse av
SIRT1 Hotell og
SIRT2
genekspresjon
RNA prøver ble hentet fra cellelysat ved hjelp av en høy Pure RNA Isolation kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), i samsvar med produsentens anvisninger. Etter at genomisk DNA ble fjernet ved DNase, ble cDNA fremstilt ved bruk av en høykapasitets-RNA til cDNA-sett (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Real-time kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av et Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California). Grunning og TaqMan probe for
SIRT1 Hotell og
SIRT2
ble oppnådd fra Applied Biosystems (analysen ID: Hs01009005 og henholdsvis Hs00247263,), og de for
18S ribosomalt RNA (18S rRNA)
designet og syntetisert av Sigma-Aldrich var som følger: 5′-AACCCGTTGAACCCCATTCG (forover primer), 5′-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (revers primer), 5′-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (probe). Reaksjoner ble utført in triplo under standard termocykling betingelser ved anvendelse av 30 ng cDNA, 900 nM primere, 250 nM prober, og et Taqman Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems), i henhold til produsentens protokoll.
RNA ekstrahert fra celler ble analysert for de relative mengder av mål-genet (
SIRT1, SIRT2
) og referansegenet (
18S rRNA
) ved kvantitativ real-time PCR.
WST-8 celleviabilitet analyser
WST-8 kolorimetriske analysene ble utført ved hjelp av en Cell Counting Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japan), i samsvar med produsentens protokoll. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 5 x 10
3-celler per brønn med 100 ul kulturmedium i 24 timer, behandlet med tenovin-6 i 72 timer, inkubert i nærvær av WST-8, og deretter analysert med et iMark mikroplateleser (Bio-Rad, Hercules, CA).
Analyse av apoptose ved flowcytometri
Cellene ble sådd ut i 60-mm skåler i en tetthet på 5 x 10
5 per parabolen. Etter inkubasjon med tenovin-6 (10 pM) eller en ekvivalent mengde av DMSO i 72 timer, ble cellene forsiktig løftet med Accutase (US Biotechnologies, Parker Ford, PA) ved romtemperatur i 10 min. Cellene ble deretter vasket en gang med fosfatbufret saltvann. Apoptotiske celler ble påvist ved dobbel farging med propidiumjodid (PI) og fluorescein-isotiocyanat (FITC) -merket annexin V ved hjelp av en Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (Beckman Coulter, Brea, CA) i henhold til produsentens protokoll. Flowcytometrisk analyse ble deretter utført med en FACS Calibur flowcytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) og Cellquest programvare (BD Biosciences).
siRNA målretting
DR5
siRNA rettet mot DR5 er designet ved hjelp siDirect programvare (https://sidirect2.rnai.jp/), som rapportert tidligere [22]. siRNA transfeksjon ble utført med Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, California), i henhold til produsentens instruksjoner. Kontroll siRNA var en kunstig sekvens utformet for å ha minst homologi med humane og musegener. De sense- og antisense tråder av siRNA brukt i denne studien var som følger: DR5, 5′-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 «(sense), 5′-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3′ (antisense); kontroll siRNA, 5»-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 «(sense), 5′-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3» (antisens).
For analyse av effekten av siRNA på cellevekst og levedyktighet ble cellene sådd ut i en lav tetthet (1 x 10
3-celler per brønn) i 96-brønners plater inneholdende 100 ul av RPMI 1640 medium med 10% føtalt kalveserum (Sigma-Aldrich). Levedyktigheten av transfekterte celler ble vurdert 72 og 120 timer etter transfeksjon av WST-8 analysen.
Kombinasjons index
For å finne ut om tenovin-6 kan forsterke antitumor effekt av konvensjonelle kjemoterapeutika, vi brukes en kombinasjon indeks (CI) og en isobologram beregnet ved bruk CalcuSyn programvare (Cambridge, UK), i henhold til Chou og Talalay median virkning prinsipp [23]. I denne analysen CI 1,3 indikerer antagonisme; KI = 1.1-1.3 moderat antagonisme; KI = 0,9-1,1 additiv effekt; KI = 0,8-0,9 liten synergisme; KI = 0,6-0,8 moderat synergisme; KI = 0,4-0,6 synergisme; og CI = 0,2-0,4 sterk synergisme.
Statistisk analyse
Alle forsøk ble utført in triplo, og ble gjentatt minst tre ganger. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Signifikansen av forskjeller ble bestemt ved t-test og Dunnetts test.
p
-verdier 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
Expression of SIRT1, SIRT2, og acetylert (Ac) -p53 i magekreft cellelinjer
.
Først undersøkte vi uttrykket nivåer av SIRT1, SIRT2, og Ac-p53 i sju magekreftcellelinjer. Vi brukte HEK293-celler for den positive kontrollen av SIRT1 /2, og MCF-7-celler behandlet med doksorubicin for den positive kontrollen av Ac-p53 [24]. Alle gastrisk cancer cellelinjer med unntak av NUGC-4 og STKM-1-celler uttrykte høye nivåer av SIRT1 protein, og SIRT2 ekspresjonsnivåene var lav i alle cellelinjer med unntak av MKN-45-celler (figur 1A). Ac-p53 uttrykk nivåer var svært lav i alle magekreftcellelinjer med vekt
TP53
A:. Uttrykket av SIRT1, SIRT2, p53, Ac-p53, og fosfor-53 i syv mage kreft cellelinjer og MRC-5 fibroblaster ble undersøkt ved Western blotting. Semi-kvantifisering av Western blotting densitometry involvert normalisering p-aktin nivåer. MCF-7 *: MCF-7-celler behandlet med doxorubicin (1 uM, 24 h). B: Uttrykk for
SIRT1
mRNA og
SIRT2
mRNA i magekreftceller. Nivåer av
SIRT1
mRNA og
SIRT2
mRNA ble bestemt i magekreftceller og MRC-5 fibroblaster av kvantitativ real-time PCR og normalisert til nivået av
18S
rRNA . mRNA nivåer er vist i forhold til de av MRC-5 fibroblaster.
Vi analyserte genuttrykket av
SIRT1 Hotell og
SIRT2
av sanntids kvantitativ PCR. MKN-45 celler utstilt
SIRT1
genekspresjon som var 2,5 ganger høyere enn i fibroblaster, men andre magekreft cellelinjer ikke (figur 1B). I NUGC-4 celler, nivået av genuttrykk av
SIRT1
var lav, som var SIRT1 protein. MKN-45 celler viste litt høy
SIRT2
genekspresjon, mens andre cellelinjer viste heller lave nivåer.
Tenovin-6 hemmet veksten av magekreftceller
For for å bekrefte tenovin-6 aktivitet, studerte vi om tenovin-seks påvirket acetylering av histon H3 og α-tubulin. Tenovin-6 økte acetylering av histon i tre (MKN-45, NUGC-4, og KatoIII) av de fire magecancercellelinjene som ble testet, noe som indikerer inhibering av SIRT1 deacetylering aktivitet (figur 2A). Ac-α-tubulin økte bare i en cellelinje (MKN-45) som ble behandlet med tenovin-6, derav hemming av SIRT2 deacetylering aktivitet ikke kunne definitivt vist i magekreftceller
. Gastric kreftceller var dyrket med tenovin-6 (10 pM) i forskjellige tidsperioder og analysert for nivået av SIRT1, SIRT2, Ac-H3, og Ac-α-tubulin ved Western blotting. B: Tenovin-6 hemmet veksten av magekreftceller uansett
TP53
status. Alle forsøk ble vurdert ved WST-8-analysen og utført i tre eksemplarer. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. C: WST-8-analysen ble utført i MRC-5-celler til å sammenligne toksisiteten av tenovin-6 til kreftcellelinjer. Veksthemmingen av tenovin-6 i NUGC-4-celler var signifikant høyere enn den i MRC-5-celler. Betydningen av forskjellene ble evaluert ved hjelp av t-test.
Deretter vurderte vi potensialet anti-tumor effekt av tenovin-6 mot mage kreftceller. Hver magecancer-cellelinjen ble dyrket i nærvær av tenovin-6 (0,2, 1, 5, 10, 20, og 50 uM) i tre dager. Doseavhengig veksthemming ble observert i alle cellelinjer, ikke bare de med vekt
TP53
men også mt og null versjoner (figur 2B). Deres IC
50-verdier varierte 2,34 til 4,28 mikrometer. I tillegg ble WST-8-målingen ble utført i den humane fibroblastcellelinje MRC-5 (IC
50: 6,09 uM) for å sammenligne toksisiteten av tenovin-6 overfor magekreftcellelinjer. Levedyktigheten til NUGC-4-celler behandlet med tenovin-6 var signifikant lavere enn for MRC-5-celler, som vist i figur 2C.
Tenovin-6 indusert apoptotisk celledød i magekreftceller
Som vist i figur 3A og S1, tenovin-6-behandlingen økte ekspresjon av p53 og p21 i vekt-
TP53
celler (MKN45 og NUGC-4). Oppregulering av Ac-p53 ble vist i MKN-45-celler, men ikke i NUGC-4-celler. Økt p21 uttrykk ble også observert i mt
TP53
celler (NUGC-3). I motsetning til dette har bcl-2-ekspresjon ikke endre seg i nesten alle fire mage cancer-cellelinjer. Økning av DR5 og spaltet PARP-ekspresjon ble observert i alle cellelinjene som ble testet. Nivåene av uttrykk for TRAIL, som fungerer som en ligand i koblings død signalering, ble noe økt i alle cellelinjene, selv uttrykk for FADD, en viktig adapter, ikke ble påvirket av tenovin-6.
En : Time-kurs analyse av ekspresjonen av p53, dens nedstrøms molekyl p21
Waf /Cip1
, og apoptose-relaterte molekyler i magekreftceller behandlet med tenovin-6 (10 pM). Den relative intensitet av proteinene «ekspresjon er vist i figur S1. Tenovin-6 indusert ekspresjon av Ac-p53 og p21
Waf /Cip1
, men ikke BCL-2. DR5 uttrykk ble sterkt indusert av tenovin-6. TRAIL, og kløyvde PARP ble noe økt, men FADD uttrykk ble ikke påvirket. En dublett av DR5 viser sin forløper (øvre band) og modne isoformer (lavere band). B: Fire cellelinjer ble behandlet med tenovin-6 (10 pM) eller et bærerkontroll i 72 timer, dobbelt-farget med FITC-annexin V og PI, og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Den statistiske signifikans av forskjeller mellom grupper ble evaluert ved bruk av Student t-test. *
p
0,01; **
p
. 0,05
Vi undersøkte om tenovin-6 redusert levedyktighet av magekreftceller gjennom induksjon av apoptotisk celledød. Kreftceller ble utsatt for den ved en konsentrasjon på 10 pM eller en ekvivalent mengde av kontroll bærer (DMSO) i 72 timer og så farget med FITC-annexin V og PI. De ble analysert ved hjelp av strømningscytometri: celler negative for begge annexin V og PI ble ansett for å være ikke-apoptotiske celler som var positive for annexin V bare ble ansett for å være tidlig apoptotisk, og cellene positive for både annexin V og PI ble ansett for å være for sent apoptotiske eller nekrotiske. Eksponering av MKN-45-celler til tenovin-6 økte fraksjoner av tidlige og sene faser av apoptose fra 2,8% til 52,1%, og fra 1,8% til 18,5%, respektivt (figur 3B). Tilsvarende økninger i befolkningen i tidlige og sene faser av apoptose ble observert i andre cellelinjer (NUGC-4, NUGC-3, og KatoIII). Tenovin-6 indusert apoptose i alle cellelinjene som ble testet, uavhengig av
TP53
status.
Effekt av
DR5
knockdown på tenovin-6-indusert apoptose
Neste, for å verifisere hvorvidt
DR5
lyddemping påvirkes tenovin-6-indusert apoptose, celle-levedyktighet og apoptotisk hastighet ble analysert ved hjelp av WST-8-analysen og flowcytometri, henholdsvis, i
TP53
-null KatoIII celler. Inhibering av DR5-ekspresjon av spesifikke siRNA (figur 4A) signifikant redusert tenovin-6-indusert celledød og apoptose i KatoIII celler (figur 4B og 4C). Vi brukte tre forskjellige sirnas i vår innledende forsøk, og vi fikk lignende resultater med noen sirnas
A:. KatoIII celler ble transfektert med 1 nM siRNA kontroll eller siRNA mot DR5 mRNA. Førtiåtte timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 5 uM tenovin-6 i 24 timer. Western blotting viste nedregulering av DR5 ved siRNA transfeksjon. En dublett av DR5 viser sin forløper (øvre band) og modne isoformer (lavere band). B: Celler ble transfektert med 1 nM siRNA kontroll eller DR5 siRNA i 48 timer, behandlet med 0,2, 1, 5 pM og tenovin-6 i 72 timer og deretter underkastet celle-levedyktighet målinger av WST-8-analyse. Den statistiske signifikans av forskjeller mellom grupper ble evaluert ved bruk av Student t-test. *
p
0,01; **
p
0,05. C: Effekten av DR5 knockdown på tenovin-6 indusert apoptose ble analysert ved flowcytometri hjelp PI farging. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Den statistiske signifikans av forskjeller mellom gruppene ble evaluert ved hjelp av t-test.
Vi undersøkte aktivering av det endoplasmatiske retikulum (ER) stresset vei, som er knyttet til DR5 oppregulering, som tidligere rapportert [ ,,,0],17]. CHOP er en av de mest potent induser av DR5 og oppstrøms av apoptose, og ofte frigjøres under ER stress. Som vist i figur 5A og 5B, selv om CHOP var marginalt oppregulert ved tenovin-6 behandling i alle fire gastrisk kreft-cellelinjer, den økte nivåer var signifikant lavere enn det i kontroll-celler behandlet med thapsigargin, som er en selektiv inhibitor av sarkoplasmatiske /endoplasmatiske retikulum Ca
2+ – ATPaser og mye brukt som en mobil ER stressor [25], [26]. På den andre hånd, IRE1, som er en ER stress-sensor, og lokalisert ved oppstrøms for CHOP, var litt opp-regulert av tenovin-6 behandling i alle cellelinjer, men ikke fosforylert PERK og ATF6. [27], [28]. Det virket usannsynlig at tenovin-6 forårsaket ER stress fører til DR5 induksjon i våre magekreftceller
A.: Ekspresjon av proteiner forbundet med ER stress i magecancercellelinjene før og etter behandling med 10 uM tenovin-6 . Thapsigargin på 3 uM ble administrert til HEK293-celler som en kontroll. En dublett av DR5 viser sin forløper og modne isoformer. B: Relativ intensitet av ekspresjon av CHOP i cellelinjene som ble testet er vist. Den statistiske signifikans av forskjeller mellom gruppene ble evaluert med Dunnetts test.
Antitumoreffekt av tenovin-6 i kombinasjon med kjemoterapi
Til slutt, vi undersøkt om tenovin-seks forbedret antitumor virkningene av kjemoterapeutiske midler, inkludert docetaxel, SN-38, cisplatin, og 5-FU, i magecancercellelinjer. Fire cellelinjer med vekt
TP53 plakater (MKN-45, NUGC-4), mt
TP53 plakater (NUGC-3), og null
TP53 plakater (KatoIII) ble behandlet med disse midler alene eller i kombinasjon med to doser (2 og 5 um) av tenovin-6. Konsentrasjonene var 0,25 nM docetaxel, 1 nM SN-38, 0,5 eller 1 mikrometer cisplatin, og 0,25 mikrometer 5-FU. Som vist i tabell 1 (og fig S2), docetaxel og SN-38 viste en svak til moderat synergistisk effekt på tenovin-6-behandling i tre cellelinjer, og cisplatin med tenovin-6 viste en moderat synergistisk virkning i to cellelinjer, mens 5-FU i kombinasjon med tenovin-6 viste en lavere effekt enn de andre agenter. Vi undersøkte uttrykk for DR5 etter administrering av tenovin-6 med kjemoterapeutika. DR5 oppregulering av tenovin-6 ble forsterket med en kombinasjon av docetaxel i MKN-45 celler (Figur S3).
Diskusjoner
Vi viste at tenovin-6 viste potent antitumor aktivitet ledsaget av apoptotisk celledød i menneskelige mage kreftceller med vekt
TP53
samt de med mt
TP53
. Flere spesifikke inhibitorer av sirtuins, slik som sirtinol, suramin, salermide, og thiobarbiturates, ble rapportert å hemme cellevekst i forskjellige typer av kreft [29]. De fleste forskere beskrev antitumor-virkningene av Sirtuin inhibitorer i cellelinjer med wt
TP53 product: [15], [29] – [31], og tilskrives disse til aktivering av apoptose ved acetylering av p53. Samtidig ble flere rapporter utgitt de siste årene som viste antitumor aktiviteter Sirtuin hemmere i cellelinjer med mt
TP53
gjennom p53-uavhengig trasé [17], [18]. Vi viste at DR5 knockdown dempes antitumor effektene av tenovin-6 i
TP53
-null mage kreftceller. Aktivering av død reseptor signalveien via oppregulering av DR5 spiller en sentral rolle i tenovin-6-indusert celledød, som nevnt i andre rapporter om Sirtuin hemmere.
Det har blitt rapportert at salermide forbedret DR5 uttrykk og indusert apoptose i humane ikke-småcellet lungekreft celler bærer mt
TP53 product: [17]. I denne rapporten, samtidig stanse av
SIRT1 Hotell og
SIRT2
samt salermide oppregulert DR5, ledsaget av oppregulering av ER stressrelaterte proteiner, slik som ATF4 og CHOP. Disse resultatene antydet at ER stress var involvert i denne DR5 induksjon. Vi spekulert i at tenovin-6 også ført til en økning av DR5 uttrykk via aktivering av ER stress mediert av ekstra fordel, IRE1, ATF6, og CHOP. Men i motsetning til forventningene, signalveien fra ER stress aktivert av tenovin-6 var ikke åpenbart detektert. Likevel, det var klare bevis på at DR5 ble indusert av tenovin-6. Det finnes andre veier for CHOP-mediert DR5 oppregulering: reaktive oksygenarter (ROS), c-Jun NH
2-terminal kinase (JNK) reaksjonsveien, p38 mitogen-aktivert protein kinase pathway, og så videre [ ,,,0],32] – [38]. Vi har imidlertid ikke undersøke disse banene her fordi vi ikke kunne identifisere CHOP aktivering i vår studie. Våre resultater tyder på at andre p53- og CHOP-uavhengige trasé delta i tenovin-6-indusert DR5 uttrykk i magekreftceller.
Vi viste at tenovin-6 indusert apoptotisk celledød gjennom aktivering av DR5 veien. Imidlertid, p53 og CHOP trasé virket usannsynlig å være involvert i denne DR5 induksjon, og mekanismen for DR5 opp-regulering er fortsatt uklar. Vi har nylig undersøkte antitumor effekter av tenovin-6 i flere tykktarm kreft cellelinjer, og funnet sin potent antitumor aktivitet mot de fleste av dem med oppregulering av DR5 samt [39]. Men i CaCo2 tykktarmskreftceller (mt
TP53
), apoptotisk celledød ved tenovin-6 var mindre tydelig og DR5 uttrykk var ikke sterkt oppregulert. CaCo2-celle har blitt rapportert for å uttrykke høy grad av varmesjokkproteiner som er kjent som en suppressor av DR5 [40] – [43]. Dette forholdet bør studeres videre i fremtiden. SIRT1 kan deacetylate histon H4 lysin 16 (H4K16) samt H3K9, H3K14, og H1K26, som er nært knyttet til genet Slå [11]. I tillegg har mange tilsvarende ikke-histon underlag: transkripsjonfaktorer, DNA-reparasjonsmaskinelementer, nukleære reseptorer, histon-modifiserende enzymer, og cellesignalmolekyler, som beskrevet andre steder [11] – [13]. Disse mange og kompliserte sammenslutninger av SIRT1 aktivitet er involvert i en rekke biologiske funksjoner, for eksempel regulering av genekspresjon og DNA-skade reparasjon. Kreftceller har en tendens til å kreve disse funksjonene SIRT1 for å overleve, spre seg, og reparere katastrofale genomisk skade. Nyere studier har identifisert evne til tenovin-6 for å indusere differensiering og inhiberer autofagi som en del av sin anti-neoplastiske effekt i leukemiceller [44], [45]. Det kan avhenge av kreft celle atferd hvordan tenovin-6 påvirker neoplastisk aktivitet. Videre studier er nødvendig for å avklare sammenhengen mellom tenovin-6-mediert død sti og komplekse roller SIRT1.
Vi undersøkte effekten av å kombinere docetaxel, SN-38, cisplatin og 5-FU med tenovin -6 fordi de har blitt mye brukt for behandling av pasienter med avansert magekreft [46], [47]. Svakt til moderat synergieffekter av docetaxel og SN-38 med tenovin-6 i mage kreft cellelinjer, uavhengig av
TP53
status, ble funnet.
Selv om behandling innebærer en kombinasjon av docetaxel og Sirtuin hemmere er ikke blitt rapportert, kombinasjoner av docetaxel og andre HDAC hemmere som trichostatin A og suberoylanilide hydroxaminsyren (Saha) har blitt rapportert å ha synergieffekter knyttet til caspaseaktivering eller tubulin acetylering i flere kreftcellelinjer [48] – [50] . I vår studie, er det fortsatt uklart om tubulin acetylering av tenovin-6 alltid påvirket antitumor effekt, fordi tubulin acetylering ble vist bare i en cellelinje. SN-38 (den aktive form av irinotecan) er en DNA-topoisomerase I-inhibitor som virker bare i S-fasen og griper inn med DNA-replikasjon og celledelingen [51], [52]. HDAC hemmere indusere acetylering av histoner og løsne kromatinstruktur, hvor topoisomeraseinhibitoren kan lettere få tilgang til DNA, tilrettelegging for DNA-skade [51], [53]. I tillegg har en bemerkelsesverdig økning av ROS generasjon er rapportert i små-cellelungecancerceller ved samtidig eksponering for Saha og topotekan (et derivat av camptothecin) [51]. Den økte styrken til behandling kombinere tenovin-6 og SN-38 kan være tilordnet samarbeidende regulering av DNA-skade responsen.
Fordelen ved kombinert behandling med tenovin-6 og cisplatin eller 5-FU var mindre enn det med de andre agentene i mage kreftceller, selv om flere rapporter har vist forbedring av apoptose ved kombinasjonsbehandling med cisplatin eller 5-FU og andre HDAC hemmere i andre svulster [54] -. [57]
Når det gjelder den toksisitet evaluering av tenovin-6, vi brukte en fibroblastcellelinje som de alternative ikke-tumorigene celler for å forutsi toksisitet mot normale celler henviser til tidligere rapporter [15], [18]. Det var vanskelig å finne en passende normal kontroll for sammenlignende studier, og er derfor definitivt behov for å undersøke toksisiteten av tenovin-6 (i kombinasjon med anti-kreft legemidler)
in vivo
, ved hjelp av animalske xenograft-modeller.
I konklusjonen, en Sirtuin inhibitor, tenovin-6, viste en robust antitumor effekt mot menneskelige mage kreftceller. Dette var uavhengig av
TP53
status og ble indusert via oppregulering av DR5. Videre studier er nødvendig for å avklare mekanismen som tenovin-6 regulerer DR5 uttrykk.
