Abstract
Enkelte onkolytiske virus utnytter aktivert Ras signalering for å gjenskape i kreftceller. Konstitutiv aktivering av Ras /MEK reaksjonsveien er kjent for å undertrykke virkningen av interferon (IFN) antiviral respons, noe som kan bidra til Ras-avhengig viral oncolysis. Her har vi identifisert 10 humane cancercellelinjer (av 16) med økt sensitivitet for de antivirale virkninger av IFN-α etter behandling med MEK-inhibitor U0126, noe som tyder på at Ras /MEK reaksjonsveien ligger til grunn for deres redusert følsomhet overfor IFN. For å finne ut hvordan Ras /MEK undertrykker IFN respons i disse cellene, brukte vi DNA-mikromatriser å sammenligne IFN-indusert transkripsjon i IFN-sensitive SKOV3 celler, moderat resistente HT1080 celler, og HT1080 celler behandlet med U0126. Vi har funnet at 267 gener ble indusert av IFN i SKOV3-celler, mens bare 98 gener ble indusert i HT1080-celler på samme tidspunkt. Videre er uttrykk for en distinkt undergruppe av IFN induserbare gener, som inkluderte Rigi, GBP2, IFIT2, BTN3A3, MAP2, MMP7 og STAT2, ble restaurert eller økt i HT1080 celler når cellene ble samtidig behandling med U0126 og IFN. Bioinformatiske analyse av de biologiske prosesser som representeres av disse genene viste økt representasjon av gener som er involvert i den antivirale respons, regulering av apoptose, celledifferensiering og metabolisme. Videre er innføringen av konstitutivt aktiv Ras til IFN-sensitive SKOV3-celler reduserte IFN følsomhet og evne til å aktivere IFN-indusert transkripsjon. Dette arbeidet viser for første gang at aktivert Ras /MEK i humane kreftceller induserer nedregulering av en bestemt undergruppe av IFN-induserbare gener
Citation. Christian SL, Zu D, Licursi M, Komatsu Y, Pongnopparat T , Codner DA, et al. (2012) Undertrykkelse av IFN-indusert transkripsjon ligger bak IFN Defekter generert av Aktivert Ras /MEK i humane kreftceller. PLoS ONE 7 (9): e44267. doi: 10,1371 /journal.pone.0044267
Redaktør: Elankumaran Subbiah, Virginia Polytechnic Institute og State University, USA
mottatt: May 18, 2012; Godkjent: 31 juli 2012; Publisert: 07.09.2012
Copyright: © Christian et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av kanadiske Institutes for Health Research (www.cihr-irsc.gc.ca), Grant tall MOP74429 og ROP99020. SLC ble støttet av en trainee pris fra Beatrice Hunter Cancer Research Institute med midler gitt av Cancer Research Training Program som en del av The Terry Fox Foundation Strategic Health Research Training Program i Cancer Research ved CIHR (www.bhcri.ca). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Onkolytiske virus spesifikt replikere i kreftcellene, men ikke i normale celler, ved å utnytte forskjeller i den intracellulære miljø av tumorceller som fremmer unormal cellevekst [1], [2], [3], [4] . Konstitutiv aktivering av Ras-signalisering ble opprinnelig rapportert å bli brukt av onkolytiske reovirus for å øke dens replikativ evne til [5]. Etter oppdagelsen av reovirus oncolysis, andre virus, slik som villtype-herpes simplex virus (HSV) [6], vesicular stomatitis virus (VSV) [4], influensavirus (delNS1 stamme) [7], adenovirus (VAI mutant) [ ,,,0],8], ble poliovirus [9], og Newcastle disease virus [10] funnet å utnytte likeledes aktivert Ras-signalreaksjonsveien for oncolysis. Ras er et membranbundet GTP-bindende protein som virker som en molekylær bryter for å aktivere nedstrøms veier å regulere proliferasjon, differensiering og vekst [11]. I den kanoniske Ras vei, aktiverer GTP-bundet Ras sin nedstrøms megler, den Raf kinase. Aktivert Raf deretter fosforylerer og aktiverer MEK1 /2 kinaser, som fosforylerer og aktiverer den ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) 1 og 2. ERK1 /2 kan deretter aktivere eller hemme transkripsjonsfaktorer for å fremme celle overlevelse og spredning [12]. Aktiverende mutasjoner i Ras har blitt funnet hos ca 30% av alle humane tumorer [13]. Videre, i fravær av den aktive mutasjon av Ras, Ras-reaksjonsveien er ofte aktivert ved feilaktig aktivering av dens oppstrømssignalkomponenter, så som epidermal vekstfaktor-reseptor, HER2 /neu og Src [14].
Multiple cellulær mekanismer som ligger til grunn Ras avhengig viral oncolysis er identifisert. Inhibering av det antivirale double-strand RNA-aktivert proteinkinase (PKR) av Ras ble opprinnelig beskrevet som en viktig mekanisme for onkolytisk virusreplikasjon i tumorceller [5], [6]. Det har også blitt vist at aktivert Ras fremmer avkapsling og frigjøring av onkolytiske reovirus som øker produksjonen av avkoms virus [15]. Ras aktivering forbedrer også effektiviteten av cap-uavhengig oversettelse av onkolytiske poliovirus [9]. Videre har vi og en annen gruppe rapporterte at aktivering av Ras-reaksjonsveien kan forhindre effektiv aktivering av type I interferon (IFN) antiviral respons i humane kreftceller og mus fibroblast-celler [16], [17], [18], noe som tyder at mangelen av IFN respons indusert av aktivert Ras er en av de vanlige mekanismer for viral oncolysis.
IFN utskilles cytokiner som har flere virkninger i kroppen, inkludert anti-viral, anti-proliferative og immunmodulerende rolle. Som sådan, er IFN anvendes ved behandling av virussykdommer slik som hepatitt C virus-infeksjon, behandling av kreft og multippel sklerose. IFN binder til IFN-α-reseptor (IFNAR) [19] som fører til aktivering av to tyrosin-kinaser, Janus kinase 1 (Jak1) og tyrosin-kinase 2 (Tyk2) som er forbundet med IFNAR [20], [21]. Jak1 og Tyk2 deretter fosforylere signal transduser og aktivator av transkripsjon (STAT) 1 og STAT2, som deretter forbinder med det DNA-bindende protein IFN regulerende faktor 9 (IRF9), for å danne en heterotrimeric transkripsjonsfaktor betegnet IFN-stimulert gen faktoren 3 (ISGF3) [22], [23]. Binding av ISGF3 til IFN-stimulert responselement (SBR) i promotorene til IFN-induserbare gener som induserer ekspresjon av hundrevis av gener kollektivt kjent som IFN-stimulerte gener (ISG), mange med anti-viral, anti-proliferative og immunmoduler funksjoner [24]. Imidlertid kan effekten av IFN være begrenset av anti-IFN-proteiner kodet av virale genomer eller ved endogene cellulære undertrykkere som regulerer IFN signalering [21].
Vi har tidligere vist at et IFN sensitive virus, VSV, var i stand replikere i NIH3T3-celler med aktivert Ras /MEK mens IFN forhindres infeksjon av kontroll NIH3T3-celler [16]. Noser et. al. [25] også rapportert at inhibering av Ras /MEK i humane kreftcellelinjer gjenantivirale responser indusert av IFN. Disse studiene viser tydelig at Ras /MEK aktivering ligger bak IFN svekkelse i kreftceller. I en oppfølgingsstudie fant vi at aktivert Ras /MEK trykkes transkripsjon av STAT2, som er en av de grunnleggende IFN signaliserer komponenter [17]. IFN-mediert beskyttelse mot virus infeksjon ble bare delvis restaurert i RasV12 transform NIH3T3 celler med overekspresjon av STAT2. Imidlertid, når det Ras /MEK reaksjonsveien ble hemmet av MEK-inhibitor U0126 i RasV12 celler, IFN var like effektiv i å indusere en antiviral respons som i vektorkontrollceller. Derfor er det usannsynlig at nedregulering av ekspresjon STAT2 er den eneste mekanisme som er involvert i Ras /MEK mediert IFN undertrykkelse. Her, for ytterligere å identifisere mekanismen av Ras-mediert hemming av IFN respons, analyserte vi involvering av Ras /MEK vei i å regulere IFN-indusert transkripsjon i humane kreftcellelinjer.
Resultater
Følsomhet of human cancer Cell Lines til IFN-induserte antiviral respons
Først valgte vi 16 kreftcellelinjer avledet fra forskjellige typer svulst (3 bryst, en cervical, 4 tykktarm, en fibrosarkom, 2 melanom , 3 ovarie og 2 prostata cellelinjer) og målte deres respons til anti-viral effekt indusert av IFN. Cellene ble behandlet med IFN (0, 10, 50, 100, 500, 1000 og 5000 U /ml) i 16 timer og deretter utfordret med VSV ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 1 til 24 timer. Den samlede oncolysis ble evaluert ved hjelp av krystallfiolett farging. På grunnlag av den effektive dose (cytopatisk effekt (CPE) 50) av IFN, som er definert som den effektive IFN konsentrasjon som frembringer en 50% beskyttelse mot VSV infeksjon ble cellelinjene delt inn i følgende tre grupper: IFN-sensitive: cellelinjer med CPE50 mindre enn 10 U /ml IFN moderat motstandsdyktig: cellelinjer med CPE50 mellom 10 til 5000 U /ml, og IFN fullstendig motstandsdyktig: cellelinjer med CPE50 over den maksimale konsentrasjonen av IFN vi testet (5000 U /ml) (fig . 1). Som vist i tabell 1, tre cellelinjer (HeLa, SKBR3 og SKOV3) var følsomme for IFN mens 9 cellelinjer (A375, DLD-1, HT29, HTB129, HT1080, MCF-7, MDAH, MDA-MB468 og SW48) viste moderat resistens overfor IFN-behandling. I motsetning til dette har 4 cellelinjer (DU145, HCT116, LnCap og PA-1) ikke svare på IFN innenfor konsentrasjonsområdet IFN undersøkes.
IFN-sensitive (A), moderat resistente (B) og fullstendig motstandsdyktig -cellelinjer (C) ble identifisert ved forbehandling av celler med IFN (0, 10, 50, 100, 500, 1000 og 5000 U /ml) i 16 timer og deretter utfordret med VSV ved en MOI på 1 i 24 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av krystallfiolett-farging, og uttrykt som gjennomsnittlig prosentandel i forhold til de uinfiserte kontrollbrønner (n = 3 brønner). En representant eksperimentet er vist.
Restaurering av IFN følsomhet ved MEK Hemming i IFN Moderat eller fullstendig resistente kreftcellelinjer
Vi neste fastslått om aktivering av Ras /MEK sti reduserer IFN-induserte antiviral respons på IFN moderat eller fullstendig resistente kreftcellelinjer. IFN-sensitiviteter til cellelinjene som ble undersøkt i nærvær av en MEK-inhibitor U0126. Cellene ble behandlet med IFN (0, 12,5, 25, 50, 200, 500 og 2000 U /ml) og U0126 (0, 2,5, 5, 10 og 20 uM) i 16 timer og deretter utfordret med VSV ved en MOI på 1 i 24 timer. Infeksjonen ble kvalitativt bedømt ved western blot-analyse av den virale VSV-G-protein. Effektiviteten av U0126 på MEK inhibering ble bekreftet ved analyse av ERK-fosforylering, det primære målet for MEK [13]. MEK hemming økte følsomheten av 10 kreftcellelinjer til IFN (A375, DLD-en, DU145, HCT116, HT1080, HT29, HTB129, MDA468, MDAH og PA-1) (U0126 responsiv cellelinjer), men hadde ingen effekt i tre cancer-cellelinjer (LnCap, MCF7 og SW48) (U0126 ikke-reagerende cellelinjer) (fig. 2 og S1 fig.). For eksempel, VSV replikert i HT1080-celler i nærvær av IFN (50 og 200 U /ml), mens VSV replikasjon ble inhibert i celler behandlet med den samme mengde av IFN i kombinasjon med U0126 behandling (Fig. 2A). HT1080-celler hadde også noe redusert VSV infeksjon i nærvær av 20 uM U0126 alene. Tilsvarende ble IFN-induserte antiviral respons gjengitt i HT29, HCT116 og MDAH celler når Ras /MEK reaksjonsveien inhiberes av U0126. I kontrast, gjorde vi ikke observere restaurering av IFN-induserte antiviral respons ved hvilken som helst kombinasjon av konsentrasjoner av U0126 og IFN i LNCaP og MCF7 celler som tyder på at deres IFN motstanden reguleres av andre enn aktivert Ras /MEK sti cellulære faktorer. Den samme analyse ble utført for å undersøke fremming av IFN-induserte antiviral respons i de andre cellelinjer (A375, DLD-1, DU145, HTB129, MDA468, PA-1 og SW48) (fig. S1).
(A) cellelinjer ble infisert med VSV (MOI = 1) i 24 timer etter behandling med IFN (0-5000 U /ml) med eller uten U0126 (0-20 uM) i 16 timer. Western blot-analyse ble anvendt for å detektere virale protein (VSV-G) -nivåer, nivået av fosforylert ERK (p-ERK) med GAPDH anvendt som en lasting kontroll. Prøvene ble analysert på to membraner som samtidig under anvendelse av identiske betingelser for inkubering og deteksjon. En representant eksperiment av tre er vist. (B) Viral avkom produksjon ble bestemt etter infeksjon med VSV (MOI = 1) i 24 timer etter behandling med IFN (50 eller 2000 U /ml) og med U0126 (0, 5, 10 eller 20 uM) i 16 timer.
Restaureringen av antiviral respons ved MEK hemming i de fire U0126-responsive cellelinjer ble bekreftet av avkom virus analyse (fig. 2B). HT1080-celler, infisert med VSV, viste en signifikant reduksjon i virus-avkom produksjon med kombinasjonsbehandling med IFN (50 U /ml) og alt konsentrasjonen av U0126 (5, 10 og 20 uM). Videre U0126 (20 mm) alene viste en beskjeden, men statistisk signifikant reduksjon av virus avkom. I de andre cellelinjer (HT29, HCT116 og MDAH), viste den kombinerte IFN og U0126 behandling en betydelig og statistisk signifikant reduksjon av virus avkom produksjon sammenlignet med IFN bare eller U0126 eneste behandling som indikerer økt respons til IFN ved MEK-hemning.
Disse resultater indikerer at aktivering av Ras /MEK reaksjonsveien undertrykker IFN-induserte anti-viral aktivitet på enkelte kreftcellelinjer. Vi fant ingen sammenheng mellom enten IFN respons eller U0126 respons, og kreft celletyper.
Effekt av Ras /MEK Hemming på IFN-indusert transkripsjon
For å studere hvordan aktivert Ras /MEK undertrykker IFN respons i humane kreftceller, gjennomførte vi global genekspresjon analyse og identifiserte gener med statistisk økt uttrykk i forhold til ubehandlet tids matchet kontrollgruppe (se saksdokumenter [Fil S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7] for fullstendige lister av forskjellig uttrykt gener). Først, sammenlignet vi ekspresjon av IFN-induserbare gener i IFN-sensitive SKOV3-celler og moderat resistente HT1080-celler (fig. 3A). Ved IFN stimulering i 6 timer, ble 267 gener oppregulert i SKOV3 celler, mens bare 98 gener ble indusert i HT1080 celler. Sytti gener ble indusert vanlig i både SKOV3 og HT1080 celler mens 197 IFN induserbare gener ble oppregulert bare i SKOV3 celler og 28 IFN induserbare gener bare i HT1080 celler. Disse resultater viser at IFN-indusert transkripsjon blir undertrykket i IFN moderat resistente HT1080-celler sammenlignet med IFN-sensitive SKOV3-celler.
(A) Venn-diagrammer fra DNA mikromatriseanalyse som viser global undertrykkelse av IFN-regulerte gener i HT1080-celler sammenlignet til SKOV3 celler. Vist er antallet gener signifikant oppregulert (FDR 0,01) etter 6 timer etter IFN-behandling i de SKOV3 vs HT1080 cellelinjer. (B) Venn-diagrammer som viser antallet gener signifikant oppregulert (FDR 0,01) i HT1080-celler etter behandling med IFN, U0126 eller begge IFN og U0126 i 6 timer eller 12 timer som indikert. (C) Venn-diagrammer som sammenligner genene oppregulert med «beskyttende» behandlinger i hver celletype (IFN for SKOV3 celler og IFN /U0126 for HT1080 celler).
Vi så bestemt om hemming av Ras /MEK kunne endre transcriptional responsen av HT1080 celler til IFN. IFN eneste behandling aktivert transkripsjon av 98 gener i 6 timer og 167 gener på 12 timer mens U0126 eneste behandling indusert ekspresjon av gener ved 636 i 6 timer og 97 gener ved 12 timer (fig. 3B). Kombinert behandling av IFN og U0126 indusert transkripsjon av 652 gener i 6 timer og 354 gener på 12 timer. Disse resultater viser at aktivert MEK undertrykker IFN-indusert transkripsjon i IFN moderat motstandsdyktig HT1080-celler. Interessant nok har vi funnet 111 gener på 6 timer (Tabell S1) og 135 gener ved 12 timer (Tabell S2) ble signifikant indusert ved hjelp av den kombinerte behandling med IFN og U0126 mens hver behandling alene induserte ikke ekspresjon, noe som viser sann synergistisk regulering av genekspresjon av IFN og Ras /MEK undertrykkelse. Disse genene inkluderer mediatorer for anti-viral funksjon (f.eks. Apobec3 [26], IFIT2 [27], [28], [29], RSAD2 (viperin) [30], GBP2 [31] og MAP2 [32], [33 ], [34]), aktivatorer av anti-virus-signaltransduksjon, (f.eks. RIGI [35]), regulatorer av antigen prosessering og presentasjon (f.eks. IFI30 (forgylt) [36], BTN3A3 [37] og PSME1 [38] ), og regulatorer i tumorgenesen (f.eks. MMP7 [39]). Siden VSV replikert mer enn 30 ganger mindre effektivt i HT1080-celler behandlet med IFN og U0126 sammenlignet med de som ble behandlet med IFN bare eller U0126 bare (fig. 2B), mener vi at noen av genene oppregulert ved den kombinerte behandling i HT1080-celler (111 gener på 6 timer 135 genene ved 12 timer) har en betydelig antiviral funksjon. Deretter sammen gener som induseres i HT1080 ved den kombinerte behandling av IFN og U0126 til de som er indusert i SKOV3-celler med IFN eneste behandling for ytterligere å innskrenke hvilke gener kan være de essensielle gener som er nødvendige for en beskyttende anti-viral IFN respons (fig. 3C ). Vi fant at 36 gener ble oftest indusert ved 6 timer og 26 gener på 12 timer, i de to forsøksgruppene (tabell S3).
Gene ontologi (GO) analyse ble utført for å bestemme den biologiske prosessen forbundet med genene er identifisert som vesentlig endret i HT1080-celler behandlet med IFN bare, U0126 bare, og både IFN og U0126 (tabell 2 og fig. 4). Behandling med U0126 eller både IFN og U0126 i 6 timer gruppert sammen som indikerer at disse behandlingene forandret uttrykket av gener med lignende funksjoner (GO overrepresentasjon). Tilsvarende 12 timers behandlinger med U0126 alene eller kombinert behandling resulterte i de mest ligner gå over-representasjon grupper. IFN-bare behandlingsgruppene (6 og 12 timer) gruppert sammen sannsynlig fordi et relativt lite antall GO kategorier endret i forhold til de andre behandlingsgruppene. Totalt sett gener falt i 312 GO kategorier som ble assosiert med 3 GO overrepresentasjon klynger der klynge 3 kan videre deles inn i 11 under klynger. Klynger 1, viste 3A, 3B, 3D og 3I økt GO overrepresentasjon i respons til kombinert U0126 og IFN behandling i forhold til hver behandling alene. Disse klyngene inkludert GÅ kategorier assosiert med NF-kB signalering, anti-viral respons, immunrespons, regulering av apoptose, chemokine signalering, cellulær utvikling, og metabolisme. I motsetning til dette hadde klynger 3C, 3E, 3F, 3H og 3K redusert GO-over-representasjonskategorier ved kombinert behandling, noe som indikerer at tilsetningen av IFN stimulering resulterte i tap av genregulering av gener som tilhører GO kategorier forbundet med celle motilitet, DNA-reparasjon og celledeling. Derfor endrer MEK-hemning typer gener som kan bli indusert av IFN-behandling i tillegg til å øke det totale antall gener som induseres.
Gener med signifikant oppregulert eller nedregulert ekspresjonsnivåer i forhold til kontroll ble analysert med henblikk overrepresentasjon av GO kategori i forhold til det som ble observert i genomet. Betydelig overrepresentert GO kategorier (FDR 0,05) er vist med høyest FDR = 0 vises i rødt og kategorier med FDR ≥0.05 eller fraværende vist i blått
Sammen utgjør disse analysene tyder på det. Ras /MEK reaksjonsveien undertrykker ekspresjon av ISGs involvert i antiviral respons på flere nivåer, inkludert deteksjon av patogene tilhørende mønster, aktivering av den anti-virale signaleringskaskade og direkte antivirale effektor-gener.
Validering av Restaurering av IFN indusert Gene Expression av MEK Hemming
Kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR) ble utført for å bekrefte endringene i genuttrykk observert i microarray analyse ved hjelp av HT1080 celler behandlet med IFN og /eller U0126 (fig. 5 ). Åtte gener (IFIT2, GBP2, MAP2, Rigi, STAT2, BTN3A3, MMP7 og ID2) ble valgt på grunnlag av deres biologiske funksjoner og genuttrykk endringer i respons til IFN og /eller U0126 behandling. IFIT2, GBP2, MAP2 og MMP7 ble oppregulert bare i HT1080-celler behandlet med både U0126 og IFN etter 6 timer, mens geninduksjon ble observert i IFN bare og U0126 bare grupper på det senere tidspunkt (12 timer). BTN3A3 ble indusert ved den kombinerte behandling ved begge tidspunkter, men ikke ved U0126 bare eller IFN eneste behandling. Videre Ras /MEK inhibering av U0126 var i stand til å fremme genekspresjon av RIGI og STAT2 i 12 timer i fravær av IFN, som tidligere beskrevet [17], [40]. Vi fant at ID2, som ikke er et IFN-induserbar-genet, ble oppregulert bare ved U0126 behandling og den kombinerte behandling, men ikke ved IFN-behandling. De fleste av de forandringer i gen-ekspresjon ble bekreftet ved RT-qPCR, men på grunn av forskjellen i følsomhet og statistisk styrke av de to forskjellige teknikker, ikke alle gen forandringer ble funnet å være statistisk signifikant i begge analysene. For eksempel ble RIGI funnet å være indusert i HT1080-celler med IFN eneste behandling ved hjelp av RT-qPCR, men ikke i den mikromatriseanalyse.
nivået av genekspresjon i HT1080-celler forblir ubehandlet, behandlet med IFN (50 U /ml), med U0126 (20 uM) eller med IFN og U0126 i 6 timer eller 12 timer, ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Den relative Ekspresjonsnivået ble beregnet sammenlignet med 6 timer ubehandlede kontroll etter normalisering mot GAPDH-ekspresjonsnivåer. (N = 3, * P 0,01 i forhold til tids matchet kontrollgruppe, ** P 0,05 sammenlignet med alle andre grupper).
Effekter av Ras aktivering på IFN-indusert transkripsjon i IFN Sensitive SKOV3 celler
for ytterligere å undersøke undertrykkelsen av IFN transkripsjon av aktiverte Ras, genererte vi SKOV3 celler (IFN-sensitive) som uttrykker konstitutivt aktiv Ras mutant (SKOV3-RasV12, kloner 10 og 15). Ras /MEK aktivering i de mutante celler ble bekreftet ved western blot-analyse ved anvendelse av anti-fosforylert ERK, og Ras-antistoffer (Fig. 6A). Vektor kontroll SKOV3 og SKOV3-RasV12-celler ble behandlet med IFN (0, 12,5, 25, 50 og 100 U /ml) i 16 timer og deretter utfordret med VSV ved en MOI på 1. Western blot-analyse av VSV-G-protein ved 24 timer etter infisering viste at VSV tydelig replikert mer effektivt i Ras-transform SKOV3 mutanter (klon 10 og 15) enn i kontroll SKOV3-celler i nærvær av IFN (fig. 6B). Vi har også målt avkom virusnivåer 48 timer etter infeksjonen å kvantifisere graden av virusinfeksjon (Fig. 6C). Etter avtale med western blot analyse, fant vi at avkom virusproduksjon var betydelig høyere i Ras-transform SKOV3 mutant enn i kontroll SKOV3 celler behandlet med IFN (50 og 100 U /ml). For ytterligere å fastslå om reduksjon i IFN følsomhet ved innføring av aktive Ras blir indusert ved nedregulering av IFN-indusert transkripsjon, undersøkte vi endringene IFN-indusert transkripsjon av 5 gener (GBP2, IFIT2, MAP2, STAT2 og RIGI), hvilken vi tidligere identifisert til å bli nedregulert ved Ras /MEK i HT1080 celler (figur 5). Induksjon av GBP2, IFIT2, MAP2 og RIGI ble inhibert i de Ras-transform SKOV3-celler sammenlignet med kontroll SKOV3-celler ved 12 timer etter IFN stimulering mens STAT2 induksjon ikke ble signifikant påvirket (fig. 7). Disse resultater viser at aktivert Ras-signalisering undertrykker transkripsjonen av visse IFN-induserbare gener som fører til reduksjon av cellulære følsomhet overfor IFN.
(A) Western blot-analyse ved anvendelse av anti-Ras, til fosforylert ERK-antistoff eller GAPDH bestemme Ras /MEK-aktivering i kontroll SKOV3 og ras-transformerte SKOV3 (klon 10 og 15). Kontroll SKOV3 og Ras-transform SKOV3-celler ble behandlet med IFN (0, 12,5, 25, 50 og 100 U /ml), og deretter utfordret med utfordret med VSV (MOI på 1). -Infeksjon ble evaluert ved (B) Western blot-analyse for VSV-G-protein og GAPDH ved 24 timer infeksjon og ved (C) virus-avkom assay ved 48 timer etter infeksjon.
ekspresjon av GBP2, IFIT2 , MAP2, RIGI og STAT2 i kontroll SKOV3 og Ras-transform SKOV3-celler (klon 15) 12 timer etter IFN stimulering (0, 12,5, 50 og 100 U /ml) ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Den relative Ekspresjonsnivået ble beregnet i forhold til den ubehandlede kontroll SKOV3-celler etter normalisering mot GAPDH-ekspresjonsnivåer. (N = 3, * P 0,05 og ** P 0,01 sammenlignet med IFN konsentrasjons matchet kontrollgruppe).
Diskusjoner
Som vist tidligere, nedskrivning av IFN respons i kreftceller regnes som en av de vanligste mekanismer for viral oncolysis [3], [10]. Aktivering av Ras /MEK reaksjonsveien er blitt rapportert å undertrykke antivirale responser indusert av IFN [4], [16], [17], [25], [40]. I denne studien vi først kartlagt et panel av humane kreftcellelinjer og bestemt 1) deres respons overfor IFN i fremstilling av en antiviral tilstand og 2) muligheten for MEK-inhibitor, U0126, for å gjenopprette IFN følsomhet. Vi fant at 13 av de 16 cellelinjene som ble testet var moderat eller helt bestandig overfor IFN antiviral respons. I 10 av disse 13 cellelinjer, ble sensitiviteten overfor IFN gjenopprettes ved behandling med MEK-inhibitor. Disse resultatene foreslår at aktivert Ras /MEK reaksjonsveien ligger til grunn for kreftcelle resistens mot antivirale effekter indusert av IFN. For ytterligere å undersøke den underliggende mekanisme for den undertrykkende virkning av de Ras /MEK reaksjonsveien på IFN reaksjon, gjennomførte vi global genekspresjon analyse for å bestemme IFN-indusert transkripsjonelle aktivitet i IFN følsomme SKOV3 og IFN moderat resistente HT1080-celler. Vi fant at det var en betydelig reduksjon i antallet gener indusert av IFN i HT1080-celler sammenlignet med den i SKOV3-celler (276 gener i SKOV3, 98 gener i HT1080-celler, Fig. 3A). Videre MEK hemming gjen IFN sin evne til å aktivere dens transkripsjon i HT1080-celler, som vi har funnet at ytterligere 111 gener i 6 timer og 135 gener på 12 timer ble uttrykt i HT1080-celler behandlet med både IFN og U0126 (Fig. 3B), som indikerer at aktivert Ras /MEK undertrykker transkripsjon av en gruppe av IFN-induserte gener. Til slutt var vi i stand til å vise at uttrykket av konstitutivt aktiv Ras i IFN sensitive SKOV3 celler reduserte deres evne til å aktivere IFN-indusert transkripsjon og å etablere IFN-indusert antiviral respons. Disse resultatene viser tydelig at aktivert Ras /MEK sti undertrykker transkripsjon av visse IFN induserbare gener å etablere IFN svekkelse i humane kreftceller.
Vi kan hypoteser flere mulige bakenforliggende mekanismer for utbredt undertrykkelse av IFN-indusert transkripsjon av Ras /MEK veien. 1) Ras /MEK regulerer aktiviteten til en transkripsjonen co-regulator for ISGF3, slik som de positive co-regulatorer IRF1 [41], [42] og SP3 [43], eller de negative ko-regulatorer NF-kB [44] og IFN-konsensussekvensen bindende protein [45]. I dette tilfelle IFN-induserbare gener som krever opp- eller nedregulering av en ko-regulator for deres ekspresjon ville bli undertrykket i cellene med aktivert Ras /MEK. 2) Ras /MEK hemmer basal uttrykk nivåer av viktige komponenter av IFN signalveien. Utilstrekkelig uttrykk nivåer av disse komponentene fører til global svekkelse av IFN indusert antiviral respons ligner på nedregulering av STAT2 uttrykk som vi observerer i NIH3T3 celler overekspresjon konstitutivt aktiv Ras [17]. 3) Ekspresjon av IFN-induserbare gener kan undertrykkes ved epigenetiske mekanismer. For eksempel kan et samspill av STAT2 med BRG1 [46], en nøkkelkomponent i ATP-avhengige kromatin remodelle SWI1-SNF2 kompleks [46], endre uttrykk for en undergruppe av IFN-regulerte gener. Mens regulering av BRG1 ved Ras ikke er påvist, har nedregulering av den relaterte protein, Brm1, blitt rapportert [47]. Tilsvarende Ras-mediert regulering av DNA metylering [48] eller histone modifikasjon [49], hvis rettet mot IFN-regulert gener, kunne globalt undertrykke deres uttrykk. 4) Til slutt kan Ras /MEK sti aktivere eller oppregulere negative regulatorer av IFN sti som SOCS [50] eller PIAS [51]. Disse negative regulatorer kan undertrykke transkripsjon av IFN-induserbare gener som er identifisert til å bli nedregulert ved Ras /MEK i denne studien.
Analyse av de biologiske prosessene som er representert i de gensettene viste at antallet av biologiske prosesser som påvirkes av IFN og U0126 var høyere enn enten U0126 eller IFN alene. I tillegg er antallet forskjellige GO kategoriene var høyere etter 6 timer i forhold til 12 timer i enten U0126 alene eller i den kombinerte behandling som tyder på at langvarig stimulering begrenser antall biologiske prosesser som kan bli utført av de gener som uttrykkes . Som forventet, var i stand til IFN-gener som er kjent for responsen til viruset og NF-kB-signalering for å regulere, men den kombinerte behandling økte representasjon av flere antivirale GO kategorier så vel som gener som er viktige for regulering cytokin. Videre, sammenlignet med U0126 alene behandling, i kombinasjon U0126 og IFN-behandling reduserte representasjon av gener som er ansvarlige for DNA-replikasjon og reparasjon, cellesyklusregulering og celle motilitet. Totalt sett er kombinert behandling forsterket anti-virale /inflammatorisk respons-genekspresjon i samspill med redusert representasjon av gener som fremmer vellykket celledeling.
Interessant nok var en undergruppe av gener som induseres vanligvis ved de to beskyttende behandlinger, IFN behandlingen i SKOV3 celler og kombinert IFN og U0126 behandling i HT1080 celler (tabell S3). Disse genene inkludert C14orf159 genet som er nylig blitt vist å ha bred antiviral funksjon, og den MOV10 og IFI44 gener vist seg å ha mer begrenset antivirale aktivitet [52]. Tilsvarende medlemmer av anti-retrovirale APOBEC3 [53] og trim [53] genfamiliene ble indusert av både beskyttende behandlinger. IFIT2 er nylig blitt vist å ha anti-viral funksjon [27], [28], [29] og anti-proliferativ funksjon [54]. Videre samhandler IFIT2 med mikrotubuli [27] antyder at IFIT2 kan assosiere med IFN-oppregulert MAP2 å forstyrre virus montering og /eller transport ved å regulere mikrotubulidynamikk [32], [33], [34]. I tillegg har vi også funnet kritiske antivirale gener, slik som guanylat-bindende protein (GBP) -2 [31] og RIGI [35], som er synergistisk indusert i HT1080-celler behandlet med IFN og U0126. Derfor er disse data gir ytterligere bevis på viktigheten av disse gener for å etablere en vellykket antiviral respons. Fremtidige studier vil søke å identifisere den nøyaktige rollene til disse genene, enten alene eller i kombinasjon, for å formidle beskyttende IFN anti-viral respons og regulere viral oncolysis.
Det var ingen sammenheng mellom vev opprinnelsen av menneskelig kreft celler som anvendes i denne studien, og følsomhet overfor IFN eller evne til å gjenopprette U0126 IFN reaksjonsevne.
