Abstract
Bakgrunn
Fenretinide (4-HPR) er et syntetisk retinoid som viser potent antitumor og chemopreventive aktiviteter mot forskjellige maligniteter, inkludert ovarietumorer. Vi viste tidligere at eggstokkreft celler, 4-HPR induserer apoptose gjennom en signalkaskade fra reaktive oksygenforbindelser (ROS) generasjon og involverer endoplasmatiske retikulum (ER) stress respons jr N-terminal kinase (JNK) aktivering og induksjon av apoptosiske morkake benmorfogenetisk protein (PLAB). Etter nyere studier har vist at onkogen ALL1-kondensert fra kromosom 1q (AF1q), en retinsyre målgen, er innblandet i apoptose-induksjon av flere terapeutiske midler, undersøkte vi dens mulig involvering i apoptose indusert av 4-HPR in ovarian cancer celler.
metodikk /hovedfunnene
Protein uttrykk analyse, utført i eggstokkreft celler og utvidet til andre histotypes (bryst, neuroblastom, og cervical), viste at 4-HPR forbedret AF1q uttrykk i kreftceller sensitive til retinoidet, men ikke i resistente celler. Gjennom genet Slå, ble AF1q funnet funksjonelt involvert i 4-HPR-indusert apoptose i A2780, til en ovarial cancer cellelinje svært følsom retinoid veksthemmende og apoptotiske effekter. Inhibering av signaleringsmellomprodukter med 4-HPR apoptotiske kaskade viste at AF1q oppregulering var avhengig av tidligere generasjon av ROS, induksjon av ER stressrespons, JNK-aktivering, og PLAB upmodulation. Til slutt fant vi ut at direkte overekspresjon av AF1q, i fravær av ytre stimuli, økt apoptose i eggstokkreft cellelinjer.
Konklusjon /Betydning
Studien utvider kunnskap om 4-HPR virkningsmekanisme, som ennå ikke er helt klarlagt, identifisere AF1q som en roman formidler av retinoid anticancer aktivitet. I tillegg demonstrerer vi, for første gang, at AF1q spiller en rolle i den begynnende basal apoptose i eggstokkreft celler, og dermed gi ny informasjon om aktiviteten av dette protein som har biologisk funksjoner er for det meste ukjent.
Citation: Tiberio P, Cavadini E, Callari M, Daidone MG, Appierto V (2012) AF1q: A Novel Mellommann Basal og 4-HPR-indusert apoptose i eggstokkreft celler. PLoS ONE 7 (6): e39968. doi: 10,1371 /journal.pone.0039968
Redaktør: Maurizio D’Incalci, Istituto di RICERCHE Farmacologiche Mario Negri, Italia
mottatt: 5 mars 2012; Godkjent: 05.06.2012; Publisert: 26 juni 2012
Copyright: © 2012 Tiberio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av midler fra italienske borgere som er tildelt den 5 × 1000 andel av deres skattebetaling til støtte for Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori, ifølge italiensk lov (INT-institusjonelle strategiske prosjekter «5 × 1000»; www.lavoro.gov. den/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Retinoider, en stor familie av naturlige og syntetiske forbindelser strukturelt beslektet med vitamin A (retinol), er viktige signalmolekyler som regulerer en rekke forskjellige biologiske prosesser slik som embryonisk utvikling, differensiering, vedlikehold av epitelvev, reproduksjon , visjon, spredning og apoptose [1], [2]. N- (4-hydroksyfenyl) retinamide (4-HPR), også kjent som fenretinide, er en syntetisk vitamin A derivat godt tolerert hos mennesker som har dukket opp som en av de mest lovende retinoider i klinikken for forebygging og behandling av mange ondartede sykdommer [ ,,,0],3] – [7]. 4-HPR har vist seg å eventuelt redusere forekomsten av eggstokkreft, og for å bestemme, i premenopausale kvinner, en betydelig reduksjon i faren for en andre brystkreft som vedvarer i minst 15 år [3], [6]. Selv om 4-HPR virkningsmekanismer har vært et viktig fokus for forskning det siste tiåret, de molekylære hendelser mediert av retinoid vises mangefasettert, og er ikke helt klarlagt [8]. I motsetning til klassiske retinoider (som all-trans retinsyre), som ofte induserer differensiering og /eller cytostase ved å aktivere familien atom retinsyrereseptorer (Rars), har fire-HPR vist seg å lokke fram ulike biologiske effekter gjennom både retinoid reseptor uselvstendige og-Uavhengig mekanismer [9].
i dyrkede celler, 4-HPR er blitt vist å inhibere celleproliferasjon og for å fremme apoptose mediert, i det minste delvis, ved generering av reaktive oksygenarter (ROS) og påfølgende oksidativt stress [8] – [11]. Vi har tidligere gitt bevis for at, i eggstokkreft celler, 4-HPR indusert apoptose gjennom en signalkaskade fra ROS produksjon og involverer endoplasmatiske retikulum (ER) stress respons jr N-terminal kinase (JNK) aktivering og induksjon av proapoptotiske morkake benmorfogenetisk protein (PLAB, også kjent som NAG-en, GDF15, MIC-1, PDF, og PTGFB) (ROS → ER stress → JNK → PLAB) [11], [12].
ALL1 -fused fra kromosomet 1q (AF1q, også kjent som MLLT11) genet, beliggende i kromosom 1, bånd 21, koder for et lite protein på 9 kDa uten noen veldefinerte funksjonelle domener og noen likhet med andre kjente proteiner [13]. Mekanismene bak reguleringen av AF1q uttrykk har blitt undersøkt på mRNA og proteinnivåer. En økning i AF1q mRNA-nivåer er vist i retinsyre (RA) -responsive neuroblastom-celler etter eksponering for retinoid, og således identifiserer AF1q som en RA-target-genet [14]. Mer nylig har det blitt demonstrert at AF1q mRNA-ekspresjon er direkte regulert av microRNA29b [15], mens proteinet underkastes ubiquitin-formidlet nedbrytning av proteasomet i centrosomal området [16]. AF1q ble opprinnelig definert som et onkogen faktor innblandet i en trans t (1; 11) (Q21, Q23) ansvarlig for tilfeller av leukemi [13]. Dessuten ble et høyt ekspresjonsnivå av genet som rapportert å være assosiert med en dårlig prognose i pediatrisk akutt myeloid leukemi (AML), voksen normal cytogenetisk AML, og voksen myelodysplastisk syndrom [17] – [19]. Selv om de biologiske funksjoner av AF1q er stort sett ukjent, har et potensielt onkogene funksjon av proteinet har også blitt foreslått i faste tumorer slik som brystcancer og skjoldbruskkjertel oncocytic og testiklene bakterie celle svulster [20] – [23]. I tillegg til den foreslåtte onkogene rolle AF1q, har det blitt rapportert at proteinet kan regulere BAD-mediert apoptotiske reaksjonsvei via NF-kB, og dermed spiller en rolle i reguleringen av apoptose og i medikamentresistens [24], [25] . En reduksjon i AF1q uttrykk i forbindelse med nedsatt doksorubicin følsomhet er blitt observert i humane squamous karsinomceller, og knockdown av proteinet har vist seg å redusere apoptotisk celledød indusert av flere terapeutiske midler, så som doksorubicin og γ stråling [24], [ ,,,0],25].
Denne studien undersøkte involvering av AF1q i 4-HPR-indusert apoptose i ovarietumorceller. Vi gir bevis for at 4-HPR behandling forbedrer AF1q uttrykk nivåer i kreftceller sensitive til retinoidet og at en slik oppregulering er en viktig hendelse av 4-HPR signalkaskade som fører til apoptose gjennom ROS generasjon, ER stress respons, JNK-aktivering, og PLAB oppregulering. Til slutt, etter AF1q overekspresjon, viste vi en rolle AF1q i utbruddet av basal apoptose i eggstokkreft celler.
Resultater
4-HPR Induserer AF1q Oppregulering i eggstokkreft celler Sensitive til retinoid men ikke i resistente celler
Siden AF1q ble vist å spille en rolle i apoptose indusert av flere terapeutiske midler, og for å bli regulert av RA [14], [24], [25], søkte vi å undersøke potensielt bidrag av proteinet i den apoptotiske aktivitet av det syntetiske retinoid 4-HPR. Vi analyserte effekten av 4-HPR behandling på AF1q ekspresjon i humane ovarie cancer cellelinje A2780, noe som er meget følsomme for de antiproliferative og apoptotiske virkninger av retinoidet [26], [27], og i dens motstykke A2780 /HPR, som har indusert motstand mot 4-HPR [28]. Proteinekspresjon analyse viste at A2780 celler konstitutivt uttrykte AF1q protein, og at behandling med 5 og 10 uM 4-HPR i 24 timer økte ekspresjon i en doseavhengig måte (figur 1A). I motsetning til dette ble 4-HPR behandling ikke forårsake noen økning i AF1q protein ekspresjon i A2780 /HPR-celler, selv om cellene konstitutivt uttrykte det (figur 1B). Slike data foreslo en assosiasjon mellom AF1q induksjon ved 4-HPR behandling og celle følsomhet overfor retinoid.
Western blot-analyse for ekspresjon i AF1q A2780 (A) og A2780 /HPR (B) celler ble behandlet i 24 timer med 5 og 10 mm 4-HPR. Som en kontroll for lasting, ble blotter inkubert med aktin antistoff.
4-HPR Forbedrer AF1q Expression Andre eggstokkreft celler og i kreftcellelinjer av ulik Histotypes
For å vurdere enten 4-HPR-indusert oppregulering AF1q var begrenset til A2780-celler eller representerte en særegen virkningsmåte av retinoidet, utvidet vi analysen av AF1q uttrykk for andre humane kreftceller med forskjellige følsomheter til den antiproliferative virkning av 4-HPR. Behandling med 5 mM 4-HPR i 24 timer indusert AF1q oppregulering i de følsomme ovarian cancer cellelinjer OVCA432 og SKOV-3 [27] (figur 2A), så vel som i responsive celler av forskjellig histotypes, dvs. brystadenokarsinom T47D og neuroblastom SK-N-BE [27] (figur 2B). I motsetning til dette, i celler som naturlig resistente mot 4-HPR veksthemmende aktivitet slik som kreft i eggstokkene cellelinjen OVCAR-3 [27] og cervikal carcinom cellelinjer HeLa (IC
50 10 uM, i 72 timer, data ikke vist), heller ikke 5 um (data ikke vist) eller 10 pM 4-HPR behandling i 24 timer forårsaket upmodulation av AF1q uttrykket (figur 2C). Resultatene antydet at 4-HPR-indusert oppregulering AF1q ikke forekomme bare i A2780 celler, men var et karakteristisk for kreftceller som reagerer på det retinoid.
Western blot-analyse for ekspresjon i AF1q OVCA432 og SKOV-3 (A ) celler, i T47D og SK-N-BE (B) celler, og in OVCAR-3 og HeLa (C) celler behandlet i 24 timer med 4-HPR ved de angitte doser. Som en kontroll for lasting, ble blotter inkubert med aktin antistoff.
AF1q Oppregulering i A2780 Cells er knyttet til retinoid evne til å hemme cellevekst og indusere apoptose
Analyse av foreningen mellom AF1q ekspresjon og tumorvekst-inhiberende og apoptotiske effekter ble utvidet til andre naturlige og syntetiske retinoider, dvs. RA, og N- (4-metoksyfenyl) retinamide (4-MPR) og 4-okso-N- (4-hydroksyfenyl) retinamide (4-okso-4-HPR), to 4-HPR metabolitter. Vi har tidligere vist at 4-okso-4-HPR har en veksthemmende virkning (IC
50 = 0,6 uM, 72 timer), og induserer apoptose i A2780 celler, mens 4-MPR og RA ikke påvirker en slik vekst (IC
50 10 uM, i 72 timer for begge retinoider) [27] – [29]. Som vist i figur 3, i A2780-celler ved behandling med RA, så vel som med 4-MPR, ikke påvirker enten AF1q ekspresjon eller caspase-3-aktivering, mens ledet 4-okso-4-HPR behandling av en økning i AF1q ekspresjon og til caspase-3-spalting (figur 3). Dataene viste at retinoid-indusert oppregulering AF1q var forbundet med evnen til forbindelsen til å hemme cellevekst, og for å indusere apoptose.
Western blot analysiso for AF1q ekspresjon og caspase-3 spalting i A2780-celler behandlet i 24 timer med 10 uM RA eller 4-MPR, eller 3 uM 4-okso-4-HPR. Som en kontroll for lasting, ble det blot inkubert med aktin antistoff.
AF1q Oppregulering er Funksjonelt involvert i apoptose indusert av 4-HPR i A2780 Cells
For å studere potensielle rolle AF1q i 4-HPR-mediert apoptose, utførte vi AF1q lyddemping av forbigående transfections av A2780 celler med et plasmid som uttrykker en AF1q siRNA eller en egge nonsilencing siRNA brukt som kontroll. Transfeksjon med AF1q siRNA redusert både basal og 4-HPR-indusert ekspresjon AF1q og tydelig nedsatt 4-HPR-indusert apoptose, som vist ved spalting av caspase-3 (figur 4), noe som viser at AF1q spilte en rolle i apoptose-induksjon av 4- HPR i A2780 celler. Under de samme eksperimentelle forhold, gjorde vi ikke observere modulering av proapoptotiske protein BAD (figur 4), tidligere vist å være regulert av AF1q i menneskelige plateepitel karsinom celler [24], [25].
Western blot analysiso for AF1q ekspresjon, caspase-3-spalting, og dårlig ekspresjon i A2780-celler transient transfektert med et plasmid som inneholder et siRNA AF1q eller en kryptert nonsilencing siRNA etter tilsetning av 5 mM 4-HPR i 24 timer. Som en kontroll for lasting, ble det blot inkubert med aktin antistoff.
AF1q er involvert i apoptotiske signalkaskade indusert av 4-HPR i A2780 Cells
Vi har tidligere rapportert at fire -HPR-indusert apoptose skjer gjennom en signalkaskade som involverer ROS generasjon, ER stress induksjon, JNK-aktivering og PLAB oppregulering (ROS → ER stress → JNK → PLAB) [11], [12]. Vi evaluerte dermed om AF1q var involvert i den tidligere nevnte apoptotiske reaksjonsvei ved å teste virkningene av hemming av disse signalmellomprodukter med 4-HPR-indusert AF1q upmodulation. For å oppnå dette målet, A2780 celler ble behandlet med 4-HPR og, i sin tur, sammen med antioksidanten vitamin C, den ER stress inhibitor salubrinal, og den farmakologiske JNK inhibitor SP600125, som har blitt vist å forebygge ROS generasjon, eIF2α defosforylering, og JNK-aktivering, henholdsvis, og for å sterkt redusere 4-HPR-indusert apoptose i den samme cellelinjen [11]. Tilsetningen av 100 pM vitamin C til A2780-celler behandlet med 5 uM 4-HPR i 24 timer avskaffet 4-HPR-indusert oppregulering av AF1q (figur 5A). På tilsvarende måte, ved tilsetning av 10 uM salubrinal eller 10 pM SP600125 sterkt redusert 4-HPR-indusert oppregulering AF1q (figur 5B og 5C). For å undersøke om oppregulering av AF1q var en nedstrøms begivenhet også for PLAB oppregulering indusert av 4-HPR har PLAB blitt slått ned med en syntetisk siRNA rettet mot PLAB mRNA. Som vist på figur 5D, behandling av A2780-celler med den PLAB-spesifikke siRNA var i stand til sterkt å redusere 4-HPR-induserte PLAB samt AF1q upmodulation sammenlignet med celler transfektert med en kontroll siRNA. Omvendt, gjorde AF1q lyddemping ikke påvirke 4-HPR-indusert PLAB oppregulering (figur 5E). De forannevnte data indikerte at i A2780 celler AF1q oppregulering var avhengig av tidligere aktivering av 4-HPR-indusert-ROS relatert signaleringskaskade og at dens upmodulation forekom nedstrøms fra PLAB induksjon (figur 6).
Western blot analyse for AF1q ekspresjon i A2780-celler behandlet i 24 timer med 5 mM 4-HPR, med eller uten 100 pM vitamin C (A), 10 uM salubrinal (B), eller 10 pM SP600125 (C). (D) Western blot-analyse for ekspresjon i AF1q A2780-celler stabilt transfektert med et plasmid som inneholder et siRNA PLAB eller en kryptert nonsilencing siRNA etter tilsetning av 5 mM 4-HPR i 24 timer. Som en kontroll for lasting, ble blotter inkubert med aktin antistoff.
4-HPR induserer apoptose gjennom en signalkaskade som involverer oksidativt stress, ER stressrespons, JNK aktivering, overekspresjon av proapoptotiske protein PLAB, og AF1q oppregulering.
AF1q spiller en rolle i den induksjon av Basal apoptose i eggstokkreft celler
for å undersøke sammenhengen mellom AF1q induksjon og apoptose utbruddet, analyserte vi enten direkte overekspresjon av AF1q, i fravær av eksterne stimuli, kan forårsake apoptose. Til dette formål ble A2780 celler transient transfektert med et grønt fluorescerende protein (GFP) -tagged AF1q vektor. Celler transfektert med en vektor som koder for GFP ble anvendt som kontroll. Ved 48 timer etter transfeksjon, ble kjerne fragmentering og kromatin kondensasjon overvåkes i grønne fluorescerende celler ved farging cellekjerner med Hoechst 33342 (figur 7A). Som vist i figur 7B (venstre panel), GFP-AF1q-overekspresjon celler viste en markert økning i apoptotiske kjerner i forhold til kontroll-celler transfektert med GFP alene. En lignende effekt ble observert når det ble utført analyser på OVCAR-3-celler, en annen ovarian cancer cellelinje som, forskjellig fra A2780-celler, var resistent overfor 4-HPR antiproliferativ effekt, og ikke konstitutivt uttrykte AF1q. Transfeksjon med GFP-AF1q indusert også i OVCAR-3 en økning i basal apoptose i forhold til transfeksjon med GFP (figur 7B, høyre panel). Disse funnene antydet en rolle for AF1q i utbruddet av apoptose i eggstokkreft celler.
(A) Immunofluorescensanalyse av A2780 celler transient transfektert med GFP alene (øvre paneler) eller GFP-merket AF1q vektor (AF1q-GFP ) (nedre paneler). Etter 48 timer ble GFP og AF1q-GFP-celler farget med Hoechst 33342 og kjernemorfologi ble undersøkt med et fluorescerende mikroskop. Celler av interesse er merket med piler. Celler med kondenserte og fragmenterte kjerner ble identifisert og scoret som apoptotiske celler. Ett eksperiment representant for tre vises. Målestokk representerer 10 mikrometer. (B) Apoptose ble representert som prosentandel av apoptotiske celler per 100 grønt fluorescerende celler (minst 200 celler per prøve) i A2780 (venstre panel) og OVCAR-3 (høyre panel) celler transfektert som i (A). Data representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. Stjernene indikerer signifikant forskjell (P 0,05)
Diskusjoner
De siste resultatene at AF1q genet, ved siden av sin dokumentert onkogene funksjon [17] – [23], spiller en rolle. i apoptose regulering i kreftceller [24], [25] og det faktum at det har blitt beskrevet som en RA-target-genet [14], fikk oss til å undersøke en mulig involvering i apoptose indusert av den syntetiske nonclassic retinoid 4-HPR. Den foreliggende studien identifisert AF1q som en ny mediator av apoptose indusert av 4-HPR og ga bevis på en rolle av proteinet i den begynnende basal apoptose i eggstokkreft celler. Vi har vist at i A2780, en human ovarie carcinom cellelinjen som sterkt følsomme for den veksthemmende og apoptotiske virkninger av retinoidet [26], [27], 4-HPR-indusert apoptose ble ledsaget av en økning i AF1q proteinekspresjon. I motsetning til dette ble det upmodulation av AF1q ikke observert når A2780 /HPR-celler, en 4-HPR resistent variant avledet fra A2780-celler [28], ble behandlet med det retinoid. Analyse av AF1q uttrykk, utvidet til et panel av humane kreftcellelinjer (ovarie, bryst, cervix, og neuroblastom) med forskjellige følsomheter til 4-HPR antiproliferativ effekt [27], bekreftet at upmodulation av proteinet etter 4-HPR eksponering var felles for 4-HPR responsive celler, men ikke forekomme i kreftceller resistente mot retinoid.
Sammenhengen mellom celle følsomhet for 4-HPR kreft effekter og AF1q oppregulering foreslått en rolle for AF1q som en antatt megler av 4-HPR aktivitet. Hypotesen ble også støttet av det faktum at AF1q ekspresjon ble selektivt oppregulert ved 4-HPR og ved dets aktive metabolitt 4-okso-4-HPR, men ikke med RA eller 4-MPR, som ikke klarte å indusere celledød i A2780-celler [ ,,,0],27] – [29]. Mangelen på induksjon av AF1q og apoptose etter utfordring av cellene med RA er i overensstemmelse med det problem som 4-HPR biologiske effekter og mekanismene bak dets antikreftaktiviteter i stor grad skiller seg fra de klassiske retinoider [9], og er i stedet mer i nærheten av de som er beskrevet for atypiske retinoider [30]. En direkte forbindelse mellom AF1q oppregulering og apoptose indusert av 4-HPR ble demonstrert ved AF1q stanse, noe som førte til en reduksjon i 4-HPR-indusert apoptose, hvilket således indikerer at AF1q er, i det minste delvis, ansvarlig for den apoptotiske effekter forårsaket av retinoidet i eggstokkreft celler.
Vi viste tidligere at 4-HPR var i stand til å forårsake apoptose i eggstokkreft celler via aktivering av ROS → ER stress → JNK → PLAB signalkaskade [11], [12 ]. Induksjon av en slik kaskade var karakteristisk bare av kreftceller som reagerer på 4-HPR og er ikke aktivert i 4-HPR-resistente celler [12]. Vi har derfor antatt at 4-HPR-indusert oppregulering av AF1q, som skjedde bare i celler som er følsomme for retinoid, kan være et mellomprodukt med den ovenfor nevnte apoptotiske reaksjonsvei. I samsvar med denne hypotesen, fant vi at oppregulering av AF1q skjedde nedstrøms ROS generasjon, ER stressrespons, JNK-aktivering, og PLAB oppregulering indusert av 4-HPR. Faktisk, ved å inhibere den veien på forskjellige nivåer ved hjelp igjen er antioksidanten vitamin C, den selektive inhibitor av eIF2α defosforylering salubrinal, og JNK-inhibitor SP600125 (alle tidligere viste seg å beskytte A2780 celler fra 4-HPR-indusert apoptose [12]) viste vi at 4-HPR-indusert AF1q oppregulering ble sterkt redusert. Videre er tie av proapoptotiske proteinet PLAB (tidligere vist å redusere 4-HPR-indusert apoptose [11]) som skyldes en redusert evne til retinoid for å øke AF1q uttrykk. Omvendt, har AF1q stanse ikke påvirke evnen av 4-HPR å indusere PLAB oppregulering De ovennevnte resultater viste at AF1q var et mellomprodukt med ROS relatert signaleringskaskade aktiveres av 4-HPR å indusere apoptose, og at AF1q upmodulation forekom nedstrøms fra PLAB induksjon (Figur 6). Imidlertid kan bidraget fra andre signaler ROS-avhengige til 4-HPR-indusert AF1q upmodulation ikke utelukkes. Ikke overraskende fant vi at AF1q ble oppregulert også etter behandling med 4-oxo-4-HPR, en 4-HPR polar metabolitt i stand til å aktivere den nevnte apoptotiske kaskade (fra ROS generasjon til PLAB induksjon) [31].
Etter avtale med våre observasjoner, analyse av en offentlig tilgjengelig microarray eksperiment datasett på 4-HPR-behandlede og ubehandlede CD34 + celler fra fire kronisk myelogen leukemi pasienter (GEO tiltredelses: GSE17480) viste at retinoid induserte en seksdobling i AF1q mRNA-ekspresjon (P 0,01) (figur S1). I de samme cellene, 4-HPR var i stand til å indusere apoptose – slått å være mediert ved induksjon av oksidativt stress, noe som bekrefter forholdet mellom ROS-mediert apoptose indusert av 4-HPR og AF1q overekspresjon
I følge. til apoptotiske rolle foreslått av våre observasjoner, har AF1q engasjement i apoptose regulering og i legemiddelresistens er rapportert av en annen forskergruppe [24], [25]. Forfatterne viste at i humane plateepitel carcinom-celler, ble AF1q nedregulering i forbindelse med en doksorubicin-resistent celle-fenotype, og at AF1q upmodulation forårsaket en øket doxorubicin og γ strålings-indusert apoptose ved transaktivering av proapoptotiske proteinet BAD via NF-kB [24], [25]. I kontrast, gjorde vi ikke observere oppregulering av BAD i AF1q-mediert apoptose indusert av 4-HPR i A2780 celler. Faktisk gjorde fire-HPR behandling ikke modulerer BAD uttrykk, heller ikke AF1q Silencing forårsaker endringer i proteinnivåer. En mulig forklaring kan være at AF1q kanskje annerledes påvirke BAD uttrykk i ulike kreftcelletyper og /eller i respons til bestemte stimuli. Imidlertid er det interessant å legge merke til at, som i 4-HPR og 4-okso-4-HPR [12], [31], doksorubicin og γ strålings-indusert apoptose har også blitt rapportert å være assosiert til ROS generasjon [32] – [34]. Derfor er det fristende å spekulere i at AF1q-mediert apoptose kan avhenge før induksjon av oksidativt stress, ikke bare for 4-HPR og 4-okso-4-HPR, men også til andre kjemoterapeutiske midler, selv om det i dag ikke tilstrekkelig bevis støtter slikt a. hypotese
et viktig funn i vår studie er indikasjon på en rolle AF1q i utbruddet av basal apoptose: AF1q upmodulation oppnås ved transient transfeksjon i eggstokkreft celler forårsaket, i fravær av ytre stimuli, en økning i den apoptotiske hastighet, og dermed demonstrere en rolle AF1q i aktivt indusere apoptose i disse celler. En helhetlig forståelse av de presise fysiologiske og patologiske funksjoner av AF1q er definitivt i sin barndom. Men de få studier som har undersøkt sin rolle avdekket at det kan være innblandet i begge hemming og promotering av kreft progresjon [17] – [25]. I tillegg til bevis for en rolle som en apoptose mediator, har AF1q blitt definert som en onkogen faktor involvert i hematologiske ondartede sykdommer, så vel som i solide tumorer [17] – [23]. Det er bemerkelsesverdig å observere at, på samme måte som rapportert for AF1q har PLAB også blitt vist å være utstyrt med en dobbel funksjon i progresjon av kreft [35]. Faktisk kan dette medlem av den transformerende vekstfaktor-β superfamilien faktisk negativt eller positivt modulerer celleproliferasjon og apoptose og kan bidra til kreft migrasjon, invasjon og metastase. Selv om mekanismene som regulerer de pleiotrope funksjonene til PLAB er fortsatt ikke godt forstått, har det blitt foreslått at proteinet kan virke som en tumor suppressor i de tidlige stadier av malignitet, mens det kan fremme tumorprogresjon i fremskredne stadier av kreft [35] . En spennende vurdering er at PLAB og AF1q har andre fellestrekk: de er både RA-målgener og er i stand til å indusere apoptose i fravær av ytre stimuli [11], [36]. Selv om videre studier er nødvendig for å definere den eksakte funksjoner av AF1q og for å undersøke en mulig sammenheng mellom PLAB og AF1q, dagens data viser for første gang en sammenheng mellom disse to proteinene.
I konklusjonen, utvider vår studie kunnskap om virkningsmekanismer av 4-HPR at selv om etterforsket i mange år, har ennå ikke blitt fullstendig klarlagt [8]. Identifisering av nye mål av retinoidet er et viktig problem, fordi det kan føre til at lette fremtidig utforming av legemiddel kombinasjonsstrategier og for å overvinne og forhindre utvikling av medikamentresistens. I tillegg gir vi ny informasjon om aktiviteten til AF1q, en kreft-relatert protein som biologiske funksjoner er i stor grad ukjent. Nærmere bestemt rapporterer vi at AF1q er involvert i 4-HPR apoptotiske og vekstinhibitoriske effekter, og at dens oppregulering avhenger av aktivering av ROS relatert signaleringskaskade som induseres av retinoid, således oppdaget en ny sammenheng mellom oksidativt stress og AF1q. Til slutt, demonstrerer vi for første gang en rolle for AF1q i induksjon av apoptose i basal eggstokkreft celler, selv om ytterligere studier er nødvendig for å definere de molekylære mekanismer som ligger under AF1q-mediert apoptose.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
eggstokkreft tumor cellelinjer A2780 (hentet fra Dr. Ozols, Bethesda, MD, USA) [31], OVCA432 (hentet fra Dr. Knapp, Boston, MA, USA ) [12], OVCAR-3 [12], SKOV-3 [12], og den neuroblastom-cellelinje SK-N-BE (alle tre anskaffet fra ATCC, Manassas, VA, USA) [31] ble opprettholdt i RPMI 1640 (Lonza, Basel, Sveits) inneholdende 10% føtalt kalveserum. A2780 /HPR (dvs. A2780 celler laget resistent overfor 4-HPR som tidligere beskrevet [28]) celler ble holdt i RPMI 1640 inneholdende 10% føtalt kalveserum supplert med 5 uM 4-HPR. Brysttumorcellelinje T47D (oppnådd fra Dr. R. Sutherland, Sydney, New South Wales, Australia) [31] ble opprettholdt i RPMI 1640 inneholdende 10% føtalt kalveserum og 0,25 U /ml insulin. Cervical carcinoma-cellelinjen HeLa, innkjøpt fra ATCC [31], ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (GIBCO-BRL, Paisley, UK) supplert med 10% føtalt kalveserum. Alle cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C under 5% CO2. 4-HPR, 4-MPR (både vennlig levert av Dr. J. Crowell, National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA), RA (kjøpt fra Sigma, St. Louis, MO, USA), og 4-oxo-4- HPR (syntetisert som tidligere beskrevet [29]) ble oppløst ved 10 mM i DMSO før fortynning i dyrkningsmedium og lagret ved -80 ° C i mørket. Vitamin C (Sigma) og JNK inhibitor SP600125 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) ble tilsatt til cellene 60 minutter og 15 minutter før 4-HPR, respektivt. ER stress respons hemmer salubrinal (Calbiochem) ble tilsatt sammen med 4-HPR.
immunoblotanalyse
Proteiner ble ekstrahert ved å lysere cellene i natriumdodecylsulfat (SDS) prøvebuffer (62,5 mM Tris- HCl [pH 6,8], 2% SDS) som inneholdt 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 ug /ml pepstatin, 12,5 ug /ml leupeptin, 2 ug /ml aprotinin, 1 mM natriumortovanadat, og 1 mM natriummolybdat. Celleekstrakter ble behandlet for western immunblotting som beskrevet tidligere [37]. Følgende antistoffer som brukes for immunoblotting ble kjøpt fra de angitte leverandører: AF1q fra Abnova (Taipei City, Taiwan, # H00010962-M01); spaltede Caspase-3 (Asp175) fra Cell Signa Bioteknologi (Beverly, MA, USA, # 9661); BAD fra Transduksjon Laboratories (Lexington, Kentucky, USA, # 610391); PLAB fra R og aktin fra Sigma (# A2066).
Immunofluorescensanalyse
Celler, dyrket og transfektert på glass dekkglass i 24 mm petriskåler, ble fiksert i 4% paraformaldehyde ved romtemperatur i 10 minutter , vasket med PBS og så farget med Hoechst 33342 (Sigma) 2 ug /ml i PBS i 2 minutter. Lysbilder ble montert med 0,1% (v /v) Mowiol (Calbiochem) og sett på med en fluorescens mikroskop [bildene ble tatt opp med en Spot Insight digitalkamera (Delta Sistemi) er utstyrt med et system for bildeanalyse (IAS 2000; Delta Sistemi)] . Apoptotiske celler ble identifisert ved analyse av kjernefysisk morfologi. Grønne fluorescerende celler med kondensert og fragmenterte kjerner ble identifisert og scoret som apoptotiske celler (minst 200 celler per prøve).
Bygging av GFP-merket AF1q Ekspresionsvektor
AF1q ble forbigående uttrykt som en fusjonsprotein med GFP fusert til dets C-terminal. AF1q kodende cDNA-området fratatt stoppkodonet ble oppnådd ved hjelp av polymerase kjedereaksjon (PCR) amplifisering fra et plasmid inneholdende cDNA som koder for human AF1q erholdt fra den integrerte Molekylær analyse av genomer og deres Expression (IMAGE) Consortium (Livermore, CA, USA ) (cDNA klon IMAGE: 305990). Vi brukte fremover oligonukleotidprimer 5′-ACTCGAGCCACCATGAGGGACCCTGTGAG-3 «[som inneholder et Xhol restriksjonssete og en Kozak-sekvens (CCACC)], og omvendt oligonukleotidprimer 5′-ATCCGGATCCAGCAAGTCCAGTTCG -3» (som inneholder et BamHI-restriksjonssete).
