Abstract
Bakgrunn
Kompleksiteten i humant plasma proteomet representerer en betydelig utfordring for biomarkører. Proteomikk analyse av genmanipulerte mus modeller av kreft og isolerte kreftceller og cellelinjer gi alternative metoder for å identifisere potensielle kreftmarkører som vil være synlig i menneskelig blod ved hjelp av sensitive analyser. Målet med dette arbeidet er å vurdere nytten av en integrerende strategi ved hjelp av disse to tilnærmingene for biomarkører.
metodikk /hovedfunnene
Vi har undersøkt en strategi som kombinerte kvantitative plasma proteomikk av en ovarian kreft musemodell med analyse av proteiner utskilt eller skur av menneskelige eggstokkreft celler. Av 106 plasmaproteiner identifisert med økte nivåer i tumorbærende mus, ble 58 også utskilt eller skur fra eggstokkreft celler. Resten besto hovedsakelig av host-respons proteiner. Av 25 proteiner som er identifisert i studien som ble analysert, ble for det meste 8 utskilte proteiner som er felles for mus plasma og humane kreftceller signifikant oppregulert i et sett av plasmaer fra ovarian kreftpasienter. Fem av de åtte proteiner ble bekreftet å være oppregulert i en andre uavhengige sett av eggstokkreft plasmaer, blant annet i tidlig stadium sykdommen.
Konklusjon /Betydning
Integrated proteomikk analyse av kreft musemodeller og menneskelig kreft celle populasjoner gir en effektiv tilnærming for å identifisere potensielle sirkulerende protein biomarkører
Citation. Pitteri SJ, JeBailey L, Faca VM, Thorpe JD, Silva MA, Ireton RC, et al. (2009) Integrert proteomikk Analyse av humane kreftceller og plasma fra Tumor bærende mus for Ovarian Cancer biomarkører. PLoS ONE 4 (11): e7916. doi: 10,1371 /journal.pone.0007916
Redaktør: Alfred Nordheim, Universitetet i Tübingen, Tyskland
mottatt: 30 juni 2009; Godkjent: 26 oktober 2009; Publisert: 19.11.2009
Copyright: © 2009 Pitteri et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne ønsker å erkjenne NIH SPORE stipend, # P50 CA83636 og # P50 CA105009, National Cancer Institute Early Detection Research Network og Canary Foundation. Daniela Dinulescu er en V Foundation Scholar og er også støttet av Burroughs Wellcome, Rivkin, Ovarian Cancer Research, og Mary Kay Ash Foundations, Dana-Farber Cancer Institute Madeline Franchi og Moorman Awards, og NIH mus modeller av Menneskelig Cancer Consortium innvilge # U01 CA084301. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Proteiner påvisbare i serum og plasma er ofte grunnlag for å overvåke eggstokkene, bukspyttkjertelen, og tykktarmskreft respons på behandlingen og tilbakefall av sykdommen gjennom måling av CA125, CA19.9, og CEA hhv. I tillegg, screening og overvåking av prostatakreft i dag baserer seg delvis på målinger av PSA-nivåer i blod [1] – [3]. Utviklingen av effektive strategier for identifisering av sirkulerende protein markører som utfyller gjeldende markører ville være gunstig [4]. En rekke nyere eggstokkreft studier har benyttet proteomforskning for å identifisere proteiner i eggstokkreft celler, vev og fluider [5] – [9]. Slike studier tyder på hundrevis av potensielle kandidater på grunn av overuttrykk, men ikke gi en indikasjon på om økte blodnivåer av søker proteiner kan forekomme i kreft fag. Identifisering av nye sirkulerende protein markører gjennom plasma profilering representerer en betydelig utfordring. Selv om plasma er en av de mest tilgjengelige biologisk materiale den inneholder store forsamlinger av proteiner og komplekser og viser betydelig heterogenitet mellom og innen fag som hindrer proteomikk analyser av lav overflod proteiner [10]. Konstruert musemodeller for kreft, karakterisert ved begrenset heterogenitet og en gunstig tumor til kropps masse-forhold, og isolerte tumorcellepopulasjoner som kan være profilert i betydelig dybde stede alternative strategier for identifisering av potensielle kreftmarkører, særlig utskilte proteiner som kan bli utsatt for validering i menneskelig blod ved hjelp av sensitive analyser.
Vi har utviklet flere musemodeller av ovarialcancer [11]. Disse modellene har blitt generert ved hjelp intrabursal levering av Adeno-Cre (AdCre) adenovirus via infundibulum i genmanipulerte mus. Denne metoden aktiverer selektivt onkogener og inaktiverer tumor dempere i eggstokkene overflaten epitel (OSE), et nettsted utstedt mange menneskelige ovarietumorer. Vi har tidligere støttet seg på de
LSL-K-ras
G12D /+ Hotell og
PTEN
loxP /loxP
betinget murine stammer (heretter kalt K-ras /PTEN) for å utvikle en musemodell for ovarial cancer [11] – [13]. En annen modell utviklet parallelt med oss og andre er basert på samarbeid mellom Wnt og PTEN trasé (
APC
loxP /lox PTEN
loxP /lox
genetisk kombinasjon, heretter kalt PTEN /APC) [14]. Begge modellene utstillingen funksjonene endometrioid ovarietumorer.
Vi har nylig foretatt proteomikk profilering for eggstokkreft celle populasjoner inkludert cellelinjer og ferske kreftceller beriket fra ascitesvæske, noe som resulterte i identifisering av flere tusen proteiner og belyst repertoar av proteiner uttrykt på celleoverflaten og proteiner frigjort i den ekstra-cellulære miljø [15]. Proteom analyse har avdekket Shedding ekstra-cellulære domener og svært dynamiske prosesser av protein sekresjon. Her har vi brukt en grundig kvantitativ proteomikk tilnærmingen [16] – [18] til analyse av plasmaproteinendringer knyttet til kreftutvikling i en K-ras /PTEN eggstokkreft musemodell for å bestemme deres engasjement i trasé og nettverk og deres korrespondanse til proteiner uttrykt eller gitt ut fra menneskelige eggstokkreft celler. Blindet analyse av humane prøver ble gjort for å finne ut hvilke analysert proteiner fra de integrerte kreftceller og mus plasma data ga statistisk signifikant økning i nivåene i eggstokkreft tilfeller i forhold til kontrollene. Et protein undergruppe representerer primært utskilte proteiner fra den kombinerte mus plasma og menneskelige kreftcelle proteomikk data ga signifikante forskjeller i nivåer mellom plasmaer fra ovarian kreftpasienter og plasma fra kontrollpersoner.
Resultater
Kvantitativ Plasma protein endringer observert i en Eggstokkreft Mouse Model
en pool av plasmaprøver fra AdenoCre-infiserte K-ras /PTEN mus (n = 5) og et basseng fra adeno-tom injisert kontroller (n = 5) var kastet kvantitativ proteomikk analyse for å fastslå forskjeller i plasmaproteinnivåer. Separate bassenger av plasma fra saker og kontroller ble utsatt for immunodepletion å fjerne rikelig plasmaproteiner, etterfulgt av differensial isotop merking for å skille krefttilfeller fra kontroller. Prøvene ble blandet og deretter utsatt for intakte protein fraksjonering ved ionebytting, etterfulgt av reversfase-kromatografi. Proteiner i de enkelte fraksjoner ble samlet opp enzymatisk spaltet og underkastet elektronisk LC-MS /MS for protein identifikasjon og kvantifisering (figur 1). En funksjon av IPAS plattformen er at omfattende fraksjonering gjør at de-kompleksering av prøvene i individuelle fraksjoner for å tillate identifikasjon og kvantifisering av proteiner som er tilstede i plasma i løpet av 6-7 størrelsesordener [16], [19]. En tidligere studie ved hjelp av denne tilnærmingen har vist at kvantitativ analyse av proteinforandringer kan fastslås med sikkerhet [18]. I denne studien ble enkelte 1725000 massespektra samlet og analysert. 1,031 unike proteiner ble identifisert med høy selvtillit (tabell S1). 106 proteiner ble oppregulert 1,5-ganger eller større (p-verdi 0,05) (tabell S2). Et flertall (57%) av de oppregulert proteinene inneholdt et signalpeptid for sekresjon, mens 17% omfattet i de tilsvarende gensekvens et transmembrandomene. 28% av oppregulert proteiner ble tidligere identifisert i proteom- profilering av mus levervev, en viktig kilde til plasmaproteiner [20], [21]. 9% hadde ingen menneskelig ortolog som fastsettes basert på Mouse Genome Database [22]. I motsetning til dette ble 36 proteiner downregulated 1,5-ganger eller større (p-verdi 0,05). (Tabell S3), inkludert utskilte proteiner med 8 representerer proteiner som tidligere er identifisert i mus levervev
En skjematisk av arbeidsflyten som brukes i denne studien. Bassenger av kontroll og kreft plasma fra K-ras /PTEN musemodell ble først immunodepleted å fjerne rikelig proteiner og deretter merket med D0- og D3- akrylamid isotoper å skille kreft fra kontroll. Bassengene ble blandet og underkastet omfattende intakte protein fraksjonering ved anionbytting, etterfulgt av reversfase-kromatografi. Etter tryptisk fordøyelse, ble prøver underkastet høy oppløsning massespektrometri og hagle LC-MS /MS-analyse for protein identifikasjon og kvantifisering. Etter statistisk analyse og data mining, ble oppregulert proteiner i murine plasma sammenlignet med humant ascites avledet tumor celler /kreft celle linje. I tillegg ble sti-analyse anvendt for å bestemme vesentlige biologiske reaksjonsveier og prosesser. Uttrykket av relevante oppregulert proteiner ble ytterligere validert i mus og humane svulster og plasma.
komparativ analyse av Tumor Peiling Mouse Plasma and Human Ovarian Tumor Cell proteom
Vi har sammenlignet musen plasma data med data fra en omfattende proteomikk studie av tre menneskelige eggstokkreft cellelinjer (OVCAR3, CAOV3, og ES2) og tumorceller fra ascitesvæske hentet fra en eggstokkreft pasient [15]. Cellelinjene besto av to dårlig differensierte serøse adenokarsinomer (OVCAR3, CAOV3) og en klar cellekreft (ES2). Ascites avledet tumorceller ble samlet opp fra en pasient med serøs eggstokkreft. Celler ble isotopisk merket i kultur ved hjelp SILAC [23] for å tillate konstatering av den cellulære opprinnelse av proteiner identifisert i media. Ved å sammenligne oppregulert mus plasmaproteiner med listen av proteiner anriket i overflaten eller utskilte cellulære fra humane eggstokkreft celler (Tabell S2), 55% (58/106) av oppregulert proteiner i plasma mus ble funnet å være frigjort fra ovarie kreftceller gjennom sekresjon eller Shedding eller beriket i eggstokkreft celleoverflaten rommet. Tidligere beskrevet kandidat markører for eggstokkreft identifisert i både musen plasma og eggstokkreft celler (tabell S4), inkludert WFDC2 (HE4), IGFBP2, og LCN2. Balansen av proteiner som ikke er identifisert i eggstokkreft celle analyser besto hovedsakelig av inflammatoriske og immunrespons relaterte proteiner. Interessant, selv om K-ras /PTEN-modellen har funksjonene til endometrioid eggstokkreft, viser resultatene at det oppreguleres utskilte proteiner identifisert i mus plasma med svulst utvikling var mer generelt representative for andre ovarialcancer histologiske subtyper, siden de humane cellelinjer og ascites avledet tumorceller resulterte fra papillære adenokarsinom, klar celle og serøst henholdsvis [24], [25].
i tillegg til de kvantitative kreft-til-styre forholdstall for proteiner som er presentert, hadde flere proteiner merkede peptider bare detektert med den tunge form av akrylamid, som representerer «kreft-only» peptider. Av de 106 proteinene oppregulert i mus plasma IPAS, 33 proteiner hadde flere kreft-bare peptider identifisert (tabell S2), ytterligere bekreftende deres oppregulert status. I tillegg sju proteiner: Cacna1c, VCL, Fcgbp, Mmp19, Lyz2, Eef1a1, og Gapdhs hadde kreft-bare peptider (Tabell S2). VCL virker som et bindingsprotein i fokal adhesjon og har vært studert i sammenheng med kreft [26]. Mmp19, en del av metalloproteinase familien implisert i kreft, har blitt rapportert å indusere epitelial cellemigrering, som spiller en viktig rolle i den tidlige fase av kreft [27]. Medlemmer av Eef1a familien har blitt rapportert som mulige onkogener overuttrykt i eggstokkreft [28], [29].
biologiske funksjoner og nettverk blant oppregulert Proteiner i Mouse Plasma
Pathway analyse ble utført for å bestemme de biologiske prosessene som bidrar til endringer i plasma proteomet med eggstokkreft tumor utvikling, og utforske trasé for proteiner av interesse å forstå prosessene som de deltar i. Vi er avhengige av to pathway verktøy til denne effekten, oppfinnsomhet og GeneGo er MetaCore. Initial pathway analyse av listen over 106 oppregulert proteiner ved anvendelse av beregnings genet nettverksforutsigelse verktøy, oppfinnsomhet Pathways Analysis, kategorisert proteinene i biologiske funksjoner. Tretti proteiner var assosiert med inflammasjon (p = 1,30 x 10
-6). Kreft ble identifisert som en betydelig sykdomsprosess (p = 3,71 × 10
-5) i forhold til alle proteiner identifisert, blir representert ved 52 relevante proteiner fra denne listen. Interessant, ble genene for 11 proteiner forbundet som en gruppe med eggstokkreft (p = 1,41 × 10
-3) (CFH, CLU, IFI30, IGFBP2, IGFBP4, LCN2, MMP2, POSTN, TFF3, TNFRSF9, HE4 (WFDC2 .) HE4, en kjent kandidat markør for eggstokkreft [30], [31] ble oppregulert (8,8 ganger p. 0,001) i murine plasma datasettet Noen proteiner fra denne listen har også blitt identifisert i tumor studier som klinisk utfall prediktorer (NOV, CLU TNC, POSTN, IGFBP2, LCN2) eller formidlere av resistens mot kjemoterapi (CLU, FBLN1, THBS, STIP1, PTGES3, IGFBP4, ATOX1) [32] -. [45]
58 de 106 oppregulert proteinene i mus plasma-analyse ble funnet å være også anriket på overflaten eller utskilt sub-cellulære avdelinger av eggstokkreft celler. Pathway analyse av disse 58 proteinene identifiserte fire vesentlige nettverk ved hjelp av oppfinnsomhet (figur 2 og figur S1) og fem nettverk med MetaCore arbeidsflyt (figur S2). de mest utbredte prosessene fremhevet i oppfinnsomhet nettverk inkludert tumorvekst, celledeling og apoptose, regulering av svulstens mikromiljø, angiogenese, cellemigrasjon, invasjon og metastasering (tabell S5). En ekstra vurdering ved hjelp MetaCore sin berikelse verktøy på tvers GeneGo ontologier og Gene ontologi (Figur S2, Figur S3, Table S6) bekreftet celle adhesjon, spredning, utvikling og ekstracellulære matrise ombygging som betydelige representert prosesser. De to øverste nettverk generert av Oppfinnsomhet understreke betydningen av TGFB-mediert regulering av celleproliferasjon, metabolisme og cytoskeletal ombygging (figur 2, tabell S5), sammenfallende resultater de MetaCore berikelse (Figur S3). I tillegg til TGFfi, andre sentrale noder (med både kløkt og MetaCore) inkluderer MMP2, p38MAPK, NFkB, og RAS, alle kjent for å være viktig i eggstokkreft [46], [47]. Pathway analyse av de 48 proteinene som ble funnet å være oppregulert i museplasma med tumorutvikling, men ikke identifisert som utskilte eller overflatemembranproteiner i eggstokkreft celler ga tre betydelige nettverk med oppfinnsomhet (figur S4, S5 tabell). Listen inkluderte mulige inflammatoriske proteiner som haptoglobin (HP), S100A8 og CCL8. Kategoriseringen av oppregulert proteiner i plasma basert på berikelse i eggstokkreft celler underfraksjoner ga et middel for å vurdere hvilke oppregulert proteiner i plasma ble mer sannsynlig avledet fra kreftceller, og som proteiner ble mer sannsynlig relatert til vert-reaksjon.
Topp to nettverk (A, B) tildelt av Oppfinnsomhet Pathway Analysis for oppregulert proteiner i mus plasma som ble også beriket i kreftcellelinje data. Sentrale noder inkluderer TGFfi, PI3K, MMP-2, Ras og MAPK. Proteiner farget i rødt representerer oppregulert proteiner og ikke-fargede proteiner er de tildelt av oppfinnsomhet databaser som mulige mellom interaksjoner som basert på oppfinnsomhet database. Solide linjer indikerer ingen direkte relasjoner (to molekyler gjør fysisk kontakt) og stiplede linjene indikerer indirekte relasjoner (krever ikke fysisk kontakt). Poengene for A) og B) er henholdsvis 51 og 24.
immunoblotanalyse av mus og menneske Prøver
Et sett av proteiner identifisert i eggstokkreft celler og funnet å være oppregulert i plasma fra tumorbærende mus, TIMP1, LCN2, IGFBP2, PFN1, SPARC, EEF1B2, CLU, og FBLN2, ble valgt for immunoblot analyse ved hjelp av svulstvev hentet fra musemodeller, klimaanlegg media fra menneskelige eggstokkreft cellelinjer, og primær ovarietumorer fra mennesker. Det ble observert økt proteinnivå for Timp1, Lcn2, IGFBP2, Pfn1, og Sparc i eggstokkene tumorvev isolert fra K-ras /PTEN (figur 3A) og PTEN /APC (figur 3B) eggstokkreft musemodeller i forhold til å kontrollere vev lysatene. Tilsvarende berikelse i TIMP1, LCN2, IGFBP2, PFN1, SPARC, EEF1B2, CLU, og FBLN2 ble observert i kondisjonert medium (CM) samlet inn fra eggstokkreft cellelinjer avledet fra serøse adenokarsinomer (ovčar-3, SKOV3, CaOV3, OVCAR-5 , OVCAR-8), endometrioid karsinom (TOV112D), klar cellecarcinom (ES-2, IGROV1) sammenlignet med kondisjonert medium avledet fra humant ovarie flate epitel (HOSE, figur 3C). I tillegg ble uttrykk nivåer av TIMP1, LCN2, PFN1, IGFBP2, SPARC, EEF1B2, CLU, og FBLN2 forhøyet i eggstokkene tumor lysatene sammenlignet med kontroll vev fersk samlet fra pasienter som gjennomgår kirurgi (figur 3D).
Protein nivåer av TIMP1, LCN2, PFN1, IGFBP2, SPARC, EEF1B2 og CLU ble bestemt ut fra følgende: (A) normal eggstokkvev (N) og ovarietumorer (T) isolert fra K-ras /PTEN, eller (B) PTEN /APC musemodell for kreft i eggstokkene, (C) kondisjonert medium (CM) fra normale humane flate epitel cellelinjer (slangen) og eggstokk-kreft-cellelinjer og (D) humane primære vev (HPT): normal ovarievev (N) og eggstokk- tumorer (t). For mus forberedelser, ble vev lysater fremstilt fra normale eggstokker og svulster tatt fra samme dyr (a-d) sammen med fire-fem svulster fra separate dyr (e-I). For menneskelige primærtumor (HPT) prøver, ble vev lysater fremstilt fra 4 tumorprøver forbundet med deres respektive normalt vev fra samme pasient og 3 enslige tumorprøver, der ingen normale prøver var tilgjengelige. Pasientprøver er som følger: pasient # 14 hadde uavhengige bilaterale serøse border svulster i venstre (TL) og høyre eggstokk (TR), svulster # 3, # 7 og # 15 er papillær serøs karsinomer, tumor # 12 er en epitelial border svulst i Mullerian-type, med endocervikale mucinous og serøs differensiering, svulst # 13 er klar cell carcinoma, og svulst # 16 er endometrioid adenokarsinom.
ELISA-analyser ved hjelp av musen og samfunns Plasmas
Vi testet videre en undergruppe av proteiner som finnes ved massespektrometri til å være oppregulert i plasma fra tumorbærende mus, for sine nivåer i humane og murine plasma. Vi har også, sammenlignet ytelsen til proteiner som finnes å bli utskilt av eggstokkreft celler, men ble heller ikke identifisert i mus plasma eller ikke funnet å være forhøyet i plasma fra tumorbærende mus. 25 proteinene ble valgt basert på tilgjengeligheten av ELISA-analyser. For muse analyser, vi vurderte nivåer av Timp1 og Lcn2 i biologiske væsker og plasmaer fra svulst bærende mus (fase I /II, n = 6; Stage III /IV, n = 5; kontroller, n = 18). Timp1 nivåer i fase I /II og trinn III /IV Prøvene ble øket 5,9 ganger (p 0,0001) og 9,5-ganger (p 0,0001) sammenlignet med kontroller, respektivt (figur 4A). Lignende funn ble observert for Lcn2 (figur 4B). Vi videre undersøkt om Timp1 og Lcn2 ble beriket i væske utvunnet fra sent stadium ovarietumorer og i peritoneal ascites gitt nærhet av disse væsker til eggstokkreft celler og utskilles natur proteiner. Timp1 nivåene ble forhøyet mer enn 400 ganger og 250 ganger i ovarian tumor væske og peritoneal ascites forhold til murine plasma, henholdsvis (figur 4C). Likeledes Lcn2 hadde et lignende mønster med en 79- og 19-fold økte nivåer i eggstokktumor væske og peritoneal ascites, henholdsvis (figur 4D), i samsvar med sin aktive utskillelse i omkringliggende væske av kreftceller.
TIMP1 og LCN2 nivåer i murine plasma på ulike stadier av tumorprogresjon ble bestemt ved hjelp av ELISA som beskrevet i Materialer og metoder (A, B). Også vist er TIMP1 (C) og LCN2 (D) -nivåer hos murine ovarial tumor væske og peritoneal ascites i forhold til plasma. Statistisk signifikans ble bestemt ved bruk av en to-tailed t-test * p 0,05, ** p 0,01, og *** p. 0,0001 sammenlignet med kontroller
De 25 proteiner valgt for analyser i human plasma var enten: 1) oppregulert i mus plasma, 2) uttrykt ved eggstokkkreftceller, eller 3) både oppregulert i museplasma og uttrykt av eggstokkreft celler. Den første sett av menneskelige plasmaer, heretter kalt Set 1, besto av plasmaprøver fra 13 kvinner med ovarialcancer (n = 3 tidlig stadium, n = 10 sent stadium) og 56 friske kvinner. Alle prøvene i Set 1 ble samlet inn i klinikken, under ikke-kirurgiske tilstander (Tabell S7). Analyseresultatene fra Set 1 er oppsummert i Tabell S2, sammen med mus plasma og cellelinje-data som brukes for å velge de proteiner for testing. Nivåene av åtte av de 25 proteiner, GRN, IGFBP2, THBS1, RARRES2, TIMP1, PPBP, CD14, og NRCAM, ble funnet å være statistisk signifikant (p 0,05) forhøyet hos nydiagnostiserte pasienter med eggstokkreft sammenlignet med kontroller (tabell 1, figur 5).
i Set 1, proteinnivåer hos kreftpasienter ble sammenlignet med nivåene i friske kontroller, med alle prøver innsamlet i klinikken under ikke-kirurgiske betingelser. I Set 2, ble protein nivåer i kreftpasienter sammenlignet med kontroller med alle prøver samlet inn i operasjonssalen etter kirurgiske tilstander. Logistisk regresjon ble brukt for å bestemme statistisk signifikans av endringer i proteinnivåer mellom veske og kontrollgrupper. For Set 2, ble p-verdiene for de tidlige og sene stadier beregnes dersom p-verdien var betydelig i hele settet 2 (alle tilfeller). * P 0,05, ** p 0,01, og *** p 0,0001 for saker sammenlignet med kontrollene. Markør nivåer ble normalisert for å gi friske kontroller en middelverdi fra 0 og et standardavvik på 1. De y-akser representerer de standardiserte markør nivåene.
Interessant, 5 av de 8 proteinene funnet opp -regulated i Set 1 (GRN, IGFBP2, THBS1, RARRES2, og TIMP1) ble utskilt proteiner fra krysset mellom mus plasma og kreft celledata. PPBP ble et utskilt protein som finnes oppregulert i mus plasma, men ikke oppdaget i eggstokkreft cellelinjer, mens CD14 og NRCAM var celleoverflateproteiner fra eggstokkreft cellelinjer, og ble ikke kvantifisert i mus plasma.
De 8 proteinene som viste statistisk signifikant økt nivå i Set 1 analyser ble testet videre i et ekstra sett med menneskelige plasmaprøver, heretter kalt Set 2. Set 2 besto av plasmaprøver fra 55 kvinner med ovarialcancer (n = 31 tidlig stadium, n = 23 sent stadium, og n = 1. trinn ukjent) og 39 kontroller som gjennomgår kirurgi. Alle prøvene i Set 2 ble samlet inn i operasjonssalen etter kirurgiske tilstander (Tabell S7). Av de 8 proteinene funnet signifikant i Set 1, 5 proteiner (GRN, IGFBP2, RARRES2, TIMP1, og CD14) ble bekreftet å være oppregulert i Set 2 (tabell 1, figur 5). Spesielt alle 5 av proteiner ble statistisk signifikant forhøyet i tidlig stadium prøvene.
Av de 25 proteiner som ble analysert, ti hadde samstemmige funn i mus plasma og celle linje. Interessant, fem proteiner som var til stede i skjæringspunktet mellom kandidater fra mus plasma og cellebefolkningsdata (GRN, IGFBP2, THBS1, RARRES2, og TIMP1), ble funnet å være signifikant oppregulert i Set 1 og fire av de fem proteiner ble bekreftet i Sett 2, med THBS1 som unntak.
Prøvetaking forhold kan påvirke nivåene av sirkulerende proteiner. For eksempel kan pasienter som har blodprøver tatt ved tidspunktet for kirurgi har økte nivåer av visse proteiner som et resultat av stress [48]. Ved hjelp av en tidligere beskrevet metode [48], evaluert vi enten protein nivåer skilte mellom case og kontrollgrupper etter justering for betingelsene for blodprøvetaking. I prøvene anvendt for analyser, syv kreftpasienter eggstokk hadde blodprøver ved to tidspunkter: før operasjonen, og ved tidspunktet for kirurgi. De proteinnivåer ved begge tidspunkter for hver pasient er vist i fig S5. Regresjonsanalyser ble utført ved hjelp av generalisert estimering av ligningene (GEE) metoder [48] for å gjøre rede for sammenhengen i protein nivåer av 7 kvinner med to blod samlinger, og gi p-verdier som er objektiv med flere blod trekker fra de samme kvinnene (tabell S8). Justert for betingelsene for blodprøvetaking, de fem proteiner tidligere funnet betydelige i Set 1 og Set 2 logistisk regresjonsanalyse, ble også funnet signifikante i GEE modell for saken mot sunn kontroll sammenligning. For en sekundær GEE modell, ble koeffisienten for blodprøvetaking forholdene fast fra første GEE analyse for å unngå skjevhet fra montering. Den andre analysen ble begrenset til prøver innsamlet ved kirurgi og alle 5 proteiner funnet signifikant i den første analysen var betydelig i saken kontra ikke-sak, tidlig case versus ikke-sak, og sent saken versus ikke-sak sammenligning. Disse resultatene støtter funnene fra logistisk regresjon og vise at IGFBP2, TIMP1, RARRES2, CD14, og GRN er forhøyet i alle tilfeller sammenlignet med kontroll og viktigere i tidlige tilfeller sammenlignet med kontrollene.
GRN har blitt beskrevet som en antatt ny vekstfaktor for eggstokkreft, og ble funnet å være sterkt utskilt av eggstokkreft celler [49]. Økte nivåer av GRN og RARRES2 i plasma fra eggstokkreft pasienter i både tidlig og sent stadium tilfeller er en roman funn i denne studien. CD14, og IGFBP2 har tidligere blitt analysert i serumet fra eggstokk-cancerpasienter [37], [50], [51]. De var signifikant forhøyet i denne studie i mus plasma og anriket i det utskilte proteinfraksjon av ovarian cancer-cellelinjer. Et funn av interesse i vår studie er forekomsten av økte nivåer av IGFBP2 og CD14 i tidlig stadium sykdommen. TIMP1 utført viste også økte nivåer i både tidlig og sent stadium tilfeller. Celle linje indikerte at TIMP1 ble løslatt fra eggstokkreft celler ved nanogram per million kreftceller per time [18] som ville stå for økte nivåer i menneskelig eggstokkreft pasientprøver.
Diskusjoner
Det er for tiden en begrenset forståelse av de forandringer i plasmaproteiner som oppstår ved utvikling av ovarietumorer og for de fleste tumortyper generelt [52], [53]. Oppdagelsen av nye plasma markører har representert en betydelig utfordring, særlig for markører som er aktuelt for tidlig stadium sykdommen. Analyse av høye-dimensjonale genomisk, transcriptomic eller proteomikk data muliggjør berørte veier, nettverk og signal noder på å bli utforsket [53], [54]. Denne studien gir bevis for nytten av å integrere data fra dybde kvantitativ proteom analyse av musemodeller av kreft med data fra humane kreftceller for biomarkør identifikasjon. Her har vi brukt en musemodell for ovarialcancer i kombinasjon med IPAS proteomikk plattform for å tillate oss å vurdere pålitelig og kvantifisere endringene omfatter lav overflod proteiner i mus plasma med svulst utvikling [53]. Integrasjon med data fra humane ovarie cancer-cellelinjer ga et middel for å vurdere hvilke oppregulert proteiner ble uttrykt i kreftceller. I tillegg signale noder som bidro oppregulert proteiner i plasma ble bestemt. Som et resultat av proteiner som sannsynligvis stammer fra inflammatoriske og immunrespons endringene var skilles fra proteiner som mer sannsynlig resultat av sekresjon av tumorceller eller fra tumorigene prosesser. Endringer i svulstens mikromiljø og ECM er forbundet med autokrint regulering. ECM-proteiner er tidligere blitt identifisert som ovarie cancer metastase signatur gener [55], [56]. Endringer i cytoskjelettet ble observert inkludert cytoskeletal-mediert migrasjon, heft, og invasjon. Til slutt ble det observert celleforandringer spredning og innlemmet celle apoptose. Flere sentrale signal noder ble identifisert i denne studien inkludert TGFfi, MMP2 og NFkB signalering. TGFfi, signalering i særdeleshet er sentralt for en rekke prosesser, inkludert celleproliferasjon og apoptose, ECM remodellering, cellemigrering, adhesjon, invasjon og metastase, angiogenese og inflammasjon og immunovervåkning [57], [58]. Den TGFp-familien er en aktiv mål for kreft forebygging og terapi [57], [58]. Interessant er TGFp kjent for å ha både tumor suppressor og pro-oncongenic effekter i forskjellige krefttyper, inkludert ovarie [59]. TGFB spiller også en rolle i epiteliale stamcelle nisje homeostase [60], og sletting av TGFB reseptor induserer en svært proliferativ og invasiv miljø [61]. Tumbar et al. også fastslått at tap av TGFp-reseptorer i kombinasjon med onkogene Ras forbedret tumorgenisitet. Denne hypotese støttes også av de genererte nettverk i vår sti-analyse (figur 2B), hvori NFkB (antagelig under kontroll av TGFp) er tilordnet til å utløse Ras, PI3K, og MAPK signalering mot aktin-formidlede responser driving cellulær migrasjon, EMT , invasjon og metastasering [59]. Denne rollen TGFB signale minner om dens virkninger på embryonale stamceller pluripotency og utvikling embryonale vev, inkludert eggstokk [62] – [64]. I samsvar med denne hypotesen, flere nettverk illustrert med sti-analyse (Figur S1) for sent stadium proteomet høydepunkt Notch og Dkk3, kjente stamcelle effektorer [65], [66]. Det er derfor ikke overraskende at dette effektor er dominerende i plasma og cancercellelinjedata, som støtter den nåværende rolle TGFp som den utløser en rekke reaksjoner som er relevante for kreftprosesser (proliferasjon, apotosis, inflammasjon, angiogenese, autorcrine-regulering av tumor mikromiljøet /ECM og heft, invasjon og metastasering).
i et søk etter potensielle eggstokkreft biomarkører, utførte vi en roman integrerende analyse ved å sammenligne mus plasma proteomet data med human cellelinje og ascites avledet tumorcelle data.
