Abstract
Ex vivo
-Utvidet, allogen naturlig killer (NK) celler som kan anvendes for behandling av forskjellige typer kreft. Ved allogen NK-celleterapi, må NK-celler fra friske donorer utvides for å oppnå et tilstrekkelig antall svært rensede, aktiverte NK-celler. I denne studien har vi etablert en forenklet og effektiv metode for storstilt utvidelse og aktivering av NK-celler fra friske givere henhold Good Manufacturing Practice (GMP) forhold. Etter et enkelt trinn med magnetisk uttømming av CD3
+ T-celler, ble utarmet perifere mononukleære blodceller (PBMC) stimulert og utvidet med bestrålte autologe PBMC ved tilstedeværelse av OKT3 og IL-2 i 14 dager, noe som resulterer i et høyt ren populasjon av CD3
-CD16
+ CD56
+ NK-celler som er ønskelig for allogen formål. Sammenlignet med nylig isolerte NK-celler, disse utvidede NK-celler viste sterk cytokinproduksjon og potent cytolytisk aktivitet mot forskjellige kreftcellelinjer. Av notatet, utvidet NK-celler selektivt drept kreftceller uten å demonstrere cytotoksisitet mot allogene ikke-tumorceller i coculture analyser. Antitumoraktiviteten av ekspanderte humane NK-celler ble undersøkt i SCID-mus injisert med humane lymfomceller. I denne modellen, ekspanderte NK-celler effektivt kontrollert lymfom progresjon. I konklusjonen, ble allogene NK-celler effektivt utvidet i et GMP-kompatibel anlegget og demonstrert potent anti-tumor aktivitet både
in vitro Hotell og
in vivo
Citation. Lim O, Lee Y, Chung H Hennes JH, Kang SM, Jung Min, et al. (2013) GMP-kompatibel, storskala Utvidede Allogen naturlige drepeceller Har Potent Cytolytiske aktivitet mot kreftceller
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 8 (1): e53611. doi: 10,1371 /journal.pone.0053611
Redaktør: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxembourg
mottatt: 3. september 2012; Godkjent: 29 november 2012; Publisert: 11 januar 2013
Copyright: © 2013 Lim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en bevilgning fra Korea Healthcare teknologi R D Project, departementet for helse, velferd Familiedepartementet, Republikken Korea (A062260). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Eui-Cheol Shin er en PLoS ONE Editorial styremedlem, og forstår at dette gjør ikke endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: MJ og HS er ansatt i Green Cross LabCell Corp. Mogam Bioteknologi Research Institute er en non-profit forskningsstiftelse. Patent nummer: KR2008-74069. Dato Patent Utstedt: 28. mars 2012. Tittel på Patent: Vekst metode for naturlige drepeceller. Oppdragstakeren: Green Cross LabCell Corp og Seoul National University Hospital. Inventor: Mi-ung Jung, Dae Seog Heo, og Yu Kyeong Hwang. Patent nummer: JP2011-521023. Dato Patent Filed: 31. januar 2011. Tittelen på Patent: Vekst metode for naturlige drepeceller. Oppdragstakeren: Green Cross LabCell Corp og Seoul National University Hospital. Inventor: Mi-ung Jung, Dae Seog Heo, og Yu Kyeong Hwang. Patent nummer: CN200980130121.5. Dato Patent Filed: 30. januar 2011. Tittelen på Patent: Vekst metode for naturlige drepeceller. Oppdragstakeren: Green Cross LabCell Corp og Seoul National University Hospital. Inventor: Mi-ung Jung, Dae Seog Heo, og Yu Kyeong Hwang. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. De andre forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.
Innledning
Natural killer (NK) celler er spesialiserte lymfocytter som gir en første forsvarslinje mot virusinfeksjoner og kreft [1]. NK-celleaktivitet er regulert av signaler fra aktivere og inhibitoriske reseptorer [2]. NK-aktiverende signal er mediert av flere NK reseptorer, inkludert NKG2D og naturlige cytotoksiske reseptorer (NCR) [2], [3]. I motsetning til dette er NK inhibering overdratt til killer-celle immunoglobulin-lignende reseptorer (kirs), som binder til MHC klasse I molekyler på målceller [2], [4]. MHC klasse I ekspresjon en tendens til å gå tapt eller bli nedregulert i kreftceller [5] og som en konsekvens, blir NK hemmende signal oppheves, slik at NK-celler til å bli aktivert og drepe ondartede mål.
Nylig anti-tumoraktiviteten til NK-celler er vist i innstillingen av allogene hematopoetisk stamcelletransplantasjon (HSCT) [6]. På T-celle-fratatte HSCT, donor NK-celler er de viktigste effektorceller ansvarlig for å kontrollere gjenværende cancerceller [7]. Den graft-versus-tumor (GVT) aktivitet av donor NK-celler er betydelig forbedret når kirs og MHC klasse I er inkompatible mellom donor og mottaker, som inhiberende signaler er fraværende [8], [9]. Derfor øket GVT aktivitet av NK-celler med KIR-MHC uforenlighet er den underliggende begrunnelsen for utvikling av allogene NK-celle-terapi.
I allogeneiske NK-celleterapi, NK-celler fra friske donorer, fremstilles ved
ex vivo
ekspansjon og aktivisering, og blir deretter gitt til kreftpasienter [10]. Allogene NK-celler fra friske donorer er overlegne i forhold til autologe NK-celler fra kreftpasienter, som blir funksjonelt svekket i løpet av tumorprogresjon [11], [12]. I tillegg er anti-tumor effekt av allogene NK-celler forbedret gjennom donor-mottaker inkompatibilitet mellom kirs og MHC klasse I-ligander [13].
For å muliggjøre terapeutiske anvendelse av allogene NK-celler i kliniske omgivelser , må skaffes et tilstrekkelig antall av høyanriket NK-celler. Ulike metoder for
ex vivo
NK celle ekspansjon med klinisk grad har blitt rapportert [14]. Selv om NK-celler differensiert fra navlestrengsblod [15] eller NK-92-celler [16] er blitt anvendt for terapi, blir perifere mononukleære blodceller (PBMC) oppsamlet fra fullblod eller leukaferese benyttet som generelle kilder til NK-celler [17], [18]. På grunn av den fordel aseptisk samling i et lukket system, har PBMC samling ved leukaferese blitt vanlig anvendt for god fremstillingspraksis (GMP) kompatibelt utvidelse av NK-celler [14]. Den generelle ekspansjonsprosessen for allogen programmet starter med to sekvensielle trinn av magnetisk uttømming av CD3
+ T-celler og berikelse av CD56
+ NK-celler [19] – [21]. For å stimulere NK-celleformering, bestrålte feeder-celler, slik som PBMC-[19], Epstein-Barr-virus-transformerte lymfoblastoide cellelinjer (EBV-LCLer) [20] eller konstruerte leukemiske cellelinjer [21] blir ofte brukt. Bestrålte feeder-celler stimulere NK-celler gjennom både humorale faktorer og direkte celle-til-celle kontakt [22].
I denne studien har vi etablert en forenklet og effektiv metode for storstilt utvidelse og aktivering av NK celler fra friske frivillige under GMP forhold. Etter et enkelt trinn med magnetisk uttømming av CD3
+ T-celler, ble utarmet PBMC stimulert og utvidet med bestrålte autologe PBMC ved tilstedeværelse av OKT3 og IL-2 i 14 dager, noe som resulterer i en meget ren populasjon av CD3
-CD16
+ CD56
+ NK-celler som er ønsket for allogen formål. Disse cellene viste potent cytotoksisitet mot tumorceller
in vitro
, mens sparsom allogene ikke-tumorceller. De effektivt kontrollert tumorprogresjon i en SCID-musemodell for human lymfom. Til sammen ble allogene NK-celler effektivt utvidet i et GMP-kompatibel anlegget og demonstrert potent anti-tumor aktivitet både
in vitro Hotell og
in vivo
.
Materialer og Metoder
Etikk uttalelse
Alle studie prøvene ble oppnådd etter oppkjøpet av deltagerne skriftlig informert samtykke, i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Denne forskningen protokollen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board of Seoul National University Hospital (Permit Number: H-1004-027-315).
NK celle forberedelse og utvidelse
PBMC ble isolert fra friske donorer av leukaferese. CD3
+ T-celler ble oppbrukt av VarioMACS (Miltenyi Biotec, Tyskland). T-celle-fratatte PBMC ble ekspandert ved en seeding konsentrasjon på 2 x 10
5-celler /ml i Cellgro SCGM serumfritt medium (CellGenix, Tyskland) med 1% auto-plasma, 1 x 10
6 celler /ml bestrålt (2000 rad) autologe PBMC, 10 ng /ml anti-CD3 monoklonalt antistoff OKT3 (Orthoclon, Sveits) og 500 IU /ml IL-2 (Proleukin, Sveits) i en A-350N kultur pose (NIPRO, Japan). OKT3 ble supplert bare en gang ved begynnelsen av utvidelsen for å stimulere T-cellepopulasjonen i de bestrålte feeder-celler. NK-celler ble tilført friskt medium med 500 IU /ml IL-2 annenhver dag uten fjerning av forhåndsdefinert kulturmedium for å opprettholde cellekonsentrasjonen på 1~2 x 10
6 celler /ml i 14 dager. Levedyktigheten av ekspanderte NK-celler ble evaluert ved farging av propidiumjodid. NK-cellen utvidelse ble utført under betingelsene for GMP på Green Cross LabCell Corp. (Korea).
humane cellelinjer
K562, Jurkat, SW480, Ramos og Raji celler ble hentet fra amerikansk Type Culture Collection (ATCC). SNU398 celler ble innhentet fra koreanske cellelinje Bank (KCLB). Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (GIBCO) tilsatt 10% føtalt bovint serum (GIBCO). Alle cellelinjer ble opprettholdt i logaritmisk fase vekst ved 37 ° C i en fuktig atmosfære tilsatt 5% CO
2.
Immunfarging og flowcytometrisk analyse
NK-celler ble farget med den egnede monoklonale antistoffer som følgende: anti-CD56-PE-Cy5 (B159), anti-CD3-FITC (UCHT1), anti-NKp30-PE (P30-15), anti-NKp44-PE (P44-8.1), anti- NKp46-PE (9E2 /NKp46), anti-DNAM-1-PE (DX11), anti-CD25-PE (M-A251), anti-CD158b-FITC (CH-L) (alle fra BD Biosciences), anti- NKG2A-PE (131411), anti-NKG2C-PE (134591), anti-NKG2D-PE (149810), anti-CD69-PE (298614) (alle fra R BD Biosciences), BD GolgiStop ™ og BD GolgiPlug ™. Cellene ble farget med anti-CD56-APC-eFluor®780, permeabilized av BD CytoFix /CytoPerm ™ og videre farget med anti-IFN-γ-PE (B27, BD Biosciences) eller anti-TNF-α-PE-Cy7 (Mab11 ; eBioscience). Prøvene ble ervervet på en BD FACS Canto II eller LSR Fortessa og data ble analysert ved hjelp FlowJo programvare (TreeStar Inc., OR).
51 Cr-release cytotoksisitet analysen
En standard 4 h
51Cr-frigivelse cytotoksisitets-analysen ble utført. Målceller ble merket med 100 uCi
51Cr-natriumkromat (BMS), og inkubert med NK-celler ved tre forskjellige E:T forhold i U-bunn 96-brønners plater (Nunc, Danmark). Spontan frigjøring og maksimal frigivelse ble bestemt ved inkubering av målcellene uten effektorer i medium alene eller i 4% Triton X-100, respektivt. Analysen ble utført in triplo. Radioaktivitet ble tellet i en gammateller, og prosentandelen av spesifikk lyse ble bestemt i henhold til formelen:% spesifikk lysis = [(middel eksperimentell cpm frigivelsesmiddel spontan cpm frigivelse) /(gjennomsnittlig maksimal cpm frigivelsesmiddel spontan cpm frigivelse)] × 100. For blokkerende eksperimenter, NK-celler ble for-inkubert med 10 ug /ml anti-mus IgG1κ (MOPC-21, BD Biosciences), 10 ug /ml anti-DNAM-1 (DX11; BD Biosciences), 2 ug /ml anti- NKG2D (149810; R BioLegend) i 30 minutter ved 4 ° C, og
51 Cr-release assay ble utført mot SW480 og SNU398 på E:T forhold på 10:01. Inhibering av dreping ble beregnet som en prosentandel av inhibisjon av isotype kontroll-antistoff.
Strømningscytometrisk analyse av cytotoksisitet
Cytotoksisitet av ekspanderte NK-celler mot allogene PBMC ble evaluert ved flow-cytometrisk analyse cytotoksisitet. K562 tumor-målceller ble merket med 100 nM kalsein-AM (Molecular Probes, Eugene, OR), og allogene eller autologe PBMC målceller ble merket med anti-HLA-klasse I. Expanded NK-celler, merket K562 target-celler, og merket PBMC målceller ble cocultured i forholdet 03:01:01 i 2 timer. Døde celler ble farget med 7-AAD (BD Biosciences). Prosentandelen av spesifikk lyse ble bestemt i henhold til formelen:% spesifikk lyse = (gjennomsnittlig% av 7-AAD
+ celler i brønner med NK coculture) – (gjennomsnitt% av 7-AAD
+ fargede celler i brønner med mål only)
in vivo
studie i SCID mus
CB-17-Prkdc
SCID-mus (Animal Resources Centre, Australia) ble brukt på 7 uker av alder. SCID-mus ble plassert i mikroisolatorbur, og all mat, vann og håndklær ble autoklavert før bruk. Ekspanderte NK-celler ble merket med 5 uM CFSE (Sigma), og 2 x 10
7 av de CFSE-merkede celler ble injisert intravenøst i hver mus. Mus ble avlivet 2, 24, 48, 72 og 168 timer under generell anestesi. Enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt fra viktige organer som lunger, milt, perifert blod, lever, lymfeknuter, benmarg, nyrer, eggstokker, testikler og hjerne. Prosentandelen av CFSE
+ celler ble analysert i lymphogating ved strømningscytometrisk analyse av enkeltcellesuspensjoner fra serielle sampler. For å evaluere anti-tumor effekt av ekspanderte NK-celler, CB-17-Prkdc
SCID-mus ble injisert intravenøst i halevenen med 1 x 10
5 Raji-celler og 1 x 10
7 ekspanderte NK-celler i 400 mL PBS på dag 0. Tre tilleggsdoser med utvidet NK-celler (1 x 10
7cells /mus) ble administrert innen ni dager. Det monoklonale anti-CD20-antistoff, rituximab (0,01 ug /mus) ble injisert subkutant ved tidspunktet for den første administrering av ekspanderte NK-celler. Individuelle mus ble overvåket daglig for tumorassosiert sykelighet og dødelighet. Spesielt ble den unormale stilling av baklemmene som følge av en manglende evne til å forlenge baklemmene notert. Når musene viste tegn til tumorassosiert morbiditet slik som overdreven vekttap, slapphet og /eller nød, de ble avlivet i henhold til institusjonelle retningslinjer dyr omsorg. Narkose ble indusert ved en intramuskulær injeksjon av 100 mg /kg ketamin (Yuhan, Korea) og 12,5 mg /kg xylazin (Rompun, Bayer). Animal bolig, håndtering, og alle prosedyrer som involverer mus ble godkjent av den institusjonelle komiteen i Mogam Bioteknologi Research Institute (Permit Number: MG-10-111A), og alle forsøkene ble utført i samsvar med nasjonal retningslinje styrende dyr omsorg i Korea
Statistisk analyse
uparet t-test ble brukt for å sammenligne cytotoksisitet og cytokin sekresjon av NK-celler før og etter utvidelsen. Den paret t-test ble brukt for å sammenligne overflaten markør uttrykk for NK-celler før og etter utvidelsen. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism programvare (GraphPad Software Inc., CA).
Resultater
Egenskaper i stor skala, GMP-utvidet NK-celler
I dagens studie, vi effektivt utvidet NK-celler fra friske donorer ved dyrking av T-celle-fratatte PBMC og bestrålte autologe PBMC i nærvær av IL-2 og OKT3 i 14 dager i en GMP-kompatibel anlegg. På dag 14 ble produktene, kalt MG4101, sammensatt av høyanriket CD3
-CD56
+ (98,10 ± 0,88%) eller CD56
+ CD16
+ (97,43 ± 1,66%) NK-celler med minimal forurensning av CD3
+ T-celler (0,06 ± 0,14%), CD14
+ monocytter (0,09 ± 0,14%) eller CD19
+ B-celler (0,04 ± 0,07%) (fig. 1A-B ). Under dyrkningen ble NK-celler ekspandert 691,4 ± 170,2 fold (fig. 1 C) med 95,2 ± 1,9% levedyktighet (fig. 1D). I cytotoksisitetsanalyser mot forskjellige tumorceller, ekspanderte NK-celler som utøves øket cytolytisk aktivitet sammenlignet med nylig isolerte NK-celler (fig. 1E). Den kraftig aktivitet av ekspanderte NK-celler ble også demonstrert ved degranulering markør CD107a, og ved sekresjon av IFN-γ og TNF-α under coculture med K562-celler (fig. 1F).
(A-B) T- celle utarmet PBMC ble utvidet under GMP forhold beskrevet i Materialer og metoder. Prosentandelen av CD3
-CD56
+, CD56
+ CD16
+, CD3
+, CD14
+ og CD19
+ celler ble analysert ved flowcytometrisk analyse ( B, n = 8). Representative FACS prikkplotter presenteres (A). (C) Et gangers ekspansjon av NK-celler, ble bestemt før (D0) og etter (D14) NK-celle utvidelse (n = 8). (D) Levedyktigheten av ekspanderte NK-celler ble evaluert ved farging av propidiumjodid. (E) Cytotoksisitet av NK-celler, mot forskjellige tumorceller ble sammenlignet før (D0) og etter (D14) NK-celle utvidelse (n = 4). Den effector:target forholdet var 10:01. (F) NK-celler ble cocultured med K562-celler på 01:01 forholdet i 4 timer, og farging for intracellulære cytokiner (IFN-y og TNF-a) og CD107a ble utført som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Dataene ble sammenlignet før (D0) og etter (D14) ekspansjon. Mean og SD presenteres. *
p
0,05; **
p
0,01; ***
p
. 0,001
Uttrykk av NK celle reseptorer i stor skala, GMP-utvidet NK-celler
Surface uttrykk for å aktivere eller hemmende NK-reseptorer ble analysert før og etter storstilt utvidelse. Blant aktiverende reseptorer, NKG2C, NKp30 og NKp44 økt betydelig i løpet av ekspansjon mens NKG2D, NKp46 og DNAM-en ikke (Fig. 2A). Uttrykk for de hemmende reseptorer, NKG2A og KIR holdt seg stort sett uendret på kultur, mens andelen CD158a
+ b
+ e
+, CD158a
+ e
+ og CD158b
+ e
+ NK-celler ble redusert (fig. 2B). Aktiveringsstatusen til de NK-celler ble evaluert ved farging for CD25, CD62L og CD69, som alle ble funnet å være øket på overflaten av ekspanderte NK-celler (Fig. 2C). Uttrykk for kjemokinreseptorer som CXCR3 og CXCR4 ble også vurdert. Hyppigheten av CXCR4
+ NK-celler ble signifikant økt i løpet av NK-celleutvidelse, mens frekvensen av CXCR3
+ NK-celler ble ikke endret (fig. 2D).
Overflate ekspresjon av aktiverende reseptorer (A ), inhibitoriske reseptorer (B), aktivering markører (C) og kjemokinreseptorer (D) ble analysert ved strømningscytometri før (D0) og etter (D14) NK-celle utvidelse (n = 10~12). Individuell eller koekspresjon av Kirs (CD158a, CD158b eller CD158e) ble beregnet ved boolske portene ved hjelp FlowJo programvare (B). *
p
0,05; **
p
0,01; ***
p
. 0,001
Cytotoksisk aktivitet mot forskjellige tumorcellelinjer
Deretter den cytotoksiske aktivitet av den ekspanderte NK-cellepopulasjon ble evaluert. Forskjellige tumorcellelinjer vises forskjellige nivåer av følsomhet overfor ekspanderte NK-celler (fig. 3A). For å forstå dette variert følsomhet, ble uttrykk for ligander for NK-reseptorer analysert på tumorcellelinjer. Av dem analysert for ekspresjon, de mest aktuelle ligandene var HLA klasse I, NKG2D-ligander; ULBP-en, ULBP-2 og MIC-A /B DNAM-1 ligander; CD112 (Nectin-2) og CD155 (Necl5). Den mest utsatt cellelinje, K562, uttrykt NKG2D ligander men ikke KIR ligand, HLA klasse I (fig. 3B). Jurkat, SW480 og SNU398 cellene uttrykte ikke bare NKG2D ligander, men også HLA klasse I, og var moderat utsatt for utvidet NK-celler. NK-følsomme målceller (K562, Jurkat, SW480 og SNU398) har en tendens til å over-express CD112 og CD155 i forhold til NK-resistente målceller (Ramos, Raji og PBMC). Av notatet, gjorde NK-celler ikke drepe allogene PBMC, som uttrykte HLA klasse I uten NKG2D og DNAM-1 ligander (Fig. 3A og B).
(A) Cytotoksisitet av ekspandert NK-celler mot ulike tumorcellelinjer ble analysert ved
51 Cr-release assay med den angitte effector:target (E:T) forholdet i tre eksemplarer. Cytotoksisitet mot normale PBMC ble også analysert. Assayet ble utført to ganger med utvidet NK-celler fra forskjellige donorer, og representative data ble presentert. Hver kurve som representerer middelverdi ± SD. (B) Uttrykk for HLA-klasse I, ULBP-en, ULBP-2, MIC-A /B, CD112 og CD155 ble analysert ved flowcytometri i ulike tumorcellelinjer og normale PBMC (heltrukne linjer). Grey histogrammet representerer isotype kontroller. (C) Expanded NK-celler ble pre-inkubert med blokkerende antistoffer for DNAM-1, NKG2D, NKp30 og /eller NKp44, og cytotoksisitet ble analysert mot SW480 eller SNU398 celler ved
51Cr-frigjøringsanalyse i tre eksemplarer. E:T forholdet var 10:01. Prosent inhibering av cytotoksisitet ble beregnet som en prosentandel av inhibisjon av isotype kontroll-antistoff. Assayet ble utført to ganger med utvidet NK-celler fra forskjellige donorer, og representative data blir presentert. Hver stolpediagram som representerer middelverdi + SD.
For å vurdere rollen til å aktivere NK-reseptorer, ble et cytotoksisk analyse med ekspanderte NK-celler i nærvær av blokkerende antistoffer som er spesifikke for NKG2D, DNAM-1, NKp30 og NKp44. Mens blokkerer et enkelt reseptor alene litt påvirket cytotoksisitet, blokkerer flere reseptorer ført til en betydelig reduksjon i cytotoksisitet. Spesielt blokkerer alle fire reseptorer inhiberes cytotoksisitet med over 85% (Fig. 3C). Således blir cytotoksisiteten av ekspandert NK-cellepopulasjonen synergistisk øket ved samtidig aktivering gjennom flere aktiverende NK reseptorer.
Fravær av cytotoksisk aktivitet mot allogene ikke-tumorceller
Klinisk bruk av ekspanderte NK-celler fra ubeslektede friske donorer kan føre til toksisitet på grunn av cytotoksisk aktivitet overfor allogeneiske utransformerte mottakercellene. For å vurdere potensialet for cytotoksisitet mot normale mottakercellene, ble utvidet NK-celler cocultured samtidig med K562-tumorceller og normale allogene PBMC, og den cytotoksisitet mot hverandre respektive mål ble evaluert. Cytotoksisitet mot allogene PBMC ble funnet å være ubetydelig (0,43 ± 0,27%) (fig. 4A) og kan sammenlignes med cytotoksisiteten mot de autologe PBMC (0,40 ± 0,40%) (Fig. 4B). Denne minimale cytotoksisitet ble ikke påvirket av nærvær eller fravær av K562-tumorceller. I mellomtiden, ekspanderte NK-celler drepes effektivt K562 tumor celler, uavhengig av tilstedeværelsen av allogene eller autologe PBMC (Fig. 4A-B). Derfor ekspanderte NK-celler effektivt diskriminert tumorceller fra normale allogene PBMC og selektivt drept transformerte celler. Svulsten spesifikke cytotoksisitet uten å drepe av allogene ikke-tumorceller mulig for oss å bruke de utvidede NK-celler fra urelaterte, friske donorer i en allogen setting.
Selektiv cytotoksisitet av utvidet NK-celler mot blandede mål for normale PBMC og K562-celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometrisk cytotoksisitet analyse som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. K562 tumor-målceller ble merket med kalsein-AM, og enten allogene (A) eller (B) autologe PBMC målceller ble merket med anti-HLA-klasse I. De ekspanderte NK-celler, de merkede målceller K562, og den merkede PBMC målceller ble cocultured i forholdet 03:01:01 i 2 timer. Døde celler ble farget med 7-AAD, og prosent spesifikk lyse ble beregnet. Cytotoksisitet mot PBMC (til venstre for hvert panel) og K562 celler (til høyre i hvert panel) er presentert separat. Analysen ble utført i duplisert. Hver søylediagram representerer gjennomsnittet + SD.
In vivo
anti-tumor aktivitet av utvidet NK-celler i SCID-mus
For
in vivo
studie av utvidet NK-celler, vi administreres CFSE-merket, utvidet menneske NK-celler til SCID-mus og overvåkes kinetikken sin distribusjon. Merkede NK-celler først dukket opp i lungene, der de bodde i 48 timer, deretter gradvis forsvant (Fig. 5A). I milten, perifert blod og lever, hyppigheten av de administrerte NK celler nådde sin topp på 48 timer, og deretter sank gradvis (fig. 5A). I benmargen, lymfeknuter, hjerne, nyrer, eggstokker og testikler, den oser CFSE
+ NK-celler ble minimalt registrert (≤1.1%) (tabell S1). All den NK-administreres musene syntes sunne lik kontrollgruppen i løpet av studien.
(A) CFSE-merkede NK-celler (2 x 10
7 celler /mus) ble injisert intravenøst SCID-mus. Mus ble avlivet 2, 24, 48, 72 og 168 timer, og prosentandelen av CFSE
+ celler i lungene, ble milt, perifert blod og lever analysert i lymphogating ved strømningscytometri (n = 4). Hver graf representerer gjennomsnitt ± SEM. (B-C) SCID-mus ble injisert intravenøst i halevenen med 1 x 10
5 Raji-celler og 1 x 10
7 ekspanderes NK-celler i 400 ul PBS på dag 0 (n = 10 /gruppe) . Ytterligere tre doser med utvidet NK-celler (1 x 10
7cells /mus) ble administrert innen ni dager. Det monoklonale anti-CD20-antistoff, rituximab (0,01 ug /mus) ble injisert subkutant ved tidspunktet for den første administrering av ekspanderte NK-celler. Tumor-assosiert lammelse (B) og overlevelse (C) ble overvåket. Effekten test ble bekreftet av ekstra sett med forsøk med 10 mus per hver gruppe, og representanten sett av dataene er presentert.
Neste, anti-tumor aktivitet av utvidet NK-celler ble undersøkt i SCID-mus intravenøst injisert med Raji-human B-celle lymfom celler. Sykelighet ble evaluert av hind ben lammelse, som Raji celler har ryggmarg tropisme, og dødelighet ble vurdert. Administrasjon av utvidet menneskelige NK-celler vesentlig avskaffet tumorprogresjon, noe som gjenspeiles av redusert sykelighet (Fig. 5B) og dødelighet (Fig. 5C). Effekten av utvidede humane NK-celler ble ytterligere forsterket ved samtidig bruk av lavdose rituximab (0,01 ug /mus), mens den samme dosen av rituximab uten NK-celler ikke forbedret sykdom utfallet. Denne dosen av rituximab anses å være ekstremt lavt og kan sammenlignes med 1 /25.000 av den vanlige dose hos mennesker [29]. I sammendrag, ekspandert NK-celler påvises
in vivo
anti-tumor-aktivitet i en murin tumormodell, og tilsetningen av tumor-spesifikt antistoff betydelig forbedret deres effekt, antagelig ved å utløse antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC).
Diskusjoner
kreft immunterapi har brukt flere typer immunceller, inkludert dendrittiske celler (DCS), cytotoksiske T-lymfocytter (CTL), lymfokin-aktiverte killer (LAK) celler, cytokin-indusert drapsmann (CIK) celler og NK-celler [23] – [26]. Selv om det har vært nylige fremskritt i DC terapi og CTL terapi, er klinisk anvendelse noe begrenset, siden cancerantigener først må karakteriseres [23], [24]. I motsetning til dette, LAK-celler, CIK-celler og NK-celler har antigen-uavhengig cytolytisk aktivitet mot tumorceller. Ofte er LAK celler eller CIK celler preparert fra kreftpasienter og autologously administreres etter
ex vivo
manipulasjon [25], [26]. I tilfelle av NK-celler, kan både allogene og autologe NK-celler anvendes for anti-cancerterapi. Tidligere arbeider har vist at allogene NK-celler kan trygt administreres til kreftpasienter [10]. Allogen NK-celleterapi er spesielt fordelaktig, da det forbedrer anti-kreft effekt av NK-celler via induksjon av donor-mottaker uforenlighet mellom kirs på donor NK-celler og MHC klasse I-ligander på mottaker vev [13].
i tidligere studier, ulike metoder for
ex vivo
NK-celle ekspansjon har blitt utviklet for klinisk anvendelse [14]. PBMC som samles ved leukaferese blir ofte brukt som en generell kilde for NK-celler, som har en fordel av aseptisk samling i et lukket system [14]. Den generelle ekspansjonsprosessen for allogen programmet starter med to sekvensielle trinn av magnetisk uttømming av CD3
+ T-celler og berikelse av CD56
+ NK-celler [19] – [21]. I den foreliggende undersøkelse, bare et enkelt trinn av magnetisk uttømming av CD3
+ T-celler som tilfredsstilte produktkvalitet i forhold til renhet og levedyktighet. På day14, ble det endelige produkt bestående av høyrent CD3
-CD56
+ NK-celler (98,10 ± 0,88%) med minimal forurensning av CD3
+ T-celler (0,06 ± 0,14%), CD14
+ monocytter (0,09 ± 0,14%) eller CD19
+ B-celler (0,04 ± 0,07%). Blant T-celle-fratatte PBMC, ble NK-celler selektivt ekspandert mens andre celler så som B-celler og monocytter ble minimalt detekterbare. For den allogeneiske klinisk anvendelse, blir T-celle-uttømming i sluttproduktet ønskelig å unngå graft-versus-host sykdom [10].
I tidligere undersøkelser ble forskjellige forsøk forsøkt å stimulere NK-celleformering med bestrålte feeder-celler slik som PBMC, EBV-LCLer eller konstruerte leukemiske cellelinjer [19] – [21]. Den foreliggende fremgangsmåte omfatter bestrålte autologe PBMC som følger med OKT3 ved begynnelsen av ekspansjonen. OKT3-stimulerte T-celler hos bestrålte feeder-celler kan stimulere NK-celler proliferasjon gjennom både humorale faktorer og direkte celle-til-celle-kontakt. Videre studier er under etterforskning for å avklare den funksjonelle rollen som feeder-celler.
I denne studien, utvidet NK-celler viste robust cytokin produksjon og potent cytolytisk aktivitet mot ulike kreftcellelinjer i forhold til nylig isolerte NK-celler. Disse cellene overuttrykker NKG2C, NKp30, NKp44, og aktivisering markører inkludert CD25, CD62L og CD69. Av notatet, utvidet NK-celler selektivt drept kreftceller uten cytotoksisitet mot allogene ikke-tumorceller i coculture analyser. Dette rettet cytotoksiske aktiviteten utvidet NK-celler antydet at allogen bruk av utvidet NK-celler til kreftpasienter ville være trygg. Faktisk har ingen vesentlige bivirkninger blitt bemerket i en pågående fase I-studie ved hjelp av utvidet allogene NK-celler (www.clinicaltrial.gov; NCT 01212341).
For å overvåke kinetikken
in vivo
distribusjon, vi administreres CFSE-merket, utvidet menneskelige NK-celler til SCID-mus. Merkede NK-celler først dukket opp i lungene, der de bodde i 48 timer, deretter gradvis forsvant (Fig. 5A). I milten, perifert blod og lever, hyppigheten av de administrerte NK celler nådde sin topp på 48 timer, og deretter sank gradvis (fig. 5A). I mellomtiden har vi også studert uttrykk for kjemokinreseptorer som CXCR3 og CXCR4 på utvidet NK-celler.
