Abstract
Bakgrunn og formål
De største hindringene for behandling av kreft i bukspyttkjertelen er svært invasiv kapasitet og motstand mot kjemo- og stråleterapi. Glykogensyntasekinase 3β (GSK3p) regulerer flere cellulære stier og er innblandet i ulike sykdommer, inkludert kreft. Her undersøker vi en patologisk rolle for GSK3p i invasiv og behandlingsresistente fenotype for kreft i bukspyttkjertelen.
Metoder
kreft i bukspyttkjertelen celler ble undersøkt for GSK3p uttrykk, fosforylering og aktivitet ved hjelp av Western blotting og
in vitro
kinase analysen. Effektene av GSK3P inhibering på kreftcelleoverlevelse, proliferasjon, invasive egenskaper og mottakelighet for gemcitabin og strålingen ble undersøkt etter behandling med en farmakologisk inhibitor eller ved RNA-interferens. Effekter av GSK3p hemming på kreftcelletransplantater ble også undersøkt.
Resultater
kreft i bukspyttkjertelen celler viste høyere uttrykk og aktivitet av GSK3p enn ikke-neoplastiske celler, som ble assosiert med endringer i sin differensial fosforylering . Inhibering av GSK3P betydelig redusert proliferasjon og overlevelse av kreftceller, sensibilisert dem til gemcitabin og ioniserende stråling, og svekket deres migrering og invasjon. Disse effektene var forbundet med reduksjoner i cyclin D1 uttrykk og Rb fosforylering. Hemming av GSK3p også endret subcellulære lokalisering av Rac1 og F-aktin og mobilmikroarkitektur, inkludert lamellipodia. Sammenfallende med disse endringene var den reduserte sekresjon av matriksmetalloproteinase-2 (MMP-2) og redusert fosforylering av fokal adhesjonskinase (FAK). Effektene av GSK3p hemming på tumorinvasjon, mottakelighet for gemcitabin, MMP-2 uttrykk og FAKfosforylering ble observert i tumorxenotransplantater.
Konklusjon
Satsingen på GSK3P representerer en effektiv strategi for å overvinne dual utfordringer invasivitet og behandling motstand i bukspyttkjertelkreft
Citation:. Kitano A, Shimasaki T, Chikano Y, Nakada M, Hirose M, Higashi T, et al. (2013) Aberrant glykogensyntasekinase 3β er involvert i kreft i bukspyttkjertelen Cell Invasion og Motstand mot Therapy. PLoS ONE 8 (2): e55289. doi: 10,1371 /journal.pone.0055289
Redaktør: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 22 august 2012; Godkjent: 20 desember 2012; Publisert: 8. februar 2013
Copyright: © 2013 Kitano et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Grants-i-Aid for Scientific Research fra det japanske departementet for utdanning, vitenskap, sport, teknologi og kultur; Japan Society for Promotion of Science (til KK, TM); Japan Society for Technology (til KK, TM); den Extramural Collaborative Research Grant Kanazawa Universitetet Cancer Research Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er et stort helseproblem på grunn av en samlet 5-års overlevelse på mindre enn 10% [1]. Den er karakterisert ved høyt proliferative og invasiv kapasitet av tumorcellene og en sterk predisposisjon for metastase [2] – [4]. Den aggressive natur kreft i bukspyttkjertelen vanskeliggjør tidlig diagnose og kurativ kirurgisk inngrep og gjør den motstandsdyktig mot cellegift og stråling [3], [4]. Den brukte terapi er infusjon gemcitabin, selv om mindre enn 20% av pasienter responderer på denne behandlingen [3], [4]. Nye terapeutiske strategier som forbedrer effekten av gemcitabin og dempe invasive egenskapene til kreft i bukspyttkjertelen celler er nødvendig. Molekylære mål-rettet terapi har dukket opp, og omfatter målretting av vekstfaktorreseptorer, angiogen faktor /reseptor og matriksmetalloproteinaser, siden disse blir avvikende uttrykt i bukspyttkjertelkreft [2] – [4]. Flere kliniske studier med kreft i bukspyttkjertelen har allerede rettet disse vekstfaktorer, enten som monoterapi eller i kombinasjon med gemcitabin, men de fleste har vist seg lite eller ingen terapeutisk nytte [5]. Identifisering av nye molekylære mål som kan forsterke den terapeutiske effekten av gemcitabin og stråling er derfor en høyt prioritert [6].
Glykogen syntasekinase 3β (GSK3p) er en serin /treonin protein kinase som regulerer flere signalveier [ ,,,0],7]. Basert på sin kjente funksjoner og engasjement i primær patologi har GSK3p vært innblandet som et terapeutisk mål for glukoseintoleranse, nevrodegenerative lidelser og inflammasjon [8]. Vi har tidligere vist at deregulert uttrykk, aktivitet og fosforylering av GSK3p er distinkte trekk ved gastrointestinal kreft og glioblastom og at GSK3p opprett overlevelse og spredning av disse tumorceller. En rolle for avvikende GSK3P i disse tumortyper er støttet av den observasjon at farmakologisk inhibering av sin aktivitet reduserer overlevelse og proliferasjon av kreftceller og predisponerer dem for å apoptose
in vitro
og i tumorxenografter [9] – [ ,,,0],12]. Selv om sin rolle i kreft er fortsatt debattert [13], de samlede resultatene så langt tyder på at avvikende uttrykk og aktivitet av GSK3p er en vanlig og grunnleggende trekk i et bredt spekter av kreftformer (anmeldt i [14]).
Basert på tidligere studier som viste involvering av GSK3p i NF-kB-mediert celle overlevelse [15], ble GSK3p funnet å støtte overlevelse av kreft i bukspyttkjertelen celler via denne veien [16], [17]. Selv om GSK3P er en viktig regulator av cellepolarisering og migrering under fysiologiske prosesser så som vev utvikling og sårheling [18], er meget lite kjent om dets rolle i migrering og invasjon av kreftceller. Her undersøkte vi potensialet involvering av GSK3p i invasiv kreft i bukspyttkjertelen og sin motstand mot gemcitabin og ioniserende stråling, de to store hindringer til mer effektiv behandling.
Materialer og metoder
Etikk Statement
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter med kreft i bukspyttkjertelen før operasjonen. Denne studien ble godkjent av Medical Ethics Committee of Kanazawa University.
Dyreforsøk ble gjennomført i henhold til retningslinjene for omsorg og bruk av forsøksdyr i Kanazawa Medical University, og i samsvar med nasjonale retningslinjer for bruk av dyr i forskning i Japan (https://www.lifescience.mext.go.jp/policies/pdf/an_material011.pdf). Protokollen ble godkjent av komiteen for Animal Experiments av Kanazawa Medical University.
Cellelinjer og vevsprøver
Menneske embryonale nyreceller (HEK-293) og kreft i bukspyttkjertelen celler (Panc-1, MIA PACA-2, BxPC-3, CAPAN-1) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Disse cellelinjene ble preget av DNA profilering i ATCC og passert for mindre enn seks måneder etter gjenoppliving. De ble holdt ved 37 ° C med 5% CO
2 i DMEM (HEK-293, PANC-1, MIA PACA-2, CAPAN-1) og RPMI 1640 (BxPC-3) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika (penicillin G og streptomycin) (GIBCO). Cellene ble høstet i løpet av den eksponentielle vekstfasen for utvinning av RNA og protein.
Denne studien inkluderte 15 pasienter med kreft i bukspyttkjertelen som gjennomgikk kirurgi ved Institutt for kirurgisk onkologi, Kanazawa universitetssykehus (tabell S1). Den kirurgiske prøvene ble fiksert i nøytral-bufret 10% formalin, innstøpt i parafin og behandlet for histopatologisk diagnose og immunhistokjemiske undersøkelser.
Western blotting
Protein ble hentet fra dyrkede celler ved hjelp lysis buffer (CelLytic -MT, Sigma-Aldrich) inneholdende en blanding av protease-inhibitorer og fosfatase (Sigma-Aldrich). Konsentrasjoner av proteinekstrakter ble målt ved hjelp av Coomassie Protein Assay Reagents (Pierce). En 30 ug prøve av protein ble separert i natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og analysert ved Western blotting for proteinene av interesse, og deres fosforylering [9], [11], [12] med de respektive primære antistoffer (tabell S2). Elektro-membraner (Amersham) ble blokkert med 5% bovint serumalbumin før deteksjon av fosforylerte proteinfraksjoner. Mengden av protein i hver prøve ble målt ved ekspresjonen av β-aktin. Signaler ble utviklet ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL).
In vitro
kinase analyse for GSK3p aktivitet
En nonradioisotopic
in vitro
kinase assay (NRIKA) [19] ble brukt til å påvise aktivitet av GSK3P avledet fra cellene. Den NRIKA benytter en sekvensiell kombinasjon av immunoutfellinger å isolere GSK3P i cellulære proteinprøver, en
in vitro kinase
reaksjon som bruker rekombinant human β-catenin protein (substrat) og ikke-radioisotopisk adenosin trifosfat (ATP), etterfulgt av immunoblotting for å påvise β-catenin fosforylert ved serin (S) 33, S37 og /eller treonin (T) 41 rester (p-β-catenin
S33 /37 /T41) [19]. Som en negativ kontroll ble mus monoklonalt antistoff mot GSK3p erstattet med en lik mengde av ikke-immun mus-IgG (Sigma-Aldrich) i det immunpresipitering trinn. GSK3p-aktivitet blir demonstrert ved nærvær av p-β-catenin
S33 /37 /T41 i testreaksjon, og ved dets fravær i den negative kontrollreaksjonen. Mengden av immunopresipitert GSK3P og tilstedeværelsen av rekombinant β-catenin protein i kinasereaksjonen ble overvåket ved immunblotting
Immunhistokjemi
Ekspresjon og /eller fosforylering av GSK3P, matriks-metalloproteinase (MMP). – 2 og fokal adhesjonskinase (FAK) i tumor og tilstøtende ikke-neoplastiske vev av kreft i bukspyttkjertelen pasienter ble undersøkt ved hjelp av avidin-biotin-peroksidasekompleks metoden [11], [12]. Etter deparaffinization, mikrobølgeovn antigen avsløring og blokkering av ikke-spesifikke immunreaksjoner, ble parafinsnitt inkubert med antistoff til GSK3P, tyrosin (Y) 216-fosforylert GSK3p (p-GSK3P
Y216), MMP-2, FAK, Y397-fosforylert eller Y861-fosforylert FAK (p-FAK
Y397, p-FAK
Y861) og p-β-catenin
S33 /37 /T41, hhv. Kilder og arbeids fortynninger av disse antistoffene ble vist i Tabell S2. Seksjonene ble deretter inkubert med biotinylert geite-anti-kanin-IgG eller heste anti-muse IgG (fortynnet 1:200; Vector). Immunoreaktivitets ble oppdaget ved hjelp av ABComplex /HRP kit (DakoCytomation). For negativ kontroll ble primære antistoffer erstattet med ikke-immun kanin eller mus IgG (DakoCytomation). Overekspresjon eller høyere fosforylering av de respektive molekyler i tumorer ble definert som sterkere ekspresjon eller fosforyleringen av enten protein i tumorceller sammenlignet med ikke-neoplastiske bukspyttkjertelen kanaler i den samme pasient.
Effekter av GSK3P inhibering av celleoverlevelse og sprednings
celler utsådd i 96-brønners plater ble behandlet med dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma-Aldrich) eller en GSK3p-inhibitor (AR-A014418; Calbiochem) oppløst i DMSO ved de angitte sluttkonsentrasjoner i mediet. Spesielt, tillater AR-A014418 ikke hemmer aktiviteten av 26 nært beslektede kinaser, og er vurdert som svært spesifikk for GSK3P [20]. På bestemte tidspunkter, ble de relative antallet av levende og formerende celler som bestemt ved hjelp av WST-8 (4- [3- (4-jodfenyl) -2- (4-nitrofenyl) -2H-5-tetrazolio] -1,3 benzen disulfonat) assay kit (Cell telling kit-8;. Wako) og Cell Proliferation ELISA BrdU Kit (Roche), henholdsvis
Liten interfering RNA (siRNA) spesifikk for humant GSK3p (GSK3p Validert Stealth RNAi) og negativ kontroll siRNA (Stealth RNAi negativ kontroll lav GC duplex) ble kjøpt fra Invitrogen. Den GSK3p-spesifikke siRNA rettet sekvensen 5′-GCUCCAGAUCAUGAGAAAGCUAGAU-3 «. Cellene ble transfektert med 10 nM av enten siRNA bruker Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Effekten av RNA-interferens på GSK3p-ekspresjon ble bestemt ved Western blotting ved anvendelse av et antistoff mot både GSK3α og β (tabell S2). Spesifisiteten til GSK3P-spesifikk siRNA ble bekreftet i våre tidligere studier [11], [12]. For å undersøke effekten av GSK3P RNA-interferens på celle overlevelse og proliferasjon, ble celler sådd på 96-brønners plater ble transfektert med 10 nM av kontroll eller GSK3P-spesifikk siRNA. Ved 72 timer etter transfeksjon, ble de relative antallet av levende og formerende celler som bestemt ved fremgangsmåtene beskrevet ovenfor.
Effekter av GSK3P inhibering på Mottagelighet av kreftceller til å Gemcitabin og for ioniserende stråling
kreftceller sådd på 96-brønners plater (3-6 x 10
4 celler per brønn) ble behandlet med økende konsentrasjoner av enten gemcitabin (Eli Lily) eller AR-A014418. Etter behandling i 72 timer, ble det relative antallet levedyktige celler målt ved hjelp av WST-8-analyse for å bestemme IC
50 (50% celleoverlevelse hemmende konsentrasjon) for gemcitabin og AR-A014418 og for å generere isobologrammer. Cellene ble deretter behandlet med en dose av gemcitabin i nærheten av IC
50 i nærvær av DMSO, eller en lav dose (5 eller 10 uM) av AR-A014418. Den isobologram metoden [21] ble anvendt for å bestemme hvorvidt virkningen av GSK3P inhibitor på bukspyttkjertelkreft celle mottakelighet for gemcitabin var additiv, antagonistisk eller synergistisk.
Effekten av GSK3P inhibitor på bukspyttkjertelkreft celle følsomhet overfor ioniserende bestråling var undersøkt ved hjelp av koloni-dannende celle overlevelse analyse. I hver brønn av seks-brønners plater, 1.000 kreft i bukspyttkjertelen celler ble sådd og behandlet sekvensielt med enten DMSO eller en lav dose (5 eller 10 uM) av AR-A014418 i 24 timer og med ioniserende stråling i doser på 0, 4 og 8 Gy. Ved 6 dager etter bestråling, ble det totale antall kolonier farget med 0,1% krystallfiolett (Wako) skåret i hver brønn. Det midlere antall kolonier i tre separate forsøk ble beregnet med standardavvik.
Analyser med hensyn på cellemigrering og invasjon
kreftcellemigrering og invasjon ble undersøkt ved enkeltlag-baserte sårhelende analyse og transwell analyse. Sammenflytende monolag av kreft i bukspyttkjertelen celler i nærvær av DMSO eller AR-A014418 i en dose på 5 eller 10 uM ble ripet med en 20 ul-mikropipette spissen for å skape en celle-fri sone (sår). I hver betingelse, ble gapet avstanden mellom sårkantene overvåket ved tre faste referansepunkter for 6 til 24 timer med et CCD-kamera (Axiocam MRM, Zeiss) som er tilkoblet en fasekontrastmikroskop (Axiovert 40 CFL, Zeiss). Cellemigrering ved hvert tidspunkt ble beregnet som den midlere avstand på sår målt ved de tre punktene og sammenlignet mellom celler behandlet med DMSO og AR-A014418.
celle migrering og invasjon ble undersøkt ved transwell analyser ved hjelp av ubelagt og matrigel-belagte 24-brønn dobbel-kammer system (BD BioCoat ™ Matrigel ™ Inkubasjon Chamber, BD Biovitenskap). Kreftceller ble suspendert i serumfritt medium inneholdende DMSO eller AR-A014418 (5 eller 10 uM), og 2 x 10
4 celler ble påført på det øvre kammer sammenkobling med det nedre kammer er fylt med medium inneholdende 10% FBS ( som en chemo-tiltrekkende) og DMSO eller AR-A014418 (5 eller 10 mm). 22 timer etter at cellene til å migrere og invadere, celler på den nedre side av kammeret ble fiksert og farget med Diff-Quick Kit (Symex). I hver analyse ble det totale antall celler pr høyeffekts mikroskopisk felt på undersiden av den ikke-belagte eller matrigel-belagte kammeret telles og avsluttet for å migrere eller invaderende celler. Gjennomsnittlig antall celler i fem høyeffekts mikroskopiske felt ble beregnet med standardavvik.
Cell morfologi og immunfluorescens cytochemistry
Kreftceller dyrket på et dekkglass ble behandlet med enten DMSO eller AR- A014418 (5 eller 10 mM) i 12 timer, og deretter risset som beskrevet ovenfor. Ved 12 timer etter skraping ble cellene langs sårkantene observert ved fasekontrastmikroskopi. Disse cellene ble deretter fiksert med 4% paraformaldehyd og permeabilisert med 0,1% Triton-X (Sigma-Aldrich). Cellene ble inkubert i serie med muse-monoklonalt antistoff til Rac1 (BD Bioscience; fortynnet 1:200) ved 4 ° C over natten og med Alexa Flour® 488-merket anti-mus IgG (Invitrogen, fortynnet 1:1,000) ved romtemperatur i 40 min i mørket. Etter vasking av overskudd av antistoff, ble cellene farget for filamentøse (F-) aktin med Alexa Flour® 546-merket phalloidin (Invitrogen, fortynnet 1:40) i 20 min. Deretter ble cellekjerner kontra med Hoechst 33342 (molekylære prober) og observert av fluorescens mikroskopi (Keyence) for uttrykk og subcellulære lokalisering av Rac1 og F-aktin.
Rac1 aktivitet
Protein ble ekstrahert fra celler behandlet med DMSO eller 10 uM AR-A014418 i 24 timer i 25 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5) inneholdende 150 mM NaCl, 5 mM MgCl
2, 1% NP-40, 1 mM ditiotreitol og 5% glycerol. Aktiv Rac1 ble isolert fra proteinprøven ved rullegardinmetode med GST-menneske Pak1-PBD (Thermo) og harpiks (glutation Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare). Fraksjonen av Rac1 bundet til guanosin trifosfat (GTP) (Rac1-GTP, en aktiv form) ble eluert fra harpiksene og påvist ved Western blot-analyse ved å bruke kanin-polyklonalt antistoff til Rac1 (fortynnet 1:1,000, Thermo). Separat ble hele cellulærprotein analysert for total Rac1 bruker samme antistoff.
Expression og sekresjon av matriksmetalloproteinase-2 (MMP-2)
Uttrykk av MMP-2 mRNA ble undersøkt av kvantitative revers transkripsjon-PCR (QRT-PCR). Total RNA ble isolert fra celler ved anvendelse av ISOGEN (Wako). Komplementær DNA (cDNA) ble generert ved hjelp av en Reverse Transcription Kit (Promega). QRT-PCR ble utført ved anvendelse av SYBR Premiks Ex Taq
TMII (Takara Bio) med de respektive sett av sense og antisense-primere for amplifisering av MMP-2 og β-aktin (tabell S2) [11].
MMP-2-ekspresjon ble analysert ved zymografi gelatin [22]. Kreftceller ble sådd på 12-brønners plater i 48 timer og deretter behandlet med DMSO eller AR-A01418 (10 eller 25 uM) i 24 timer i serumfritt medium. Kondisjonert medium eller behandlede celler ble inkubert med SDS prøvebuffer i 30 minutter ved 37 ° C. Prøvene ble separert på 10% SDS-PAGE inneholder 0,005% Alexa Fluor 680-merket gelatin. Etter elektroforese, ble gelene vasket i 2,5% Triton X-100 i 2 timer og deretter inkubert i substrat buffer over natten ved 37 ° C. Gelen ble skannet av LI-COR Odyssey IR bildesystem (Lincoln).
Tumor Xenotransplantat Study
Vi utarbeidet subkutane PANC-1 xenograft i mus som beskrevet [23]. Disse musene ble plassert i 4 grupper og behandlet med intraperitoneal injeksjon (to ganger per uke i 10 uker) i DMSO (fortynningsmiddel), gemcitabin (20 mg /kg kroppsvekt) og AR-A014418 (2 mg /kg kroppsvekt, tilsvarende 10 uM i kulturmedium som bestemt og optimalisert i våre tidligere studier [10], [12]) alene eller i kombinasjon, henholdsvis. Alle mus ble avsluttet etter behandling, og de xenograft tumorer ble fjernet og bearbeidet for histologisk undersøkelse og immunhistokjemi for ekspresjon av MMP-2 og FAK og fosforylering av FAK i tumorceller, slik som beskrevet ovenfor.
Statistical Analysis
Mellom-gruppen statistisk signifikans ble bestemt ved bruk av Student
t
test. I tumor xenograft studie ble tumorvolumet i hver behandlingsgruppe uttrykt som middelverdier ± standardavvik (SD). Den statistiske signifikans av forskjeller mellom data ble bestemt med Kruskal Wallis H-test fulgt av Mann-Whitney U-test med Bonferroni korreksjon. En
P
verdien av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Expression, Fosforylering og aktivitet av GSK3p i kreftceller
kreft i bukspyttkjertelen celler. viste høyere basalnivåer av GSK3P og Y216-fosforylerte aktiv form (p-GSK3P
Y216) og lavere nivåer av S9-fosforylert inaktiv form (p-GSK3P
S9) sammenlignet med HEK-293-celler (Fig. 1A ). Kreftcelle-avledet GSK3P var aktiv for fosforylering av dets substrat, β-catenin (Fig. 1B). Disse resultatene indikerer at kreft i bukspyttkjertelen celler uttrykker aktive GSK3p som ikke er regulert av differensial fosforylering på S9 og Y216. Immunhistokjemi for seriesnitt viste at GSK3p og p-GSK3P
Y216 ble diffust uttrykt og colocalized i tumorcellene og overuttrykkes i invasiv tumorceller 8/15 (53%) bukspyttkjertelcancerpasienter (Fig. 1C). Overekspresjon var hyppigere hos pasienter med T3 /T4 primærtumor eller med lymfeknutemetastaser og fjernt ved tidspunktet for kirurgi (tabell S1).
(A) Protein ekstrakt fra hver cellelinje ble analysert ved Western-immunblotting for uttrykket av GSK3p og dens fosforylering (p-GSK3p
S9, p-GSK3p
Y216). p-aktin-ekspresjon ble overvåket som en lasting kontroll. (B) GSK3p-aktivitet ble påvist ved NRIKA [19] i de respektive celler. Som beskrevet i materialer og metoder, er GSK3p-aktivitet demonstrert ved nærvær av p-β-catenin
S33 /37 /T41 i test reaksjonen (T) og ved dets fravær i den negative kontrollreaksjonen (NC). Mengden av immunopresipitert GSK3P og tilstedeværelsen av substratet (β-catenin) i kinasereaksjonen ble overvåket ved immunblotting. (C, D) Serieparafinsnitt av en primær kreft i bukspyttkjertelen og dens tilstøtende ikke-neoplastisk vev (pasient nr 5 i tabell S1) ble immunfarget for GSK3p og p-GSK3P
Y216 (C), og for MMP-2- , FAK, p-FAK
Y397 og p-FAK
Y861 (D). Målestokken i hvert panel viser 100 mikrometer i lengde.
Effekter av GSK3p Inhibitor på Cell Overlevelse og spredning
Vi har undersøkt om GSK3p bidrar til kreft celle overlevelse og spredning. Nivåene av glykogen syntase (GS) fosforylert ved Y641 (p-GS
S641) og p-β-catenin
S33 /37 /T41 redusert i kreftceller etter behandling med AR-A014418 (fig. S1A, B ), som indikerer dets aktivitet mot GSK3p i kreftceller. GSK3P inhibering dempet overlevelse og proliferasjon av kreftceller (Fig. 2A, C). Uttømming av GSK3P av RNA-interferens dempet celleviabilitet og proliferasjon i alle kreftcellelinjer (Fig. 2B, D). Disse resultatene er i samsvar med tidligere studier [16], [17] noe som tyder på at avvikende GSK3p virkninger på overlevelse og spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A) Relative antall levedyktige celler ved de angitte tidspunkter var målt ved hjelp av WST-8-analysen for de respektive celler i nærvær av DMSO eller AR-A014418 ved de angitte konsentrasjoner. (B) Relative antallet av levende celler ble målt for de respektive celler etter transfeksjon av ikke-spesifikk (NS) eller GSK3p-spesifikk siRNA. (C, D) Det relative antall prolifererende celler ble bestemt ved å måle mengden av BrdU-inkorporering. Prolifererende celler ble bedømt ved 48 timer etter behandling med DMSO eller AR-A014418 (10 pM, 20 pM) (C), eller etter transfeksjon med ikke-spesifikk (NS) eller GSK3p-spesifikk siRNA (D). Verdier som er angitt i (A-D) er gjennomsnitt ± SD av fem separate forsøk. *
p
0,05, statistisk signifikant forskjell mellom celler behandlet med DMSO eller AR-A014418 og mellom celler behandlet med uspesifikke og GSK3p-spesifikke siRNA
Effekter av GSK3p. hemmer Kombinert med gemcitabin eller stråling mot kreft celler
resultatene ovenfor førte oss til å ta om GSK3p hemming kan forsterke effekten av gemcitabin og ioniserende stråling. Høye doser (25 eller 50 uM) av AR-A014418 alene hadde en terapeutisk effekt mot kreftceller (Fig. 2A, C). Derfor ble virkningene av den forholdsvis lave doser (5 eller 10 uM) testet i kombinasjon med gemcitabin eller ioniserende stråling. Først undersøkte vi doseavhengige effekter av AR-A014418 og gemcitabin på kreft celle overlevelse og bestemt deres IC
50 verdier (Fig. 2A, fig. S2). IC
50 verdier for AR-A014418 var lik i PANC-en, MIA PACA-2 og BxPC-3 celler, mens de for gemcitabin variert (tabell S3). Vi neste undersøkt effekten av AR-A014418 på mottakelighet av kreftceller til gemcitabin. Når cellene ble behandlet med økende doser (1 ng /ml til 10 ug /ml) av gemcitabin, kombinert med en lav dose AR-A014418 betydelig redusert IC
50 av gemcitabin (fig. S2, S4 tabell). Isobologram analyse [21] av dataene viste at lavdose AR-A014418 i kombinasjon med gemcitabin var additiv mot PANC-1-celler og synergistisk mot MIA PACA-2-celler (fig. 3A). Vi har bekreftet at den kombinerte behandling med AR-A014418 betydelig forbedret effekt av gemcitabin mot cancercelletransplantater (fig. 3C) i gnagere uten skadelige virkninger av reagenset.
(A) Virkningen av AR-A014418 på effekten av gemcitabin ble analysert ved anvendelse av isobologram [21] ved å plotte IC
50 av kombinasjonsterapi (fig. S2, S4 tabell). (B) Den kombinerte effekten av ioniserende stråling og AR-A014418 ble testet i PANC-1 og MIA PACA-2-celler ved kolonidannelsesbestemmelsen. *
p
0,05, statistisk signifikant forskjell mellom celler behandlet med DMSO eller AR-A014418. (C) Den kombinerte effekten av gemcitabin og AR-A014418 ble testet i PANC-1-xenografter. Atymiske mus med PANC-1 xenograft ble plassert i fire grupper for behandling med intraperitoneal injeksjon (to ganger i uken) i DMSO (kontroll; 8 mus), gemcitabin (GEM; 20 mg /kg kroppsvekt; ni mus) og AR-A014418 ( AR, 2 mg /kg kroppsvekt; 8 mus), alene eller i kombinasjon (GEM + AR; ni mus). På den tiden etter behandling i 10 uker, tumorvolum (cm
3) ble beregnet ved bruk av formelen 0,5 x S
2 x L, hvor S er den minste tumor diameter (cm) og L er den største (cm ) [10], [12]. Den midlere tumorvolum ble sammenlignet mellom de 4 grupper. *
p
0,05, statistisk signifikant forskjell mellom data
Effekten av AR-A014418 kombinert med ioniserende stråling ble testet i kreftceller.. I koloni-dannende celle overlevelse analyse nærvær av 10 pM AR-A014418 betydelig redusert levedyktighet av kreftceller i forhold til behandling med ioniserende stråling alene (Fig. 3B). Sammen utgjør disse resultatene viser at kombinasjonsbehandling med GSK3p hemmer sensitizes kreftceller til gemcitabin og ioniserende stråling.
Molekylær Endringer Associated med GSK3p Hemming i kreftceller
For å forstå mekanismen som ligger til grunn involvering av GSK3P i kreftcelleformering og resistens overfor terapi, undersøkte vi effekten av GSK3P inhibering av ekspresjon og fosforylering av proteiner involvert i cellesyklusregulering og proliferasjon. I overensstemmelse med tidligere studier (oversikt i [2]), kreft i bukspyttkjertelen celler viste fosforyleringen av Rb-proteinet (p-Rb
S780, p-Rb
S807 /811 Fig. 4), noe som tyder på at binding til E2F transkripsjonsfaktor ble svekket [24]. Behandling med enten AR-A014418 eller GSK3p-spesifikk siRNA reduserte nivåer av Rb-fosforylering og cyklin D1 ekspresjon (Fig. 4), men ingen konsistente endringer ble funnet for CDK4 og CDK6 uttrykk.
(A) Immunoblotting analyse sammen ekspresjonen av Rb, CDK4, CDK6 og cyklin D1, og fosforyleringen av Rb ved S780 og S807 /811 rester (p-Rb
S780, p-Rb
S807 /811) mellom celler behandlet med DMSO ( DM) eller 10 mm AR-A014418 (AR) i 24 timer. (B) Endringer i nivåene av p-Rb
S780 og p-Rb
S807 /811 og uttrykk for Rb og cyclin D1 ble undersøkt i MIA Paca-2 celler på angitte tidspunkter etter behandling med 10 mm AR -A014418. (C) Uttrykk for Rb, cyclin D1, GSK3α og GSK3p proteiner og nivåer av Rb fosforylering (p-Rb
S780) ble undersøkt og sammenlignet mellom de samme kreft i bukspyttkjertelen celler transfektert med uspesifikk siRNA (NS) eller GSK3β- spesifikk siRNA (S) (10 nM hver). (A-C) β-aktin uttrykk ble overvåket som en lasting kontroll.
Effekter av GSK3p Hemming på Cancer Cell migrasjon og invasjon
sårhelende analysen viste at migrasjon av kreftceller ble signifikant redusert ved behandling med 5 uM og 10 uM AR-A014418 (fig. 5A, fig. S3). Viktigere, disse konsentrasjonene var tilstrekkelig til å hemme celledeling 24 timer etter behandling (Fig. 2A). I transwell analysen, 5 mikrometer og 10 mikrometer AR-A014418 hemmet kjemotaktisk migrering av kreftceller og deres invasjon av ekstracellulære matrise komponent (Fig. 5B).
(A) øvre panelene viser tidsforløpet for PANC- en cellemigrering i et sårhelende assay i nærvær av DMSO eller AR-A014418 (AR). Det nedre panel viser de relative bredder av sår målt som en prosent av det opprinnelige gap ved tiden null. *
p
0,05, statistisk signifikant forskjell mellom celler behandlet med DMSO eller AR-A014418. (B) Migrere cellene gjennom ubestrøket transwell og invaderende cellene gjennom matrigel belagt transwell ble scoret for PANC-en og MIA PACA-2 celler behandlet med DMSO eller AR-A014418 (AR) i 22 timer. Representative photomicroscopic funn i hver analyse er vist nedenfor kolonnene. *
p
. 0,05, statistisk signifikant forskjell mellom celler behandlet med DMSO eller AR-A014418
Endringer i Invasive Phenotype av kreftceller Følger GSK3p Hemming
De ovenstående resultater førte oss til hypoteser om at GSK3P har en rolle i kreftcelle migrering og invasjon. Dette kan tilskrives til epitel-mesenchymale overgang (EMT), en fenotype som er ansvarlig for kreftcelleinvasjon og metastase [25]. Vi undersøkte ekspresjon av EMT-relaterte molekyler E-cadherin, N-cadherin og vimentin i kreftceller etter behandling med AR-A04418 og GSK3p-spesifikke siRNA. Det ble ikke observert konsistente endringer i nivåene av uttrykket av disse molekylene (fig. S1C, D), noe som tyder på at EMT er usannsynlig å være den mekanismen som GSK3p hemming demper kreft celle migrasjon og invasjon. En mulig forklaring kan være at etablerte kreftcellelinjer har allerede anskaffet EMT fenotype.
neste fokusert på mobilnettet mikroarkitektur og spesielt på lamellipodia som spiller en viktig rolle i celle migrasjon under fysiologiske prosesser og i kreft celle migrasjon og invasjonen [26]. Et medlem av Rho-GTPase familie, Rac1, deltar i lamellipodia formasjon og i kreft progresjon [27]. Sårheling analysen viste at trekkende kreftcellene danner lamellipodia på stedet av Rac1 lokalisering, med aktin filamenter organisere lamellen struktur. Behandling med AR-A014418 redusert lamellipodia dannelse i kreftceller ved viklet kant og resulterte i diffust cytoplasmisk fordeling av Rac1 og F-aktin (Fig. 6A).
