Abstract
Lokalbedøvelse brukes ofte i finnålsaspirasjon av skjoldbrusk lesjoner og lokoregionalt kontroll av vedvarende eller tilbakevendende skjoldbruskkjertelkreft. Nylige bevis antyder at lokalanestetika har et bredt spekter av effekter, inkludert inhibering av celleproliferasjon og induksjon av apoptose i nevronale og andre typer celler. I denne studien demonstrerte vi at behandling med lidokain og bupivakain resulterte i redusert cellelevedyktighet og kolonidannelse av både 8505C og K1-celler på en doseavhengig måte. Lidokain og bupivakain indusert apoptose og nekrose i høye konsentrasjoner, som bestemt ved flow-cytometri. Lidokain og bupivakain forårsaket avbrudd av mitokondriemembranen potensial og frigjøring av cytokrom c, ledsaget av aktivering av caspase 3 og 7, PARP cleavage, og induksjon av en høyere andel av Bax /BCL-2. Basert på microarray og sti analyse, er apoptose fremtredende transkripsjonen endring felles for lidokain og bupivakain behandling. Videre er lidokain og bupivakain dempes ekstracellulære signalregulerte kinase 1/2 (ERK1 /2) aktivitet og indusert aktivering av p38 mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) og c-Jun N-terminal kinase. Farmakologiske hemmere av MAPK /ERK kinase og p38 MAPK trykt caspase 3-aktivering og PARP cleavage. Til sammen våre resultater for første gang demonstrere den cytotoksiske effekten av lokalanestetika på skjoldbrusk kreft celler og implisere MAPK trasé som en viktig mekanisme. Våre funn har potensial klinisk relevans i at bruk av lokalanestetika kan gi tidligere ikke fordeler i behandling av pasienter med skjoldbrusk kreft
Citation. Chang YC, Hsu YC, Liu CL, Huang SY, Hu MC, Cheng SP (2014) lokalanestetika indusere apoptose i human Thyroid kreftceller gjennom Mitogen-Aktivert Protein Kinase Pathway. PLoS ONE 9 (2): e89563. doi: 10,1371 /journal.pone.0089563
Redaktør: Yong Jiang, Southern Medical University, Kina
mottatt: 25 september 2013; Godkjent: 22 januar 2014; Publisert: 21 februar 2014
Copyright: © 2014 Chang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Science Council of Taiwan (NSC 100-2314-B-195-001-My3), og fra Mackay Memorial Hospital (MMH-10206 og MMH-E-101-10). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
thyroid kreft er den vanligste av alle endokrine kreftformer, og forekomsten av skjoldbrusk kreft er økende over hele verden [1], [2]. Flertallet av skjoldbrusk kreft er godt differensiert med papillær og follikulær skjoldbruskkjertelen carcinoma er de vanligste typene. Selv godt differensiert skjoldbruskkjertelkreft har en generelt gunstig prognose, kan de samlede tilbakefall være så høyt som 35% [3]. Vedvarende eller tilbakevendende sykdom skjer hovedsaklig i nakken. Videre er utviklingen av tilbakefall forbundet med en høyere dødelighet. Tretti års kreft dødelighet ble rapportert å være om lag 12% av pasienter med lokalt tilbakefall og 43% hos de med fjernmetastaser [3].
behandling for vedvarende eller tilbakevendende sykdom inkluderer ytterligere kirurgi og radioaktivt jod terapi. Compartment hals disseksjon for lokoregionalt tilbakefall er anbefalt av American Thyroid Association retningslinjer [4]. Et annet alternativ behandling med lovende resultater er ultralydveiledet perkutan etanol injeksjon og radiofrekvensablasjon [5] – [7]. Under prosedyren, lidokain infiltrasjon til stikkestedet, og vevet rundt residiv av tumor er en enkel og effektiv metode for smerte kontroll [8]. Ingen bivirkninger ble rapportert med unntak av at ultralyd bildekvaliteten kan bli kompromittert med en stor mengde av lidokain [7].
I tillegg til den godt etablerte virkningen av analgesi og antiarrhythmia, har studier vist at lokalanestetika har en bredt spekter av effekter som anti-inflammatoriske og antimikrobielle egenskaper [9]. Nye observasjoner av deres chondrotoxicity oppfordring til forsiktighet i klinisk bruk av intraartikulære injeksjoner [10]. Videre er økende bevis for at lokalbedøvelsesmidler kan utøve fordelaktige virkninger ved behandling av kreft ved inhibering av cellevekst, invasjon, migrering og [11] – [13]. Disse effektene synes ikke relatert til deres modulering av natriumkanaler [14]. I denne forbindelse har vi vist at apoptose spiller en viktig rolle i den lokalbedøvelses-indusert celle-toksisitet av brystkreftceller [15]. Tidligere studier antyder at neuronal apoptose indusert av lokale bedøvelsesmidler er mediert, i det minste delvis, av mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) veien [16], [17]. Men lite er kjent om liknende mekanismer gjelder lokalbedøvelse-indusert cytotoksisitet i kreftceller.
Gitt at lokalanestetika er ofte brukt i finnålsaspirasjon av skjoldbrusk lesjoner og lokoregionalt kontroll av vedvarende eller tilbakevendende skjoldbruskkjertelen, det ville være interessant å finne ut om lokalanestetika ha en antiproliferativ effekt på skjoldbruskkjertelen kreftceller. Vi rapporterte her som vanligvis brukes lokalanestetika, lidokain og bupivakain, hemmet cellevekst og indusert apoptose av menneskelige skjoldbruskkjertelen kreftceller i klinisk relevante konsentrasjoner. Videre i overensstemmelse med tidligere studier og vår microarray og sti analyse, observerte vi at MAPK signalveier var involvert.
Resultater
Hemming av cellevekst og kolonidannelse av lokalanestetika
Cellenes levedyktighet av 8505C og K1 thyroid kreft celler ble bestemt ved å inkubere med lidokain og bupivakain i serielt fortynnede konsentrasjoner i 24 og 48 timer. Lidokain og bupivakain hemmet veksten av både thyroid kreft celler på en doseavhengig måte (fig. 1A). Etter 24 timer, var median effektiv dose (ED50) av lidokain var 7,3 mM til 8505C celler og 6.8 mM til K1-celler, respektivt. Disse var lavere enn den som vanligvis brukes konsentrasjon på 1% (vekt /volum) lidokain (42,67 mM). Tilsvarende ED 50 ved 24 timer av bupivakain var 3,1 mM til 8505C celler og 1.3 mM til K1-celler. Begge var mye lavere enn den kliniske konsentrasjon på 0,5% (w /v) bupivakain (17,34 mM).
(A) 8505C og K1-celler ble behandlet med serielle fortynninger av lidokain og bupivakain, enkeltvis eller i kombinasjoner, i 24 og 48 timer. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet. (B) En konservativ isobologram viser at lidokain og bupivakain virker antagonistisk til å hemme cellevekst av thyroid kreft celler. ED angir effektiv dose. ED50 (rød X), ED75 (grønne kors), og ED90 (blå sirkler) fremstilles grafisk. (C) Behandling med lidokain og bupivakain resulterte i reduksjon av kolonidannelse av de 8505C og K1-cellelinjer. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet. *, P 0,01
versus
kontroll
For å undersøke om den cytotoksiske effekten er begrenset til lokalanestetika amid-type, skjoldbrusk kreft celler ble også behandlet med en ester-type lokale. bedøvelsesmidler, prokain. ED50 var 39,6 mM og 30,9 mM, henholdsvis, noe som tyder på at virkningen korrelert med styrken, men ikke den klasse, av lokalbedøvelsesmidler. Videre, for å utelukke muligheten for at endringer i pH eller osmolalitet ville forklare den cytotoksiske effekter, pH og osmolalitet av kulturmediet for forsøkene ble bestemt. Det var ingen signifikante variasjoner i pH eller osmolalitet (fig. S1), noe som indikerer at de observerte effektene var farmakologisk natur.
Drug synergi, ble bestemt ved kombinasjonen indeks (CI) og isobologram analyser i henhold til median virkning metoder (fig. 1B). CI var 1,17 ± 0,03 for 8505C celler og 1,14 ± 0,06 for K1 celler. Disse resultatene tyder på at kombinasjonen av lidokain og bupivakain ga lett antagonisme.
Videre er virkningene av lokalanestetika på tumorcellevekst ble bestemt ved klonogene assay. Resultatene er vist i fig. 1C. En signifikant doseavhengig reduksjon i kolonier ble observert i 8505C og K1-celler. Thyroid kreftceller ikke danner kolonier etter behandling med lidokain 4 mm eller bupivakain . 0,8 mm
Induksjon av apoptose av lokal bedøvelse
For å finne grunnlag av redusert celle levedyktighet, celle syklus analyse ble utført. Det var ingen cellesyklusarrest i skjoldbruskkjertelen kreftceller behandlet med lidokain og bupivakain i 6, 24 og 48 timer (data ikke vist). Imidlertid observerte vi en doseavhengig økning i sub-G1 (hypodiploid) fraksjonen etter behandling med lidokain og bupivakain (fig. 2A). Vi har også brukt annexin V /propidiumjodid (PI) dual farging for ytterligere bekreftelse av lokal anestesi-indusert apoptose i skjoldbruskkjertelen kreftceller. Som vist på fig. 2B, behandling med lidokain og bupivakain resulterte i apoptose i en doseavhengig måte. Nekrose ble også observert i høye konsentrasjoner av lidokain og bupivakain. Tatt sammen tyder disse resultater på at veksthemming av lokalanestetika i thyroid kreft celler involverer induksjon av apoptose.
(A) 8505C og K1-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av lidokain og bupivakain i 24 timer. Deretter ble cellene vasket, fiksert og farget med propidiumjodid (PI) og ble analysert for DNA-innhold i forskjellige faser av cellesyklusen ved strømningscytometri. (B) Thyroid kreftceller ble behandlet med lidokain og bupivakain i 48 timer, og cellene ble deretter farget med fluorescein-konjugert annexin V og PI og analysert ved strømningscytometri. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet. *, P 0,05
versus
kontroll
Vurdering av mitokondriell dysfunksjon
En reduksjon i mitokondriemembranen potensialet er en av de tidligste hendelsene i apoptose.. Mitokondriell membranintegritet ble evaluert ved anvendelse av det kationiske fargestoff JC-1, er en meget spesifikk probe for å detektere endringer i mitokondrie ΔΨ
m. JC-1 danner røde aggregater i intakte mitokondriene, mens grønn fluorescens som skyldes dannelsen av JC-1 monomerene ved lav mitokondriemembranpotensialet. Som vist på fig. 3A, lidokain og bupivakain økt betydelig dannelse av JC-1-monomerer i 8505C og K1-celler på en doseavhengig måte. Prosentandelen av celler med lav ΔΨ
m var noe lavere enn andelen av apoptotiske celler behandlet med lokalanestetika ved de samme konsentrasjoner.
(A) 8505C og K1-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av lidokain og bupivakain i 16 timer. ΔΨ
m endringen ble overvåket ved å laste med JC-1 og ble analysert ved flowcytometri. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet. *, P 0,05
versus
kontroll. (B) Thyroid kreftceller ble behandlet med lidokain (6 mM) og bupivakain (2 mM) for de angitte tidsperioder. Cytokrom c utgivelse fra mitokondriene til cytosol ble bestemt ved Western blotting. Blottene ble strippet og reprobed med et antistoff mot aktin for lik belastning.
neste søkt å fastslå om cytokrom c ble løslatt fra mitokondriene til cytosol. Som forventet, ble et høyere nivå av cytokrom c målt i cytosol i begge cellelinjer etter behandling med lidokain og bupivakain (Fig. 3B). Sammen er disse data tyder på at behandling av skjoldbrusk kreft celler med lokalanestetika fører til aktivering av mitokondrielle apoptotiske sti.
Aktivering av caspases av lokalanestetika
Offentliggjøring av cytokrom c har vist seg å aktivere nedstrøms caspases som til slutt kreves for å indusere apoptose. Vi har derfor undersøkt om caspaseaktivering var involvert i induksjon av apoptose av lokalanestetika. Behandling med lidokain og bupivakain resulterte i aktiveringen av caspase 3 og kaspase 7, og spaltning av PARP i 8505C og K1-celler doseavhengig (figur 4A.). Videre caspase kolorimetrisk substrat analyse viste at kaspase 3 aktivitet øket på en tidsavhengig måte i 8505C celler etter behandling med lidokain og bupivakain (Fig. 4B). Disse resultatene indikerer klart at kaspase-aktivering spiller en viktig rolle i tyreoideacancer celle apoptose indusert av lokale bedøvelsesmidler
(A) 8505C og K1-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av lidokain (L6, 6 mM;. L12, 12 mM) og bupivakain (B2, 2 mM; B4, 4 mM) i 16 timer. Celler ble høstet og prøver ble fremstilt for Western blot-analyse. C, kontroll. PARP, poly (ADP-ribose) polymerase. (B) Aktivitet av caspase 3 i cellelysater fra 8505C celler behandlet med lidokain (12 mM) og bupivakain (4 mM) for forskjellige tidsperioder, ble bestemt ved anvendelse av en kolorimetrisk assay protease. Feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet.
proteiner av Bcl-2 familien delta i apoptotiske prosessen ved å fungere som arrangører (
f.eks
, Bax) eller hemmere (
f.eks
, BCL-2). For å aktivere den mitokondrielle apoptotiske reaksjonsvei, aktivert Bax danner en oligomer pore og resulterer i permeabiliseringen av mitokondrie ytre membran. Vi fant at behandling med lidokain og bupivakain føre til en reduksjon i BCL-2 nivåer med en samtidig økning i Bax nivåer (fig. 4A). Derfor, lokalanestetika forandre protein nivåene av visse medlemmer av Bcl-2-familien på en måte som begunstiger en økning i forholdet mellom Bax /Bcl-2, noe som kan bidra til mottakelighet av thyroid kreft celler i apoptose.
analyse av genuttrykk signaturer berørt av lokalanestetika
for å identifisere genekspresjonssignaturer som er knyttet til biologiske funksjoner av lokalanestetika, microarray og sti berikelse analyse ble utført for å sammenligne uttrykk mønstre i 8505C celler behandlet med lidokain og bupivakain. De ti veier er identifisert i reaksjonsveien anrikning analysen er oppført i tabell 1 og 2. Det er bemerkelsesverdig at den mest fremtredende transkripsjonelle endringen i skjoldbruskkjertelen kreftceller behandlet med lokalanestetika er apoptose. Andre veier er felles for lidokain og bupivakain behandling inkluderer cytoskeletal ombygging og myeloid differensiering. Videre brukte vi
i silikoaluminofosfater
verktøy fra oppfinnsomhet for å identifisere veier velig involverer molekylære mekanismen for kreft. Integrering av mikroarray data fra celler behandlet med lidokain og bupivakain, sti-analyse antydet at ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) 1/2 og p38 MAPK er betydelig opp- eller ned-reguleres i respons til behandling med lokalanestetika (fig. S2).
Modulation av mitogen-aktivert protein kinase signaliserer
Vår microarray og sti berikelse analyse indikerer at MAPK veier er trolig involvert i mekanismene medierende effekten av lokalanestetika på skjoldbruskkjertelkreft celler. For å undersøke denne mulige forhold, ble de totale cellulære proteiner ekstrahert fra 8505C og K1-celler behandlet med lidokain (12 mM) og bupivakain (4 mM) i forskjellige tidsperioder, og lysater ble immunoblottet med spesifikke antistoffer mot fosforylert og total ERK1 /2, p38 og c-Jun N-terminal kinase (JNK), respektivt. Som vist på fig. 5, ble det observert en redusert fosforylering av ERK1 /2. Lidokain og bupivakain betydelig økt fosforylering av p38 og JNK. Lidokain og bupivakain hadde ingen betydelig effekt på total p38 og JNK proteinnivå.
8505C (A) og K1 (B) celler ble behandlet med lidokain (12 mM) og bupivakain (4 mM) for forskjellige tidsperioder og aktiviteter av ERK, p38 og JNK ble undersøkt med Western blot analyse ved hjelp phospho-spesifikke antistoffer. De totale protein nivåer av ERK, p38 og JNK ble også målt.
Effekter av hemming av mitogenaktiverte proteinkinaser
Deretter vil vi gjerne vite om de modulasjoner av ERK1 /2, p38 MAPK, og JNK signalveier står for apoptose indusert av lokalanestetika. For å oppnå dette, undersøkte vi effekten av spesifikke inhibitorer for kaspase-aktivering og PARP-spaltning. PD98059 er en inhibitor av MAPK /ERK kinase (MEK), for derved å hemme fosforylering og aktivering av MAPK. SB203580 er en selektiv, reversibel, og ATP-konkurrerende inhibitor av p38 MAPK, mens SP600125 er en anthrapyrazolone JNK inhibitor som konkurrerer med ATP for å hemme fosforylering av c-juni Som vist i fig. 6A og 6B, PD98059 og SB203580, men ikke SP600125, redusert aktiveringen av caspase 3 og spaltning av PARP. Disse resultatene ble bekreftet ved kaspase 3 aktivitetsanalyse (fig. 6C). Cotreatment med PD98059 eller SB203580 trykkes caspase 3-aktivitet, mens SP600125 paradoksalt nok økt caspase 3-aktivitet etter behandling med lokalanestetika. Disse dataene er accordant med resultatene av pathway anrikning-analyse (fig. S2) som ERK1 /2 og p38 MAPK signalveier er involvert i apoptose indusert av lokale bedøvelsesmidler.
8505C (A) og (B) K1-celler ble cotreated med 30 uM PD98059 (PD), 30 uM SB203580 (SB) eller 30 pM SP600125 (SP) i tillegg til 12 mM lidokain (L) eller 4 mM bupivakain (B) i 16 timer. Celler ble høstet og prøver ble fremstilt for Western blot-analyse. C, kontroll. C3, caspase 3. PARP, poly (ADP-ribose) polymerase. (C) Aktivitet av caspase 3 i cellelysater fra 8505C celler behandlet med lidokain (12 mM) og bupivakain (4 mM), med eller uten spesifikke inhibitorer i 24 timer ble bestemt ved anvendelse av en kolorimetrisk assay protease. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet. *, P 0,01
versus
kontroll
Diskusjoner
Det har vært mer enn et århundre siden den første syntetiske lokalbedøvelse ble innført på begynnelsen av 1900-tallet.. Lokalanestetika binder reversibelt til en bestemt reseptor nettsted innenfor natriumkanaler og blokkere ion bevegelse. Det ble antatt at virkningene er reversible med gjenvinning av nervefunksjon og uten skade på nerveceller. Imidlertid har rapportert om varige nevrologiske skader generert bekymring nevrotoksisitet av lokalanestetika [18]. Samle bevis tyder på at lokalanestetika kan føre til rask neuronal død gjennom utløser apoptose og nekrose [19], [20]. Videre har en rekke studier rapporterte lokalbedøvelse giftighet på andre celletyper [21] – [23]. I denne studien, vi først viste den direkte effekten av lidokain og bupivakain hemme cellevekst og koloni dannelsen av skjoldbruskkjertelen kreftceller.
De mekanismene for celletoksisitet fra lokalanestetika er ikke fullstendig klarlagt. I U937 histiocytisk lymfom celler, lidokain indusert apoptose ved konsentrasjoner under 12 mM, og indusert nekrose ved konsentrasjoner over 15 mM [24]. Lignende observasjoner er rapportert av andre [19], [20], [25]. I denne studien både apoptose og nekrose delta i celledød indusert av lokale bedøvelsesmidler. Forbløffende nok ble en liten antagonisme identifisert med kombinasjon av lidokain og bupivakain. Det virker sannsynlig at lidokain og bupivakain indusere celledød av en lignende mekanisme. Når en celle er i stand til å dø ved apoptose, vil det gjennomgå nekrotisk celledød. Det er vel kjent at ATP-nivåer er en bestemmende faktor for manifestasjon av celledød [26], [27]. Lidokain og bupivakain ble vist å redusere ATP-nivåer og levedyktigheten av melanomceller [28]. Modusen av celledød avhenger trolig av varigheten av eksponering og konsentrasjon av lokalanestetika.
MITOKONDRIELLE energetics berørt av lokalanestetika kan forklare nedgangen i ATP nivåer. Lokalanestetika kan nå mitokondrier, og denne effekten er sterkt avhengig av lipid-oppløseligheten av lokalbedøvelses [29]. Kliniske og eksperimentelle myopati indusert av bupivakain er blitt rapportert å resultere fra mitokondriell dysfunksjon og redusert oksydativ energimetabolismen [30], [31]. Nærmere bestemt, bupivakain trykkes cellerespirasjon ved hemming av komplekser I og III, sammen med produksjon av reaktive oksygenarter [32]. Irwin
et al.
Har vist at bupivakain myotoksisitet avhengig av aktiv oksideringsmetabolisme fordi svært glycolytic extensor digitorum longus var resistente mot bupivakain-indusert toksisitet [30]. Ikke desto mindre tumorceller hovedsakelig produsere energi via glykolyse (Warburg virkning) [33]. Våre funn er i samsvar med de av noen rapporter som viser at mitokondriell dysfunksjon kan også bli utløst av lokalanestetika i ondartede kreftceller [24], [25], [34].
Mitokondrier er viktige modulatorer av apoptose , nekrose og autofagi [27]. Den iboende (mitokondrie) sti av apoptose er mediert av utgivelsen av pro- og anti-apoptotiske proteiner, inkludert cytokrom c. I våre forsøk, lokalanestetika økt pro-apoptotiske Bax uttrykk og downregulated BCL-2 uttrykk, som fører til en høyere ratio mellom pro-apoptotiske og anti-apoptotiske Bcl-2 familien proteiner. Det økte Bax /BCL-2 ratio forenkler utgivelsen av mitokondrie cytokrom c, som senere induserer aktivering av caspase kaskade som spalter PARP til inaktive fragmenter. Imidlertid lidokain og bupivakain fremmet mitokondriell skade i en utstrekning mindre enn den for apoptose indusert ved de samme konsentrasjoner av lokalbedøvelsesmidlet. Dette tyder på at en mitokondriene uavhengig prosessen kan også spille en rolle. Denne hypotesen støttes av resultatene av veien berikelse analyse (fig. S2), hvor transkripsjons endringer i døden reseptor sti komponenter var involvert.
Cellular mikromatriser er kraftige eksperimentelle verktøy for identifisering av nye narkotika mål og pharmacogenomics . Unami og kolleger først rapportert at apoptose relaterte gener ble transcriptionally regulert av bupivakain i henhold til microarray analyse [34]. Nylig Lucchinetti
et al.
Vist at flere transkripsjons programmer knyttet til celledifferensiering, tumorigenesis, og metastase ble negativt påvirket av ropivakain [35]. Forfatterne postulerer at dette betyr nye begrunnelser for perioperativ bruk av lokalanestetika hos pasienter med kreft. Våre data er i samsvar med disse resultatene og viste en sterk sammenheng mellom Lokal anestesi-indusert endringer i genuttrykk og apoptose. Videre identifiserte vi at MAPK veien er involvert i de molekylære mekanismene for apoptose indusert av lokalanestetika.
I primære nevroner kulturer, bupivakain og ropivakain ble funnet å aktivere p38 MAPK og JNK men ikke ERK1 /2 [16] . Videre farmakologisk hemming av disse kinaser demper neurotoxicity
in vitro
. Forfatterne merket seg at axonal degenerering indusert av lidokain hindres av p38 MAPK-inhibitor, men ikke av caspase inhibering [36]. Harato
et al.
Også vist at p38 MAPK-inhibitor behandling dempes den kaspase 3 aktivitet og celledød indusert av bupivakain [37]. I en annen studie er p38 MAPK-reaksjonsveien implisert i bupivakain-indusert apoptose i humane neuroblastom-SH-SY5Y-celler [17]. I tråd med funnene i nerveapoptose, fant vi at p38 MAPK aktivering spiller en avgjørende rolle i lokal bedøvelse-indusert apoptose i skjoldbruskkjertelen kreftceller. Negativ regulering av proliferasjon er et sterkt konservert og viktig funksjon av p38a i forskjellige celletyper [38]. Interessant nok har oppregulert p38a aktivitet er rapportert i papillær og follikulær skjoldbrusk kreft [39]. Oppfatningen er støttet av basal ekspresjon av fosfo-p38-proteiner i denne studien (Fig. 5). Den doble rolle for p38 MAPK i skjoldbruskkjertelkreft biologi fortsatt en nesten uutnyttet område på tross av Ras-Raf-ERK vei etter å ha blitt grundig studert i skjoldbruskkjertelen.
I denne studien, ERK1 /2 aktivitet ble undertrykt av lidokain og bupivakain. Joo
et al.
Vist at lidokain undertrykte betydelig økt ERK1 /2 svar i en rottemodell av nevropatisk smerte [40]. Flere nylig, litium ble vist seg å beskytte mot bupivakain-indusert neuronal skade gjennom å reversere undertrykkelse av ERK1 /2 signalisering [41]. Det er økende bevis for en crosstalk mellom MAPK veier. For eksempel kan p38 og JNK-reaksjonsveien aktivering i induksjon av apoptose negativt regulerer ERK-reaksjonsveien [42]. Det er også verdt å merke seg at det er en paradoksal reduksjon i caspaseaktivering følgende PD98059 behandling. Mange genetiske endringer har vært implisert i kreft i skjoldbruskkjertelen, og den avvikende aktivering av Ras-Raf-ERK-reaksjonsveien er mest hyppig [43]. Hemming av MAPK pathway arrestasjoner i skjoldbruskkjertelen kreftceller i G1 fasen [44]. Derfor er en plausibel forklaring på våre resultater som ERK1 /2 hemming økt mottakelighet av skjoldbrusk kreftceller til andre mekanismer for veksthemming som cellesyklus arrest og nekrose, som ikke innebærer caspaseaktivering.
Konklusjoner
i sammendraget, vår studie tydet de molekylære mekanismene som er ansvarlig for cytotoksisitet indusert av lokalanestetika i skjoldbruskkjertelen kreftceller, presentere involvering av MPAK signalveier og foreslå potensielle fordelene ved bruk av lokalanestetika i klinisk praksis.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
den menneskelige thyroideakarsinom cellelinjer 8505C og K1 ble kjøpt fra den tyske samlingen av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) og European Innsamling av cellekulturer (ECACC, Salisbury, Storbritannia), henholdsvis. 8505C celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i RPMI 1640-medium (Invitrogen /Gibco, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS). K1-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Gibco) blandet med Hams F12 (Gibco) og MCDB 105 (Sigma, St. Louis, MO) medium i 2:1:1 proporsjoner, supplert med 10% FBS og 2 mM L- glutamin. Både 8505C og K1 har blitt godkjent til å være unike skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer [45]. Lidokain, bupivakain, prokain, PD98059, SB203580, og SP600125 ble oppnådd fra Sigma. Osmolalitet av kulturen media for eksperimenter ble analysert av rysepunktnedsettende metode å bruke en Advanced 3320 Micro Osmometer (avanserte instrumenter, Norwood, MA).
Celleviabilitet analyse og legemiddelkombinasjonen analyse
Cell levedyktighet assay ble utført i tre eksemplarer for hvert forsøk som tidligere beskrevet [46]. I korthet, 8505C og K1-celler ble sådd på 96-brønners plater en dag før lidokain og bupivakain (hver for seg eller i kombinasjon) ble tilsatt ved de angitte konsentrasjoner. For tiazolyl blå tetrazolium-bromid (MTT) kolorimetrisk analyse, 100 ul MTT-reagens (5 mg /ml; Sigma) ble tilsatt til cellekulturen og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer. De formazankrystaller konvertert fra tetrazoliumsalter av levedyktige celler ble oppløst med syrnet isopropanol. Absorbansen ble målt med Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ved bølgelengde på 570 nm. Absorbansen av kontrollceller (inkubert uten medikamenter) ble definert som 100%.
Drug synergi, ble bestemt ved den CI og isobologram analyser i henhold til de midlere effekt metoder som er beskrevet av Chou og Talalay [47]. På grunnlag av dose-responskurvene fra MTT-analyser ble CI verdiene beregnes. Synergisme, additiv og antagonisme er definert som CI 1, CI = 1 og CI 1, henholdsvis. I isobologram grafen kombinasjon datapunkter som faller på, over og under skrå linjen representerer en additiv, antagonistisk, og synergistisk effekt, henholdsvis.
Colony formasjon analysen
For kolonidannelse analysen 400 celler /brønn ble sådd ut i seks-brønns plater, er tillatt å følge i 24 timer, og behandlet med de angitte konsentrasjoner av lidokain og bupivakain fra dag 2. etter 8 til 15 dager ble kolonier farget med 3% krystallfiolett og kolonier inneholder . 50 celler ble talt
Cell syklus analyse
effekten av lidokain og bupivakain på cellesyklusen ble analysert ved PI farging og flowcytometri [48]. Etter behandling med lidokain og bupivakain i 6, 24 og 48 timer ble cellene høstet thyroid kreft, forsiktig vasket og fiksert i 70% kald etanol ved 4 ° C over natten. De faste celler (1 x 10
6) ble inkubert med RNase A i 30 minutter ved romtemperatur, og farget med PI-løsning ved hjelp av BD Cycletest Plus DNA reagenssett (BD Biosciences, San Jose, CA) i mørket. Deretter ble cellene analysert på en FASCalibur strømningscytometer (BD Biosciences) er utstyrt med Cellquest Pro-programvare. Fordelingen av celler i G0 /G1, S og G2 /M faser av cellesyklus ble estimert ved hjelp av ModFit LT programvare (Verity Software House, Topsham, ME). Som et estimat av andelen av apoptotiske celler, ble prosentdelen av celler hypodiploid kalkulert i DNA-histogrammet.
Analyse av celle apoptose
celle apoptose ble analysert ved anvendelse av annexin V-fluoresceinisotiocyanat ( FITC) apoptose deteksjon kit (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Thyroid kreft celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av lidokain og bupivakain fra 24. til 72 timer. Både flytende og festede celler ble høstet og vasket, etterfulgt av inkubasjon med 5 ul av annexin V-FITC og 5 ul av PI i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Etter inkubering ble 400 ul av bindingsbuffer tilsatt, og strømningscytometri-analyse ble utført.
Bestemmelse av mitokondriemembranpotensialet (ΔΨ
m)
Mitokondriell membranpotensialet ble bestemt ved hjelp flowcytometri bruker ΔΨ
m-avhengige fluorescerende fargestoff JC-1 (CS0390, Sigma). JC-1 er et lipofilt, kationisk fargestoff som selektivt kan gå inn i mitokondriene, og gjennomgår en reversibel endring i fluorescensemisjon i henhold til ΔΨ
m. Friske celler med høy ΔΨ
m vil danne JC-1 aggregater og fluor rødt, mens de apoptotiske celler med lav ΔΨ
m vil inneholde monomere JC-1 og fluoresce grønt. Etter behandling med lidokain og bupivakain i den angitte tid, ble thyroid kreft celler høstet og inkubert med JC-1 i 20 minutter ved 37 ° C i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble deretter utsatt for strømningscytometri.
Western blot-analyse
Totale celleproteiner ble ekstrahert, kvantifisert, og underkastet gel-elektroforese i henhold til standardprosedyrer som vi tidligere beskrevet [49].
