Abstract
Innledning
En kombinasjon av carboplatin og paclitaxel er ofte brukt som første linje kjemoterapi for behandling av eggstokkreft. Derfor bruk av bilde biomarkører tidlig etter behandlingsstart for å bestemme behandling følsomhet ville være verdifulle for å identifisere respondere fra ikke-respondere. I denne studien beskriver vi ikke-invasiv PET avbildning av glukoseopptak og celleproliferasjon ved bruk av 2-deoksy-2 – [
18F] fluor-D-glukose (FDG) og 3′-deoksy-3 «- [
18F] fluorothymidine (FLT) for tidlig vurdering av behandlingsrespons i en pre-klinisk musemodell for menneskelig eggstokkreft behandlet med carboplatin og paclitaxel.
Metoder
i
vivo
opptak av FLT og FDG i menneskelige eggstokkreft xenograft i mus (A2780) ble bestemt før behandling med karboplatin og paklitaksel (CAP) og repeatedday 1, 4 og 8 etter behandling start. Tracer opptaket ble kvantifisert ved hjelp av små dyr PET /CT. Tracer opptak ble sammenlignet med genekspresjon av Ki67, TK1, GLUT1, Ht1 og HK2.
Resultater
Svulster i hatten gruppen var betydelig mindre enn i kontrollgruppen (p = 0,03) på dag 8. på dag fire FDG SUVmax ratio var betydelig lavere i Cap-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (105 ± 4% vs 138 ± 9%, p = 0,002) og på dag 8 av FDG SUVmax forholdet var lavere i hatten sammen lignet med kontrollgruppen (125 ± 13% vs. 167 ± 13%, p = 0,05). På dagen ett opptak av FLT SUVmax andel var 89 ± 9% i Cap-gruppen og 109 ± 6% i kontrollgruppen; imidlertid var forskjellen ikke statistisk signifikant (p = 0,08).
Konklusjoner
Våre data antyder at både FDG og FLT PET kan anvendes for vurdering av anti-tumor-effekter av en kombinasjon av carboplatin og paclitaxel i behandling av eggstokkreft. FLT gir en tidlig og forbigående signal og FDG en senere og mer langvarig respons. Dette understreker viktigheten av optimal timing mellom behandling og FLT eller FDG bilde siden behandlingsrespons kan ellers bli oversett
Citation. Munk Jensen M, Erichsen KD, Björkling F, Madsen J, Jensen PB, Sehested M, et al. (2013) Imaging av behandlingsrespons til kombinasjonen av karboplatin og paklitaksel i Human Eggstokkreft xenografttumorer i Mus Bruke FDG og FLT PET. PLoS ONE 8 (12): e85126. doi: 10,1371 /journal.pone.0085126
Redaktør: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 24 juni 2013; Godkjent: 21 november 2013; Publisert: 26.12.2013
Copyright: © 2013 Munk Jensen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding kom fra National Advanced Technology Foundation, The John og Birthe Meyer Foundation, dansk Medical Research Council, Rigshospitalet Research Foundation, Svend Andersen Foundation, AP Møller Foundation, Novo Nordisk Foundation, Lundbeck Foundation og danske Kreftforeningen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser: Følgende medforfattere har interessekonflikter: Peter Buhl Jensen: eierinteresser og sysselsetting i Topotarget A /S. Maxwell Sehested: eierinteresser og sysselsetting i Topotarget A /S. Fredrik Björkling: Sysselsetting i Topotarget A /S. Kamille Dumong Erichsen: Sysselsetting i Topotarget A /S. Alle andre forfattere har ingen interessekonflikt. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Eggstokkreft er den nest vanligste gynekologisk kreft og den ledende årsaken til gynekologisk kreft relatert død hos kvinner i Europa og USA USA USA [1,2]. Kombinasjonen av carboplatin og paclitaxel er ofte brukt som førstelinje kjemoterapi for behandling av eggstokkreft [3]. Total responsrate på carboplatin og paclitaxel terapi er 60-80%, og selv om dette svarprosenten er relativt høy sammenlignet med standard behandling av andre kreftformer flere pasienter ikke responderer på behandlingen [4,5]. I respons pasientpopulasjonen mange pasienter tilbakefall og, avhengig av tiden fra den første behandlingen til tilbakefall, et andre behandlingsregime med platinabasert kjemoterapi kan igangsettes. Svarprosenten for behandling av pasienter med tilbakefall er 20-30% hvis platina frie perioden er 6-12 måneder og 60% for platina frie intervaller på 12-18 måneder [5].
Evaluering av terapeutisk respons er ofte basert på Response evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) retningslinjer hvor evaluering av behandlingsrespons er basert på morfologisk bildebehandling med computertomografi (CT) eller magnetisk resonans imaging (MRI) [6] . Anatomisk bildebehandling med CT og MR gir ikke informasjon om de tidlige biologiske prosesser indusert av terapi og reduksjon i tumorstørrelser er ofte først påvises senere i behandlingsforløpet. Imidlertid kan tidlige biologiske endringer være prediktiv for klinisk regresjon før behandlingseffekt kan vurderes ved anatomisk avbildning. Derfor fastsettelse av svulst sensitivitet tidlig i behandlingen og ved at identifikasjon av respondere og non-respondere kan gjøre det mulig for en personlig behandling tilnærming som terapi kan bli endret i de ikke-pasienter.
Positronemisjonstomografi (PET ) avbildning er en ikke-invasiv, hele kroppen teknikk der det er mulig å måle fysiologiske prosesser
in vivo
dermed omgå prosessen med å anskaffe serie biopsier. Identifisering av en PET tracer som tidlig etter initiering av en anti-kreft-behandling gir informasjon som kan forutsi behandlingsresultat er derfor av betydelig interesse. Sammenligningen av tracer opptak i tumorer før og i begynnelsen av behandlingen brukes for å overvåke de biologiske prosesser og reaksjoner fremkalt ved behandlingen. Den glukose analoge 2-deoksy-2 – [
18F] fluor-D-glukose (FDG) og tymidinanalogen 3′-deoksy-3 «- [
18F] fluorothymidine (FLT) er to av de mest mye studert PET tracere brukes for behandling overvåking.
Imaging av stoffskiftet med glukoseanalogenen FDG brukes til diagnostisering og stadieinndeling av kreft og har høy diagnostisk nøyaktighet for ulike krefttyper. FDG krysser cellemembranen av glukosetransportører, hvorved det blir fosforylert av intracellulære hexokinases (HK) som resulterer i intracellulær overlapping til tross for ingen ytterligere metabolisme av fosforylert FDG. Glukosetransportører og hexokinases blir oppregulert i en rekke kreftformer som fører til en høy FDG opptak i tumoren sammenlignet med normale celler [7,8].
tymidinanalogen FLT anvendes for avbildning av celleproliferasjon med PET . FLT er innlemmet i cellene ved pyrimidin bergingsveien parallelt med tymidin og etter opptak i celler FLT blir fosforylert av tymidinkinase 1 (TK1). Fosforyleringen fører til intracellulær overlapping selv om den fosforylerte FLT ikke blir innlemmet i DNA [9]. Aktiviteten av TK1 er koplet til cellesyklusen, og det er hovedsakelig uttrykt i S-fase [10,11]. FLT-opptaket er positivt korrelert med cellevekst og TK1 aktivitet [11-13] og i flere studier en positiv korrelasjon mellom FLT opptak og tumorcelle-proliferasjon målt ved Ki67 immunhistokjemi (IHC) finnes [14-24].
FDG og FLT PET har både pre-kliniske og kliniske studier er vurdert som bilde biomarkører som kan forutsi og vurdere reaksjoner på ulike typer cytostatika i flere krefttyper [14,19,20,22,25 -36]. Resultatene er variabel, i noen studier tidlige forandringer i sporstoffopptak forutsi senere tumorregresjon og i andre studier ingen endringer i sporstoffopptak observeres til tross for behandlingen blir effektiv. Mekanismene bak endringene i sporstoffopptak etter behandlingsstart synes å være komplisert og avhengig av både tumortype og virkningsmåte av medikamentet anti-kreft. I tillegg kan tumorlinjen tracer aviditet påvirkninger hvorvidt eller ikke FDG eller FLT benyttes til forutsigelse av anti-kreft-behandling respons, f.eks i tumorer med lav grunnlinje tracer aviditet, er reduksjon av sporstoffopptak vanskelig å fastslå.
Karboplatin tilhører gruppen av platinabasert anti-cancer legemidler forårsaker intratrådtverrbindinger i DNA som påvirker DNA reparasjon og replikasjon. Carboplatin forårsaker cellesyklus arrest i G2 fase og induserer apoptose dersom DNA-skade ikke er ordentlig reparert [37]. Paclitaxel binder seg til og stabiliserer mikrotubuli som forårsaker cellesyklus arrest i G2 /M fase og induksjon av celledød ved apoptose [38]
Eggstokkreft er ofte positivt på FDG PET.; har imidlertid få studier undersøkt prediksjon av eggstokkreft pasient utfallet etter oppstart av antikreftterapi med FDG PET [39]. I en studie endringer i FDG-PET opptak var prediktiv av pasientenes prognose etter den første syklusen av neo-adjuvant kjemoterapi bestående av carboplatin og paclitaxel kombinasjonsbehandling [40]. FDG PET var mer nøyaktig enn enten klinisk eller histopatologiske responskriteriene eller svulst markør kreft antigen 125 (ca125) for å forutsi behandlingsresultat. I en annen studie på effekten av neo-adjuvant behandling med carboplatin og paclitaxel hos pasienter med eggstokkreft, ble det funnet at hos pasienter hvor svulsten opptak av FDG var lik normal omkringliggende opptak vev etter 3 kurs av kjemoterapi disse var mer sannsynlig å dra nytte av ytterligere 3 kurs av kjemoterapi enn pasienter uten normalisering av FDG opptak [41].
Referanse FLT-opptaket har blitt analysert i en liten gruppe av ovarialcancer pasienter hvor FLT-opptaket var høyere i ondartet sammenlignet med normal ovarievev [42]. I en pre-klinisk studie FLT opptaket ble nedsatt følgende effektive mTOR-hemming med everolimus i en cisplatin-resistent eggstokkreft tumor musemodell [25]. I cisplatin-sensitive eggstokkreft xenografter både FLT og FDG opptak er redusert dag 4 etter oppstart av behandling med cisplatin [43]. Men til vår kunnskap, ingen studier har ennå sammenlignet endringer i FLT og FDG etter behandling med en kombinasjon av carboplatin og paclitaxel i en pre-klinisk ovarian tumor modell. Resultater fra en slik studie vil være klinisk relevant, siden de kan brukes for valg av PET tracer og bilde tidspunkter.
Hensikten med denne studien var derfor å bestemme og sammenligne glukoseopptak og celleproliferasjon ved bruk av FDG og FLT PET etter behandling med en kombinasjon av carboplatin og paclitaxel i en xenograft musemodell for human ovarian cancer. Den FDG opptak ble sammenlignet med genekspresjon av GLUT1 ble Ht1 og HK2 og FLT opptak sammenlignet med genuttrykk av Ki67 og TK1.
Materialer og metoder
Tumor modell
dyr omsorg og alle eksperimentelle prosedyrer ble utført under godkjenning av den danske Animal Welfare Council (2006 /561-1124). Åtte uker gamle hunn NMRI nakne mus (Taconic Europa, Lille Skensved, Danmark) ble anvendt for generering av A2780 xenograft modell. Alle mus ble akklimatisert i en uke i dyrefasilitet før injeksjon av tumorceller. Den humane ovarie A2780 ble dyrket i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium 1640 + Glutamax (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt kalveserum (Biological Industries, Israel) og 1% penicillin-streptomycin ( Invitrogen) i 5% CO
2 ved 37 ° C. Cellelinjen ble testet fri for mykoplasma. For etablering av xenotransplantater 10
7-celler ble fortynnet i 100 ul medium og blandet med 100 ul Matrixgel ™ basalmembran Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) for hver tumor og injisert i venstre og høyre flanke hhv.
Eksperimentell design
in vivo
opptak av FDG og FLT i menneskelige eggstokkreft xenograft i mus ble bestemt. Fire grupper av mus ble anvendt (4 mus /gruppe). Baseline tumor størrelser var ca 100 mm
3 på dag -2. To grupper mottok en kombinasjon av karboplatin (Hospira, Illinois, USA) og paclitaxel (Actavis, Gentofte, Danmark) og to gruppene mottok bærer (isotonisk saltvann). Kontrollgruppene var identiske med kontrollgruppene i en tidligere publisert studie som de to studiene ble utført i parallell [44]. Doser på 40 mg /kg ip for karboplatin og 10 mg /kg iv for paclitaxel injisert på dag 0 og 5. En behandlingsgruppen (n = 8 tumorer) og en kontrollgruppe (n = 5 tumorer) som mottas FDG skanninger og en behandlingsgruppe (n = 6 tumorer) og en kontrollgruppe (n = 7 tumorer) som er mottatt FLT skanninger. Baseline FDG eller FLT PET skanner ble gjort før behandling (dag 0 eller dag -2) og gjentatt på dag 1, 4 og 8 etter behandlingsstart. Tracer opptak var i alle tilfeller kvantifiseres ved hjelp av små dyr PET /CT. I løpet av forsøkene tumorstørrelsene ble målt ved microCT [45,46]. På dag 8 umiddelbart etter siste PET /CT skanner alle svulster ble skåret ut og genuttrykk av GLUT1, Ht1, HK2, Ki67 og TK1 ble senere målt ved qPCR.
Syntese av FDG og FLT
radiosynthesis og kvalitetskontroll av FLT ble utført som tidligere beskrevet [47]. FDG ble kjøpt fra den daglige produksjoner ved Rigshospitalet (København, Danmark).
microPET /CT bildebehandling
For PET billeddiagnostikk mus ble gitt ca 10 MBq av FDG eller FLT ved en intravenøs injeksjon. Tracerne ble tillatt å fordele i en time mens dyrene var våken. Musene som fikk FDG skanninger ble fastet over natten før hver FDG injeksjon [48]. I løpet av 10 minutter lang PET skanner mus ble bedøvet med 3% sevofluran (Abbott Scandinavia AB, Solna, Sverige) i 35% O
2. PET skanner ble kjøpt med en MicroPET Focus 120 (Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, USA) og hver PET scan ble etterfulgt av en microCT skanner kjøpt med en MicroCAT® II-systemet (Siemens Medical Solutions) som tidligere beskrevet [47]. Musene ble holdt bedøvet i samme stilling under PET og CT-skanner som tillater etterpå fusjon av bildene i Inveon programvare (Siemens Medical Solutions). PET data ble arrangert i sinograms og senere rekonstruert med maksimal a posteriori (MAP) rekonstruksjon algoritme. Pikselstørrelsen var 0,3 x 0,3 x 0,8 mm og i sentrum synsfeltet oppløsningen var 1,2 mm i full bredde-og-halv-maksimum. Bildene ble ikke korrigert for demping eller scatter.
Etter fusjon av PET og CT-bilder flere region interesser (Rois) ble trukket på CT-bildene manuelt ved kvalitativ vurdering som dekker hele svulsten i flere av de tomographic flyene. Deretter alle ROIs ble summert og deretter både tumor størrelser og sporopptaket ble beregnet. Hele tumorvolum definert på CT-bilder ble derfor brukt for beregning av PET tracer opptak. Tracer opptaket ble kvantifisert ved standardiserte opptak verdi (SUV) og sporopptak etter behandling start ble beregnet i forhold til baseline opptak. Formel (C
T * W) /D
inj, hvor C
T er vevet radioaktivitet konsentrasjon, W er vekten av dyret og D
inj blir injisert dose, ble brukt til SUV-beregninger . SUVmean er et mål på den midlere vev radioaktivitet konsentrasjon i tumoren og SUVmax er et mål for vokselen i ROI med den høyeste konsentrasjonen av tracer. For både SUVmean og SUVmax opptaket etter behandlingsstart er beregnet i forhold til opptak ved baseline før behandlingsstart og derfor begrepene SUVmean ratio (SUVmean, etter behandling /SUVmean, baseline) og SUVmax ratio (SUVmax, etter behandling /SUVmax, baseline) ble brukt.
kvantitativ real-time polymerase chain reaction (qPCR)
Total RNA ble isolert med TRI reagent
® følge produsentens instruksjoner (Molecular Research Center Inc., OH, USA). RNA-konsentrasjonen ble bestemt av Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA). RNA (0,3 mikrogram) ble reversert transkribert med Affinityscript ™ QPCR cDNA Synthesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Alle primere ble utformet i Beacon Designer (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA). Primersekvensene er vist i tabell 1. For hvert gen primer konsentrasjoner ble optimalisert. Alle prøver ble kjørt i tre eksemplarer og til hver prøve en no-revers transkripsjonskontroll (NORT) ble inkludert, og på hver plate en no-mal kontroll (NTC) ble inkludert.
Navn
NCBI NM_ID
Forward primer (5′-3 «)
Omvendt primer (5’-3’)
GUSBNM_000181tgagcaagactgataccagctagaatagatgaccacaaHPRT1NM_000194caaagcctaagatgagagtgccacagaactagaacatGLUT1NM_006516catcatcttcatcccggcctcctcgttgcggttgatHK1NM_000188ggtgaaatcgtccgcaaccccgggtcttcatcgtcHK2NM_000189cggccgtgctacaataggctcgggatcatgtgagggKi67NM_002417tcccgcctgttttctttctgacctctccaaggatgatgatgctttacTK1NM_003258gccgatgttctcaggaaaaagcgcgagtgtctttggcatacttgTable 1. qPCR primer sekvenser.
CSV ned CSV
Gene uttrykket ble kvantifisert på en Mx3000P® real-time PCR system (Stratagene) med Brilliant® SYBR® Grønn QPCR Master Mix (Stratagene). Den termiske profilen var: 10 minutter denaturering ved 95 ° C etterfulgt av 45 sykluser på 30 sek denaturering ved 95 ° C, 1 minutt annealing ved 60 ° C og 1 minutt forlengelse ved 72 ° C. En dissosiasjon kurve ble deretter fremstilt ved denaturering av produktene i 1 minutt ved 95 ° C etterfulgt av en trinnvis økning i temperaturen fra 55 ° C til 95 ° C med trinn på 0,5 ºC /syklus, hvor varigheten av hver syklus var 18 sekunder.
qBase program ble brukt for QPCR dataanalyse. Den relative kvantifisering av genet av interesse (Goiss) ble presentert som gangers endring i behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen på dag 8 normalisert til den geometriske middelverdi av to referansegener [49]. De to mest stabile referanse gener ble funnet fra et panel av 12 kandidat gener i menneske referansen genet panel (TATAA Biocenter AB, Göteborg, Sverige) ved hjelp av geNorm algoritme.
Statistisk analyse
uparet elevenes t-test ble brukt for sammenlikning mellom behandlings- og kontrollgrupper. Ingen korreksjon for multiple sammenligninger ble brukt. Beregninger ble gjort i SPSS 20 (IBM Corporation, Armonk, New York, USA). Data er rapportert som gjennomsnitt ± SEM og p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Effekt av carboplatin og paclitaxel behandling på A2780 tumorvekst
Behandling av mus implantert med. A2780 xenograft tumorer med en kombinasjon av karboplatin (40 mg /kg ip) og paclitaxel (10 mg /kg iv) dag 0 og 5 resulterte i reduksjon i tumorstørrelse på dag 8 i forhold til et kjøretøy behandlet kontrollgruppe. Baseline tumorstørrelse var 118 ± 19 mm
3 i kontrollgruppen og 135 ± 16 mm
3 i behandlingsgruppen. Tumorvolum i kontrollgruppen var 926 ± 192 mm
3 på dag 8 og tumorer i karboplatin og paclitaxel (CAP) gruppe var 490 ± 73 mm
3 på dag 8 som var betydelig mindre enn de tumorer i kontrollgruppen (p = 0,03) (figur 1).
Mus implantert med A2780 xenograft tumorer ble behandlet med en kombinasjon av karboplatin (40 mg /kg ip) og paclitaxel (10 mg /kg iv) på dag 0 og 5. tumorstørrelser i carboplatin og paclitaxel gruppe ( n = 14 tumorer) som var signifikant forskjellig enn i kontrollgruppen (n = 12 tumorer) på dag 8 (p = 0,034). Tumor størrelser ble målt med microCT og presentert som gjennomsnitt ± SEM.
FDG opptak i carboplatin og paclitaxel behandlet A2780 xenografter
På dag 4 etter oppstart av behandling med carboplatin og paclitaxel FDG SUVmax forholdet var signifikant lavere i Cap-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (105 ± 4% vs 138 ± 9%, p = 0,002) og på dag 8 av FDG SUVmax forholdet var lavere i hatten sammenlignet med kontrollgruppen (125 ± 13% mot 167 ± 13%, p = 0,05) (figur 2). Den FDG SUVmax opptaket var ikke signifikant forskjellig mellom behandlingsgruppen og kontrollgruppen ved baseline og dag 1 etter behandling start. På dag 4 ble FDG SUVmean forholdet signifikant lavere i Cap-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (103 ± 4% vs. 130 ± 5%; p = 0,001). Den FDG SUVmean opptaket var ikke signifikant forskjellig mellom behandlingsgruppen og kontrollgruppen ved start og på dag 1 og 8 etter behandling start.
FDG opptak ble analysert én time etter injeksjon i en carboplatin /paclitaxel behandling (n = 8 tumorer) og en kontrollgruppe (n = 5 tumorer). Musene var PET /CT-skanning ved utgangspunktet før behandlingsstart og dag 1, 4 og 8 etter injeksjon av første dose. A) Tumor opptak av FDG under behandling av A2780 xenografttumorer med carboplatin og paclitaxel. Kvantitativ tumoropptak presenteres som SUVmean og SUVmax (gjennomsnitt ± SEM). B) Representant PET /CT-bilder av en mus fra carboplatin og paclitaxel behandlingsgruppen (øverste bilde) og en mus fra kontroll kjøretøyet behandlede gruppen (lavere bilder). Prikkete sirkler indikerer svulster.
FLT opptak i carboplatin og paclitaxel behandlet A2780 xenografter
På dagen ett opptak av FLT SUVmax ratio ble 89 ± 9% i hatten gruppen sammenlignet med 109 ± 6% i kontrollgruppen; imidlertid var forskjellen ikke statistisk signifikant (p = 0,08) (figur 3). På alle andre tidspunkter den FLT SUVmax opptaket i Cap gruppen var sammenlignbar med kontrollgruppen. På dag 1 opptaket av FLT SUVmean-forholdet var lavere i hetten sammenlignet med kontrollgruppen (96 ± 6% vs. 113 ± 5%; p = 0,05). På alle andre tidspunkter ble det ikke observert noen forskjell mellom behandling og kontroll-gruppen.
FLT opptaket ble analysert én time etter injeksjonen i et carboplatin /paclitaxel-behandling (n = 6 tumorer) og en kontrollgruppe (n = 7 svulster). Musene var PET /CT-skanning ved utgangspunktet før behandlingsstart og dag 1, 4 og 8 etter injeksjon av første dose. A) Tumor opptak av FLT under behandling av A2780 xenografttumorer med carboplatin og paclitaxel. Kvantitativ tumoropptak presenteres som SUVmean og SUVmax (gjennomsnitt ± SEM). B) Representant PET /CT-bilder av en mus fra carboplatin og paclitaxel behandlingsgruppen (øverste bilde) og en mus fra kontroll kjøretøyet behandlede gruppen (lavere bilder). På bildene av musen fra behandlingsgruppen to svulster er synlige mens på bildene for kontroll mus bare en svulst er synlig. Prikkete sirkler indikerer svulster.
Gene uttrykk for GLUT1, Ht1, HK2, Ki67 og TK1
De to mest stabilt uttrykt referanse gener var beta-glucuronidase (GUSB) og hypoxantin phosphoribosyltransferase 1 (HPRT). Nivåene av de Gois var derfor normalisert til geometrisk gjennomsnitt av GUSB og HPRT. I behandlingsgruppen GLUT1 ekspresjon var 67 ± 10% i forhold til 100 ± 16% i kontrollgruppen på dag 8; imidlertid var forskjellen ikke statistisk signifikant (p = 0,08). I behandlingsgruppen Ht1 ekspresjon var 79 ± 4% sammenlignet med 100 ± 8% i kontrollgruppen på dag 8 som var statistisk signifikant (p = 0,03) (figur 4). Det ble ikke observert forskjeller i uttrykket av HK2, Ki67 og TK1 mellom behandlings- og kontrollgrupper på dag 8.
På dag 8 umiddelbart etter siste PET /CT-skann alle svulster ble skåret ut og total RNA ble isolert og etterpå revers transkribert til cDNA. Med qPCR relative uttrykk for GLUT1, ble Ht1, HK2, Ki67 og TK1 målt. Nivåene av genet av interesse ble normalisert til de geometriske hjelp av to referanse gener GUSB og HPRT. A) For FDG studien GLUT1 ekspresjon ble redusert, forskjellen ikke er statistisk signifikant (p = 0,08), Ht1 ekspresjon var lavere i behandlingen sammenlignet med kontrollgruppen (p = 0,03). B) For FLT studien ble det ikke observert noen forskjell i Ki67 og TK1 mellom behandlingsgruppen og kontrollgruppen på dag 8. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM.
Diskusjoner
I denne studien vi beskrive den ikke-invasiv avbildning av glukoseopptak og celleproliferasjon for tidlig evaluering av behandlingsrespons i en preklinisk musemodell for human ovarian cancer behandlet med en kombinasjon av karboplatin og paclitaxel. Glukoseopptak og celleproliferasjon ble visualisert ved FDG og FLT PET respektivt. A2780 cellelinje ble brukt for generering av xenograft tumorer hos mus. Denne tumormodell svarte godt til kombinasjonsterapi med carboplatin og paclitaxel målt som en reduksjon i tumorstørrelse sammenlignet med en kontrollgruppe på dag 8 etter start av behandlingen.
På dag 4 etter behandlingsstart med carboplatin og paclitaxel, opptak av FDG var betydelig lavere i behandlingen sammenlignet med kontrollgruppen og opptak holdt seg lav på dag 8. Nedgangen i FDG opptak Parallelt med nedgang i GLUT1 og Ht1 uttrykk, mens ingen forandring i HK2 ekspresjon ble observert noe som tyder på at GLUT1 og Ht1 er involvert i FDG opptak i denne tumormodellen.
Vi observerte en tidlig, men forbigående reduksjon i celleformering målt ved FLT PET etter behandlingsstart reagere A2780 tumorer med kombinasjonen av karboplatin og paclitaxel. En forskjell i FLT opptak mellom behandling og kontroll-gruppen ble allerede observert på dag en etter behandlingsstart. I kontrast, FLT opptaket var ikke forskjellig mellom behandlings- og kontroll mus på dag 4 og 8 etter behandling start. Det samme celleproliferasjon i behandlingsgruppen og kontrollgruppen målt ved FLT PET på dag 8 ble støttet av genuttrykk målinger av Ki67 og TK1 som viste ingen forskjell i Ki67 og TK1 uttrykk mellom behandlingsgruppen og kontrollgruppen på dag 8. I andre studier ingen endring i FLT opptak, til tross for behandling med en effektiv anti-kreftterapi, har også blitt observert [29,31]. Den uendret FLT opptak sent i behandlingsforløpet kan skyldes flere faktorer. Den anti-kreft-behandling kan resultere i tilbake aktivering av
de novo
vei av DNA-syntese som resulterer i uforandret eller til og med øket FLT-opptaket til tross for redusert celleproliferasjon. Dette fenomen er for eksempel blitt observert i løpet av behandling med 5-FU [35]. Forholdet mellom pyrimidin berging sti og
de novo
sti av DNA-syntese i svulster har en stor innflytelse på opptaket av FLT og ulike svulster har variable bidragene fra de to banene [50,51]. Enkelte svulster baserer seg hovedsakelig på
de novo
syntesen av DNA-forløpere som vil resultere i lav grunnlinje FLT-opptaket til tross for høy celleformeringshastigheten [9]. Derfor er det mulig at behandling av tumorer stole primært på
de novo syntese
ikke nødvendigvis vil resultere i reduksjon i FLT-opptaket til tross for behandling med effektiv kjemoterapi som reduserer celleproliferasjon [31]. Tidligere har vi rapportert at en effektiv anti-kreft-behandling reduserte FLT opptaket i A2780 human ovarian cancer xenograft musemodell som indikerer at bergingsveien bidrar til tymidin kravet i denne tumormodellen [46,47,52]. Ingen reduksjon i celleformering forbundet gener Ki67 og TK1 ble observert på dag 8 til tross for effektiv behandling. Dermed synes det sannsynlig at den kombinerte behandling med karboplatin og paklitaxel ikke endrer celleproliferasjon sent i behandlingsforløpet selv om behandlingen reduserer tumorvekst. Carboplatin og paclitaxel ble administrert ved injeksjon på dag 0 og 5. PET billeddiagnostikk ble utført på dag 4 og 8, og dermed sporopptak ble målt på dag 4 etter at en
m og på dag 3 etter to
nd administrasjon kjemoterapi. Dette kan tyde på at behandlingen gjør reduksjonen celleformering i mindre enn 3 dager, og dette er grunnen til hvorfor ble det ikke observert noen forskjell i celleformering på dag 4 og 8 fordi tumorcellene har begynt å re-sprer. Videre undersøkelser er nødvendig for å fastslå hvor lenge spredning er påvirket etter en enkelt injeksjon av karboplatin og paklitaksel.
Både carboplatin og paclitaxel årsaken cellesyklus arrest i G2 /M-fasen. Fosforylering av FLT ved TK1 antas å være den begrensende faktor for FLT opptak og aktivitet av TK1 er korrelert med FLT opptak [13]. TK1 er hovedsakelig uttrykt i S-fasen av cellesyklus, cellesyklus-stans derfor senere i cellesyklusen kan ikke påvirke opptak av FLT.
Forskjellene mellom celleproliferasjon og glukoseopptak etter initiering av karboplatin og paklitakselbehandling illustrerer betydningen av å kombinere avbildning av flere fysiologiske prosesser for å analysere den biologiske effekten av kreftbehandling. Carboplatin og paclitaxel behandling induserte signifikant reduksjon i FDG-opptak etter dag 4 og utover, men var mindre effektiv for å redusere tumorcelle-proliferasjon målt ved FLT. Men FLT var en tidligere markør enn FDG, men forbigående. Også dette understreker viktigheten av optimal timing mellom behandling og FLT eller FDG bilde siden behandlingsrespons kan ellers bli oversett. Derfor, for å finne en avbildning biomarkør som potensielt kan være prediktiv for behandlingsresultat i fremtidige kliniske studier forskjellige bilde biomarkører, som gir informasjon om ulike fysiologiske prosesser, må evalueres.
En av de viktigste begrensningene i fore~~POS=TRUNC liggende~~POS=HEADCOMP studie var det et begrenset antall dyr ble inkludert i hver gruppe. Dette kan være grunnen til at flere av målingene ikke nådde statistisk signifikans på grunn av type II feil. Videre har studien beskrive behandlingsrespons overvåking i menneske xenografttumorer i nakne mus. Selv om svulster er av menneskelig opprinnelse, kan den ikke-menneskelige verten miljø føre til at resultatene ervervet i denne pre-klinisk modellen ikke nødvendigvis kan oversettes til kliniske studier. En annen begrensning av undersøkelsen var at de molekylære markører ble målt på genekspresjon nivå, og det er derfor ikke kjent hvorvidt eller ikke de genekspresjon nivåer er en gjenspeiling av proteinet uttrykket.
En fremtidig anvendelse av behandlingsrespons overvåking med FDG og FLT for eggstokkreft kan potensielt være evaluering av behandlingseffekt i protokoller som evaluerer effekten av å legge f.eks målrettet kreftlegemidler til carboplatin og paclitaxel standardbehandling. Fremtidige studier er nødvendig for å avgjøre om FDG og FLT PET gjelder for prediksjon og overvåking utfallet av supplerende kombinasjon sammenlignet med en standard behandling.
I konklusjonen, fant vi at endringen av FDG og FLT opptak etter oppstart behandling med carboplatin og paclitaxel var annerledes, men utfyllende. FLT gir en tidlig og forbigående signal og FDG en senere og mer langvarig respons. Således våre data tyder på at både FDG og FLT PET kan anvendes for vurdering av anti-tumor-effekter av en kombinasjon av carboplatin og paclitaxel i behandling av eggstokkreft.
