Abstract
Kreft stilk-lignende celler (cscs) /kreftfrem initiaiting celler (CIC) er definert som en liten bestand av kreftceller som har selvfornyelse kapasitet, differensiering potensial og høy tumor-initiering evne . Cscs /CIC på eggstokkreft har blitt isolert ved side populasjon (SP) analyse, ALDEFLUOR analyse og ved hjelp av celleoverflatemarkører. Men disse metodene er ikke definitive markører for cscs /CIC, og det er nødvendig å avgrense nyeste metoder for å identifisere mer høy-rene cscs /CIC. I denne studien analyserte vi SP celler og aldehyd dehydrogenese lyse (ALDH
Br) celler fra eggstokkreft celler. Både SP celler og ALDH
Br celler viste høyere tumor-initiering evne og høyere uttrykk nivå av en stamcelle markør,
sex bestemme region Y-box 2 (SOX2)
, enn for hoved befolkningen (MP ) celler og ALDH
Brønn celler, henholdsvis. Vi analyserte en SP og ALDH
Br overlappende populasjon (SP /ALDH
Br) og SP /ALDH
Br populasjonen viste høyere tumor-initiering evne enn den til SP-celler eller ALDH
Br cellene , slik at initiering av tumor med så få som 10
2-celler. Videre SP /ADLH
Br befolkningen viste høyere sfære dannende evne, cisplatin motstand, adipocyte differensiering evne og uttrykk for
SOX2
enn de av SP /ALDH
Lav, MP /ALDH
Br og MP /ALDH
Brønn celler. Gene knockdown av SOX2 trykt svulsten oppstart av eggstokkreft celler. En SP /ALDH
Br befolkningen ble påvist i flere gynekologiske kreftceller med forholdstall på 0,1% for HEC-en endometrioid adenokarcinomceller til 1% for MCAS eggstokk mucinkjertler adenokarcinomceller. Tatt sammen, bruk av SP og ALDH
Br overlapp befolkningen er en lovende metode for å isolere svært renset cscs /CIC og SOX2 kan være en roman funksjonell markør for eggstokkreft cscs /CIC
Citation. Yasuda K , Torigoe T, Morita R, Kuroda T, Takahashi A, Matsuzaki J et al. (2013) eggstokkreft stamceller er beriket i Side Befolkning og aldehyd dehydrogenase Bright Overlappbefolknings. PLoS ONE åtte (8): e68187. doi: 10,1371 /journal.pone.0068187
Redaktør: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 17. desember 2012; Godkjent: 28 mai 2013; Publisert: 13 august 2013
Copyright: © 2013 Yasuda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-i-Aid for Scientific Research fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi fra Japan (gi nr. 16209013, 17016061 og 15659097) for Praktisk anvendelse forskning fra Japan Science and Technology Agency, og for Cancer Research (15-17 og 19-14) fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan, Ono Cancer Research Fund (NS) og Takeda Science Foundation (til YH). Dette arbeidet ble støttet delvis av National Cancer Center Research and Development Fund (23-A-44). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft stamceller lignende celler (cscs) /kreft initiere celler (CIC) er definert som liten bestand av kreftceller som har de egenskapene høy tumor initierende evne, selvfornyelse evne og differensiering evne [1] – [3]. Videre er cscs /CIC vist seg å være resistente mot vanlige kreft terapier inkludert kjemoterapi og radioterapi; Derfor, cscs /CIC er ansvarlige for kreft tilbakefall etter behandling [4], [5]. Flere tilnærminger har blitt beskrevet å identifisere cscs /CIC, inkludert isolasjon av CSC /CIC-spesifikk markør celleoverflaten uttrykk (f.eks CD44, CD133, CD166), påvisning av side befolkningen (SP) cellefenotyp av Hoechst 33342 eksklusjon og påvisning av aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1) aktivitet i ALDEFLUOR assay [6]. Imidlertid er ekspresjonen av celleoverflatemarkører, SP-celler og ekspresjon av ALDH1 ikke er relatert til tumor initiere egenskaper i enkelte rapporter [7] – [9]. Disse observasjonene tyder dermed på at disse stamcellemarkører (celleoverflaten markører, SP celler og ALDH1) er ikke funksjonell og ikke nødvendig for vedlikehold av cscs /CIC. Disse markørene kan ikke definere høye tumorigene cscs /CIC, og disse markørene er dermed bare surrogatmarkører for cscs /CIC. Derfor er funksjonell ikke-surrogatmarkør som er avgjørende for vedlikehold av cscs /CIC forventet.
Eggstokkreft er en av de store malignitet og forårsaker død av mer enn én million mennesker i verden hvert år [10 ]. I tillegg har de fleste pasienter har elendig episoder av ascites, særlig i avanserte stadier. For å forbedre klinisk behandling av eggstokkreft, har eggstokkreft stamcelleforskning dukket opp som en fersk emne. CD44 celleoverflatemarkør, SP-celler og ALDH
Br-celler er blitt rapportert som stamcelle markører for gynekologiske maligniteter ved bruk av cellelinjer OVCAR3, HEC-1 og andre linjer og forrang prøver [11] – [14], og CSC /CIC forskning kan forbedre utfallet av avanserte kreftpasienter på eggstokkene.
for å forbedre metodene for isolering av høyt foredlede eggstokkene cscs /CIC, analyserte vi en kombinasjon av kjente eggstokkene CSC /CIC markører. Vi analyserte eggstokkreft cellelinjer ved SP analyse og ALDEFLUOR analyse og fant at SP celler og ALDH
Br cellene var høyere tumorigent enn de av hoved befolkningen (MP) celler og ALDH
Brønn celler, henholdsvis. Vi fant ut at det overlappende populasjon av SP celler og ALDH
Br celler (SP /ALDH
Br) var mer høyt tumorigent. Og vi fant ut at
SOX2
ble uttrykt i en SP /ALDH
Br befolkning på høyere nivå, og genet knockdown av
SOX2
avskaffet tumor-initiering av eggstokkreft celler. Derfor SOX2 kan være en roman funksjonell markør for eggstokkreft cscs /CIC og SP /ALDH
Br befolkningen er mer egnet befolkningen for analyse av eggstokkreft cscs /CIC enn SP celler eller ALDH
Br celler.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Mus ble vedlikeholdt og eksperimenterte på i samsvar med retningslinjene i og etter godkjenning av komiteen fra Sapporo Medical University School of Medicine, forsøk med dyr senteret under lisensnummer 08-006. Noen dyr funnet usunn eller syk ble raskt avlivet. Immunhistokjemisk farging Studien ble godkjent av Institutional Review Boards (IRB) i Sapporo Medical University Hospital. Vi innhentet skriftlig informert samtykke fra alle pasienter i henhold til retningslinjene i Helsinkideklarasjonen.
Cellelinjer og kultur
Menneskeeggstokkcellelinjer (MCAS, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO) og human livmor carcinoma (HEC-1) celler ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA, USA). MCAS og HEC-1-celler ble opprettholdt i minimun essensielt medium (MEM) (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). HTBoA og OVCAR3 celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). OVSAHO celler ble opprettholdt i RPMI1640 medium (Sigma-Aldrich). Hver cellelinje ble supplert med 10% FBS og dyrket i en fuktet 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C.
Side populasjon (SP) assay
Side populasjonen (SP) analysen ble utført som beskrevet tidligere med noen endringer [15], [16]. Hoechst 33342 (Lonza, Walkersville, MD, USA) fargestoff ble anvendt ved en konsentrasjon på 2,5 eller 5,0 ug /ml i nærvær eller fravær av verapamil (50 mM, Sigma-Aldrich) som en inhibitor av ABC-transportør. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 60 minutter eller 90 minutter med kontinuerlig risting. En million av fargede celler ble analysert ved FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Den Hoechst 33342 fargestoff var spent på 357 nm og dens fluorescens ble analysert ved hjelp av to bølgelengder (blå, 402-446 nm; rød, 650-670 nm).
ALDEFLUOR analysen
aldehyd dehydrogenase (ALDH) aktivitet ble oppdaget ved hjelp av en ALDEFLUOR analysesett (StemCell Technologies) i henhold til produsentens protokoll [17]. Celler ble farget med BODIPY-aminoacetaldehyd (BAAA) ved 1,5 mM og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C. En inhibitor av ALDH1, diethylamino- benzaldehyd (DEAB), ved a10-ganger molart overskudd ble anvendt som en negativ kontroll. En million av fargede celler ble analysert ved hjelp av FACS Aria II. De lyst fluorescerende ALDH1-uttrykke celler (ALDH1
Br) ble påvist i grønn fluorescens kanal (520-540 nm).
SP og ALDEFLUOR dual flekker
Cellene ble farget av Hoechst 33342 fargestoff og deretter farget av BAAA. En million av SP og ALDEFLUOR-to-farget celler ble analysert ved FACS Aria II. Cellene ble delt inn i tre grupper etter ALDH intensitet (ALDH
Br (ALDH lys), ALDH
Mid (ALDH midten), ALDH
Low (ALDH lav)), deretter analysert ved SP-analyse.
immunhistokjemisk farging
Immunohistokjemisk farging ved hjelp av formalinfikserte parafininnstøpte deler av kirurgisk reseksjon ovarialcancer vev ble utført som beskrevet tidligere [18]. Anti-ALDH1 mus antistoff ble brukt ved 250 ganger fortynning. Anti-ABCG2 kanin polyklonalt antistoff (Sigma-Aldrich) ble anvendt ved 5 ug /ml. Peroksidase-merket geite-anti-kanin-polyklonalt antistoff (Nichirei, Tokyo, Japan) ble anvendt som produsentens protokoll og visualisert ved DAB. Alkalisk fosfatase-merket geit anti-mus polyklonalt antistoff (Nichirei) ble anvendt som produsentens protokoll og visualisert ved New Fuchsin (Nichirei). Membran brune flekker ble bedømt som positiv farging for ABCG2, og cytoplasma røde flekker ble bedømt som positiv farging for ALDH1.
Xenotransplantat transplantasjon
Sortert celler ble samlet og resuspendert ved konsentrasjoner på 10
2-10
4 celler pr 50 ul av PBS og deretter blandet med 50 ul av matrigel (BD Biosciences). Den celle-matrigel blanding ble injisert i det subkutane plass av 6-ukers-gamle non-obese diabetic /alvorlig kombinert immunmangel (NOD /SCID) mus (NOD.CB17-Prdkcscid /J, Charles River Laboratory, Yokohama, Japan) under narkose. Tumorvekst ble overvåket ukentlig, og tumor volum ble beregnet ved XY
2/2 (X = lange aksen, Y = kort akse).
Sphere-analysen
Kulekolonidannelse analysen ble utført ved hjelp av CSC Komplett Recombinan Medium (Cell Systems Corporation, Kirkland, WA, USA). SP /ALDH
Br, SP /ALDH
Lav, MP /ALDH
Br og MP /ALDH
Brønn celler ble sådd ut i 10
3 celler per brønn i 6-brønnen ultra-lav festeplater (Corning Inc., Corning, NY, 14831) og dyrket i 10 dager. Morfologien til cellene ble målt og Bildene ble tatt under et lysmikroskop hver dag. Runde cellegruppene større enn 100 nm ble bedømt som kuler.
Celleviabilitet analysen
For celleviabilitet analysen, SP /ALDH
Br, SP /ALDH
Lav, MP /ALDH
Br og MP /ALDH
Brønn celler ble isolert. Deretter ble cellene platet med 1000 celler pr 96-brønners plate for en dag og ble deretter behandlet med cisplatin i 3 dager under flere konsentrasjoner. Deretter ble celleviabilitet undersøkt ved hjelp av Premiks WST-1 Cell Proliferation Assay System (Takara Bio Inc., Otsu, Japan) i henhold til produsentens protokoll.
adipocyttdifferensiering analysen
For adipocyte differensiering analysen, SP /ALDH
Br, SP /ALDH
Lav, MP /ALDH
Br og MP /ALDH
Brønn celler ble isolert. Cellene ble platet ut på 10000 celler per 24-brønners plate, og ble dyrket i serum redusert RPMI:DMEM (01:01) medium inneholdende 0,5 mM trans-retinsyre (Sigma-Aldrich) og 50 nM insulin (Sigma-Aldrich) i 2 dager etterfulgt av tilsetning av adipose differensiering medium inneholdende 170 nM insulin, 2 nM trijodtyronin og 0,5 mM rosiglitazon [19]. Celler ble opprettholdt i medium i 5 dager og nøytralt lipid-akkumulering ble detektert i 4% formaldehyd-fikserte celler ved å bruke Oil rød O (Sigma-Aldrich) farging. Lipid farging ble observert ved hjelp av mikroskop, og lipid beiset celler ble talt.
SOX2
mRNA knockdown av siRNA
En
SOX2
genet knockdown eksperiment ble utført ved hjelp av små interfererende RNA (siRNA). SOX2 siRNA (NM003106) og negative kontroll siRNA ble kjøpt fra Life Technologies. MCAS celler ble sådd i en 24-brønners plate, og transfeksjoner ble utført ved anvendelse av Lipofectamine RNAi max (Life Technologies) i Opti-MEM i henhold til produsentens instruksjoner. Førti-åtte timer senere, ble cellene analysert for uttrykk av
SOX2
,
ALDH1A1 Hotell og
ABCG2
av RT-PCR.
revers transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) -analyse
Gene knockdown av SOX2 ble bekreftet ved RT-PCR. Isolering av RNA med RT-PCR-analyse ble utført som tidligere beskrevet [20]. De termiske sykluser Betingelsene var 94 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 35 sykluser på 15 sek ved 94 ° C, 30 sek ved 60 ° C og 30 sek ved 72 ° C. Primerpar som brukes for RT-PCR-analyse var 5′-TGTTAGCTGATGCCGACTTG-3 «og 5′-TTCTTAGCCCGCTCAACACT-3» for
ALDH1A1
med en forventet PCR produkt størrelse på 154 basepar (bps), 5′-CACCTTATTGGCCTCAGGAA -3 «og 5’CCTGCTTGGAAGGCTCTATG-3» for
ABCG2
med en forventet PCR produkt størrelse på 206 bps, 5′-CATGATGGAGACGGAGCTGA-3 «og 5′-ACCCCGCTCGCCATGCTATT-3» for
SOX2
med en forventet størrelse PCR-produkt på 410 bp, 5′-GCAGTCAACAGTCGAAGAAGG-3 «, og 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′ og 5»-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 «for
glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH)
med en forventet produkt størrelse på 452 bps.
GAPDH
ble brukt som en intern kontroll.
kvantitativ real-time PCR-analyse (qPCR)
kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens protokoll.
SOX2 plakater (Hs01053049_s1),
ABCG2 plakater (Hs00184979_m1),
CD44 plakater (Hs01075861_m1),
PROM1 plakater (Hs01009250_m1) og
ABCB1
(Hs00184500_m1) primere og prober ble utformet av produsenten (TaqMan genuttrykk analyser, Applied Biosystems). Termiske sykluser ble utført ved anvendelse av 40 sykluser av 95 ° C i 15 sekunder, etterfulgt av 60 ° C i 1 min. Hvert forsøk ble gjort i tre eksemplarer, og normalisert til
GAPDH
genet som en intern kontroll.
Resultater
cscs /CIC ble beriket i SP celler
ovarian cscs /CIC har blitt isolert som SP celler fra mennesker og mus eggstokkreft linje celler [11], [21]. Vi analyserte flere gynekologiske Caner cellelinjer inkludert menneskelige eggstokkene cellelinjer (MCAS, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO) og menneskelig endometrial carcinoma (HEC-1) cellelinje (Figur 1A og Figur S1). SP-celler kunne påvises i alle linjeceller og SP-celle-forholdet ble variert fra 1,2% til 2,6%. Siden det er ingen rapport som beskriver menneskelig mucinous adenokarsinom linjen celle MCAS, vi dermed ytterligere analysert SP celler avledet fra MCAS. Cscs /CIC har høyt tumor-initiering evne til [22], vi således injiserte seriefortynnet antall av SP-celler og MP-celler inn i ryggen av tre NOD /SCID-mus subkutant for å undersøke den tumor-initiering evne. I alle tre mus ble svulster innledet med 10
4 SP celler, og svulster ble innledet med 10
4 MP celler i 2 av de 3 mus. I en mus, ble en svulst innledet med 10
3 SP celler, mens 10
3 MP celler ikke starte noen svulst (tabell 1). Størrelsen av tumorer avledet fra SP-celler var vesentlig større enn det av tumorer avledet fra MP-celler (figur 1B). Uttrykket nivåer av stamcellemarkører ble undersøkt av qPCR, og SP celler avledet fra MCAS cellene uttrykte høyere nivåer av stamcellemarkører
SOX2
,
CD44 Hotell og
PROM1
og ABC transporter genet
ABCG2
, mens
ABCB1
var ikke (figur 1C). Disse resultatene indikerer at cscs /CIC ble beriket i SP celler avledet fra MCAS celler. Resultatene ble gjengitt i minst tre uavhengige eksperimenter.
A. Påvisning av SP celler fra MCAS celler. MCAS eggstokkene mucinkjertler adenokarcinomceller ble farget med Hoechst 33342 fargestoff og analysert. Prosentandelen utgjør forholdet av SP-celler. B. Tumor initiering av SP-celler avledet fra MCAS celler. 10
3 og 10
4 SP og MP celler avledet fra MCAS celler ble inokulert subkutant i ryggen av NOD /SCID-mus, og tumorvekst ble målt ukentlig. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Forskjeller mellom SP og MP celler ble undersøkt for statistisk signifikans ved hjelp av t-test. * P-verdiene. C. qPCR av CSC /CIC markører i MCAS SP og MP celler. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Stjernene indikerer signifikant forskjell. * P 0,05. t-test.
cscs /CIC ble beriket i ALDH
Br celler
cscs /CIC kan bli isolert som ALDH
Br celler ved ALDEFLUOR analyse [23]. Vi har derfor undersøkt om cscs /CIC kan være vellykket isolert av ALDEFLUOR analysen. MCAS, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO og HEC-1-celler ble analysert ved hjelp av den ALDEFLUOR analysen, og vi har funnet at forholdet mellom ALDH
Br-celler var 8,1% til 11,3% (figur 2A og figur S1). ALDH
Br-celler og ALDH
Brønn celler avledet fra MCAS ble sortert og injisert inn i ryggen på fem NOD /SCID-mus for å undersøke den tumor-initiering evne. I alle fem mus, ble svulster innledet med 10
4 ALDH
Br celler, mens svulster ble innledet med 10
4 ALDH
Brønnceller i bare 2 av de 5 mus (tabell 1). Størrelsen av tumorer avledet fra ALDH
Br-celler var vesentlig større enn det av tumorer avledet fra ALDH
Brønn-celler (figur 2B). Uttrykket nivåer av stamcellemarkører ble undersøkt av qPCR. ALDH
Br celler avledet fra MCAS cellene uttrykte høyere nivåer av stamcellemarkører
SOX2
,
CD44 Hotell og
PROM1
, ALDH1A1, og ABC transporter genet
ABCG2 Hotell og
ABCB1 plakater (figur 1C). Disse resultatene indikerer at cscs /CIC ble også beriket i ALDH
br celle avledet fra MCAS celler. Resultatene ble gjengitt i minst tre uavhengige eksperimenter.
A. Påvisning av ALDH
Br celler fra MCAS celler. MCAS eggstokkene mucinkjertler adenokarcinomceller ble farget med BAAA og analysert. Prosentandelen utgjør forholdet av ALDH
Br-celler. Inhibitor indikere ALDH1 inhibitor (diethylamino- benzaldehyd (DEAB)). B. Tumor start ALDH
Br celler avledet fra MCAS celler. 10
4 ALDH
Br og ALDH
Brønn celler avledet fra MCAS celler ble inokulert subkutant i ryggen av NOD /SCID-mus, og tumorvekst ble målt ukentlig. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Forskjeller mellom ALDH
Br og ALDH
Brønn celler ble undersøkt for statistisk signifikans ved hjelp av t-test. * P-verdiene. C. qPCR av CSC /CIC markører i MCAS SP og MP celler. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Stjernene indikerer signifikant forskjell. * P 0,05. t-test.
SP og ALDEFLUOR dual analyse
SP celler og ALDH
Br cellene vise større utstrømming av Hoechst 33342 fargestoff og høyere uttrykk nivå av aldehyd dehydrogenese, som er ulike fenotyper og blodkreft stamceller ble isolert som en SP og ALDH
Br befolkningen i en tidligere studie [24]. Vi undersøkte derfor overlappende populasjon av SP celler og ALDH
Br celler. Etter farging av MCAS cellene med Hoechst 33342-fargestoff, ble cellene vasket og deretter farget med ALDEFLUOR reagens og analysert. I dette forsøk ble forholdet mellom SP-celler var 5,3%, og forholdet av ALDH
Br-celler var 14,4%. 7,1% av ALDH
Br celler viste SP befolkningen, og 6,9% av ALDH
Midt-celler viste SP befolkningen, og bare 3,7% av ALDH
Brønn celler viste SP befolkningen (figur 3A). ALDH
Br celler utstilt delvis overlappende, og bare 1,0% av totalt antall celler (7,1% av 14,4% befolkningen) uttrykte både SP cellefenotyp og ALDH
Br fenotype (figur 3A).
A. Oppsummering av SP og ALDEFLUOR dual analysen. MCAS celler ble farget med Hoechst 33342 fargestoff og deretter farget av BAAA og analysert. Cellene ble delt inn i tre grupper etter ALDH intensitet (ALDH
Br (ALDH lys), ALDH
Mid (ALDH midten), ALDH
Low (ALDH lav)), deretter analysert ved SP-analyse. Forholdet mellom ALDH
Br-celler var 14,4%, og forholdet mellom SP-celler var 5,3%. Forholdene mellom SP celler i ALDH
Br celler, ALDH
Midt-celler og ALDH
Brønn celler var 7,1%, 6,9% og 3,7%, henholdsvis. Forholdet mellom SP /ALDH
Br celler i celler totalt var 1,0%. B. Tumor oppstart av SP /ALDH
Br, SP og ALDH
Br celler. 10
2 og 10
3 SP /ALDH
Br, SP og ALDH
Br celler avledet fra MCAS celler ble inokulert subkutant i ryggen av NOD /SCID-mus, og tumorvekst ble målt ukentlig. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Forskjeller mellom SP /ALDH
Br og SP celler eller ALDH
Br celler ble undersøkt for statistisk signifikans ved hjelp av t-test. * P-verdiene. Daggers indikere mus død på grunn av svulst. C. Immunhistokjemisk farging av ABCG2 og ALDH1. Ovarialcancer vev ble farget av anti-ABCG2 antistoff og anti-ALDH1 antistoff. Brown membranfarging indikerer ABCG2 og cytoplasma rosa flekker indikerer ALDH1. Stjerne indikerer fartøy, og pilene viser ABCG2 og ALDH1 dobbel-positive ovarialcancer celler. Forstørrelse, × 400.
SP og ALDH
br celler har høy tumor-initiering evne
Svulsten-initiere evne til SP og ALDH
Br (SP /ALDH
Br) celler ble undersøkt ved å injisere 10
3 og 10
2-celler, respektivt, inn i NOD /SCID-mus. Overraskende, svulster ble innledet med 10
3 SP /ALDH
Br celler og med så få som 10
2 SP /ALDH
Br celler i alle mus (tabell 1). Videre svulster avledet fra SP /ALDH
Br celler viste betydelig raskere vekst enn for svulster avledet fra SP celler og ALDH
Br celler (Figur 3B). Disse resultatene indikerer at SP /ALDH
Br celler er svært beriket med CICS /cscs.
Vi utførte immunhistokjemisk farging å oppdage SP /ALDH
Br befolkningen i primære humane ovarialcancer vev. Vi brukte anti-ABCG2 antistoff for å påvise SP-celler, siden SP-celler er kjent for å uttrykke høyere nivå av ABCG2. Som vist i figur 3C, to positive (ABCG2-positive og ALDH1-positiv) eggstokkreft celler kunne påvises i ovarialcancer vev. Interessant, noen dual-positive celler eksistere ved siden av fartøyer, kan være indikerer eggstokkene cscs /CIC eksisterer i vaskulær nisje. SP /ALDH
Br-celler ble detektert også fra andre ovarier serøse adenokarsinom linjeceller (OVSAHO, OVCAR3 og HTBoA) og en endometrial cellelinje (HEC-1), og forholdene mellom SP /ALDH
Br-celler var 0,1 % til 0,8% (figur S1).
SP /ALDH
Br cellene har stamcelle fenotyper
SP /ALDH
Br befolkningen ble sammenlignet med andre populasjoner av sfæren forming analysen. SP /ALDH
Br, SP /ALDH
Lav, MP /ALDH
Br og MP /ALDH
Brønn celler ble isolert fra MCAS celler og dyrket i en ultra-lav vedlegg betingelse for tjeneste forming analyse. SP /ALDH
Br celler viste høyere sfære formasjon effektivitet enn for MP /ALDH
Br celler og MP /ALDH
Brønn celler (figur 4A). Forskjellen mellom SP /ALDH
Br celler og SP /ALDH
Brønn celler var ikke signifikant; Men SP /ALDH
Br celler har en tendens til å ha høyere sfære formasjon effektivitet enn for SP /ALDH
Brønn celler.
A. Sphere-analysen. Antallet kolonier fra fire fraksjoner (SP /ALDH
Br, SP /ALDH
Lav, MP /ALDH
Br og MP /ALDH
Lav) ble evaluert på dag 7. Data representerer betyr ± SD. Forskjellene ble undersøkt for statistisk signifikans ved hjelp av t-test. * P-verdiene. Representative bilder av kuler vises (× 100). B. adipocyttdifferensiering analysen. Cellene ble dyrket under eksistensen av trans-retinsyre, etterfulgt av adipocyttdifferensiering medium. Oli Red O-positive adipocytter ble talt opp. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Forskjellene ble undersøkt for statistisk signifikans ved hjelp av t-test. * P-verdiene. Representative bilder av Oil Red O-flekker vises (× 200). Red-flekker indikerer adipocyte differensiering.
cscs /CIC har blitt beskrevet å ha pluripotency [25], analyserte vi dermed adipocyte differensiering evne SP /ALDH
Br celler (figur 4B). Isolert SP /ALDH
Br, SP /ALDH
Lav, MPALDH
Br og MP /ALDH
Lav befolkningen ble dyrket i en adypocyte differensiering tilstand. SP /ALDH
Br celler avledet fra MCAS celler avslørt høyeste adipocyttdifferensiering evne sammenlignet med SP /ALDH
Lav, MP /ALDH
Br og MP /ALDH
Brønn celler avledet fra MCAS celler.
cscs /CIC er resistent mot kjemoterapi [4], vi dermed analysert legemiddelresistens fra SP /ALDH
Br celler. Siden cisplatin er en viktig stoff for ovarialcancer kjemoterapi, brukte vi cisplatin. Isolert SP /ALDH
Br, SP /ALDH
Lav, MPALDH
Br og MP /ALDH
Lav befolkningen ble dyrket i en tilværelse av cisplatin. SP /ALDH
Br celler betydelig høyere cisplatin motstand sammenlignet med SP /ALDH
Brønn celler, MP /ALDH
Br celler og MP /ALDH
Lav celler. Og MP /ALDH
Brønn celler utstilt høyeste følsomhet for cisplatin (figur 5A).
A. Celleviabilitet analysen. Cellene ble dyrket under eksistensen av seriefortynnet cisplatin. De levedyktige celler ble analysert ved hjelp av WST-1 kit. Y-aksen indikerer levedyktighet av cellene. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Forskjellene ble undersøkt for statistisk signifikans ved hjelp av t-test. * P-verdiene. B. qPCR analyse. Uttrykket av stamcellemarkører ble undersøkt ved hjelp av SP /ALDH
Br, SP /ALDH
Lav, MP /ALDH
Br og MP /ALDH
Lav celler. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Stjernene indikerer signifikant forskjell. * P 0,05. t-test. C.
SOX2
knockdown undertrykke uttrykk for
ALDH1A1 Hotell og
ABCG2
.
SOX2
mRNA ble slått ned av siRNA. To dager etter transfeksjon av SOX2 siRNA, uttrykk for
ALDH1A1 Hotell og
ABCG2
ble undersøkt ved RT-PCR.
GAPDH
ble brukt som en intern kontroll. Kontroll siRNA (Si-Cont) transfekterte celler ble anvendt som negativ kontroll. D. SOX2 slå ned undertrykke tumor-initiering.
SOX2
mRNA ble slått ned av siRNA. Ti tusen si-SOX2 og styrer siRNA (SI-forts) transfekterte celler ble inokulert subkutant i ryggen av NOD /SCID mus, og tumorvekst ble målt ukentlig. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Forskjeller ble undersøkt for statistisk signifikans ved hjelp av t-test. * P-verdier.
For å analysere de molekylære egenskapene til SP /ALDH
Br befolkningen, utførte vi qPCR (figur 5B).
ABCG2
mRNA ble fortrinnsvis uttrykt i SP /ALDH
Br celler og SP /ALDH
Lav celler.
ALDH1A1
ble uttrykt i SP /ALDH
Br celler og MP /ALDH
Br celler. Disse uttrykk profilene er i overensstemmelse med det faktum at SP cellefenotype er avhengig av ekspresjonen av
ABCG2
og ALDH
Br cellefenotype er avhengig av ekspresjonen av
ALDH1A1
.
SOX2
mRNA ble uttrykt på høyeste nivå i SP /ALDH
Br celler, men ikke i SP /ALDH
Brønn celler, MP /ALDH
Br celler eller MP /ALDH
Lav celler (figur 5B), som viser at SP /ALDH
Br befolkningen fortrinnsvis inneholde en stamcelle befolkningen. Siden SOX2 har en rolle i opprettholdelsen av lunge cscs /CIC [26] undersøkte vi forholdet mellom
SOX2 Hotell og uttrykk for
ABCG2 Hotell og
ALDH1A1
. Uttrykk for
ABCG2 Hotell og
ALDH1A1
ble redusert i
SOX2
mRNA slått ned celler (figur 5C). Videre SOX2 slått ned celler viste lavere tumor-initiering enn for kontroll siRNA transfekterte MCAS celler (Figur 5D). Derfor er disse resultatene tyder på at SP /ALDH
Br befolkningen uttrykker høy grad av stamcelle genet
SOX2
, som kan ha rolle i opprettholdelsen av cscs /CIC og uttrykk for
ABCG2
og
ALDH1A1
.
uttrykk nivåer av CD44, en representant markør for eggstokkreft cscs /CIC [27], [28], var lik i alle populasjoner (figur 5B). Vi undersøkte derfor forholdet mellom SP celler, ALDH
Br celler og CD44-positive (CD44
+) celler. Forholdet mellom CD44
+ celler var 8,0%. Forholdet SP /CD44
+ overlappende populasjonen var 0,9%, og forholdet mellom ALDH
Br /CD44
+ overlappende populasjonen var 3,3%. Videre er forholdet mellom SP /ALDH
Br /CD44
+ overlappende populasjon ble 0,4% (figur 6).
MCAS-celler ble farget med Hoechst 33342-fargestoff, BAAA og anti-CD44-antistoff, og analysert. Forholdene mellom SP, ALDH
Br, CD44
+, SP /ALDH
Br, SP /CD44
+, ALDH
Br /CD44
+ og SP /ALDH
Br /CD44
+ celler var 5,3%, 14,4%, 8,0%, 1,0%, 0,9%, 3,3% og 0,4%, henholdsvis.
Diskusjoner
begrepet cscs /CIC ble foreslått for lenge siden [29]. Leukemi stamceller har blitt isolert fra akutte leukemiceller [30], [31], og den første CSC /CIC populasjonen ble isolert fra bryst karsinom med kombinasjonen av CD44 og CD24 ekspresjon [32]. I de følgende verkene, ble cscs /CIC hell isolert i flere kreftformer. Men siden de molekylære mekanismene for cscs /CIC er fortsatt unnvikende og nøyaktige markører for cscs /CIC er fortsatt ukjent. Derfor er forbedringer i metoder for isolering av cscs /CIC fortsatt nødvendig.
Kombinasjon metoder med doble eller triple markører og med markører og ALDEFLUOR analysen er rapportert. Bestandene av ALDH
Br og CD44
+ /CD24
– celler viste delvis overlappende, og ALDH
Br /CD44
+ /CD24
– befolkningen viste høyere tumor-initiering evne enn den til ALDH
Br populasjon eller CD44
+ /CD24
– befolkning [17]. Den ALDH
Br /CD44
+ befolkningen og ALDH
Br /CD133
+ befolkningen stammer fra menneskelig primærtykktarmskreft viste høyere tumor-initiering evne enn for ALDH
Br, CD44
+ og CD133
+ populasjoner [33]. Disse funnene tyder på at de uttrykk for CSC /CIC markørene er delvis overlappet og at overlappet befolkningen er sterkt beriket med cscs /CIC. Ja, våre resultater viste også lignende overlapping av ALDH
Br celler og SP celler, og den overlappende befolkningen viste høyere tumor-initiering evne. I en eggstokkreft studie ALDH
Br-celler var mer anriket i CD44
+ celler enn i bruk av CD133
+ celler [23], men det ALDH
Br og CD44
+ overlapp var delvis. Vi identifiserte SP /ALDH
Br /CD44
+ overlapp befolkningen fra MCAS celler (figur 6). Derfor bruk av overlappende befolkningen i SP /ALDH
Br /CD44
+ celler kan være en bedre tilnærming til å identifisere CSC /CIC populasjoner.
Glioma stamceller har blitt beskrevet til å differensiere i endothelial celler [34]. Ondartet methotelioma stamceller har blitt beskrevet til å differensiere til endoteliale celler, nerveceller og adipocytter [25].
