Abstract
Mål
mukositt er en alvorlig sykdom i mage-tarmkanalen som skyldes kreft kjemoterapi. Vi undersøkte effekten av økende druefrøekstrakt doser av alvorlighetsgraden av kjemoterapi i en rottemodell og dens sammenfallende innvirkning på kjemoterapeutisk effektivitet i tykktarm kreft celler.
Design
Kvinne Mørk Agouti rotter ble gavaged med druekjerneekstrakt (400-1000 mg /kg) eller vann (dag 3-11) og ble injisert intraperitonealt med 5-fluoruracil (150 mg /kg) eller saltvann (kontroll) på dag 9 for å indusere mukositt. Daglige metabolske data ble samlet og rotter ble avlivet på dag 12. Tarm vev ble samlet for histologisk og myeloperoksidase analyser. Caco-2 cellelevedyktighet ble undersøkt i respons til druefrøekstrakt i kombinasjon med 5-fluorouracil av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid) -analyse.
Resultater
Sammenlignet med 5-fluorouracil kontroller, druekjerneekstrakt (400-1000 mg /kg) betydelig redusert histologiske skaden poengsum (
P
0,05) i jejunum. Druekjerneekstrakt (1000 mg /kg) økte jejunal krypten dybde med 25% (
P
0,05) i 5-Fluorouracil behandlede rotter sammenlignet med 5-fluorouracil kontroller, og svekket den 5-Fluorouracil-indusert reduksjon av slimhinnetykkelse (25%,
P
0,05). Druekjerneekstrakt (600 mg /kg) reduserte myeloperoksidase-aktivitet med 55% (
P
0,01) sammenlignet med 5-fluorouracil kontroller. Druefrøekstrakt var mer effektiv på å lindre 5-Fluorouracil indusert tarmskade, med effekter mest uttalt i proksimale jejunum. Druekjerneekstrakt (10-25 ug /ml) signifikant forbedret vekst-inhiberende effekter av 5-fluorouracil med 26% (
P
0,05) i Caco-2 celler, og var mer potent enn 5-Fluorouracil på 50-100 mg /ml.
Konklusjon
Grape seed extract kan representere en ny terapeutisk alternativ for å redusere symptomer på tarm mukositt mens samtidig påvirker på levedyktigheten til tykktarmskreftceller.
Citation: Cheah KY, Howarth GS, Bastian september (2014) Grape Seed Extract Dose-responsivt Reduserer sykdommens alvorlighetsgrad i en rottemodell av mukositt; Samtidig Styrking kjemoterapeutiske Effektivitet i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 9 (1): e85184. doi: 10,1371 /journal.pone.0085184
Redaktør: Michael Muders, Universitetssykehuset Carl Gustav Carus Dresden, Tyskland
mottatt: 20 juni 2013; Godkjent: 03.12.2013; Publisert: 21 januar 2014
Copyright: © 2014 Cheah et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Professor Gordon Howarth er støttet av en South Australian Helse og medisin Research Institute Cancer Council seniorforsker Fellowship. Ingen finansielle avtaler er på plass. Denne forskningen ble støttet av The University of Adelaide, som er medlem av Wine Innovation Cluster, Waite Campus, Adelaide, South Australia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mukositt er en alvorlig, invalidiserende konsekvens av kreftbehandling, noe som reduserer livskvaliteten hos kreftpasienter [1]. Mukositt er en smertefull tilstand som er forbundet med betennelse og sårdannelse i mage-tarmkanalen; oftest påvirker slimhinnene i munnen (oral mukositt) og tynntarmen (intestinal mukositt). Intestinal mukositt er karakterisert ved redusert enterocyte proliferasjon og øke apoptose frekvensen av krypten celler, noe som resulterer i dårlig absorpsjon og forstyrret barrierefunksjonen [2], [3]. Symptomer på mukositt inkluderer intense smerter, diaré, kvalme, oppkast og anoreksi. Ofte er det en økt risiko for bakteriell infeksjon med tilhørende mortalitet og morbiditet [1]. Noen ganger kan gastrointestinal toksisitet føre til en reduksjon eller til og med opphør av kjemoterapiregime [4]. På grunn av dette, kjemoterapi dose administrert til kreftpasienter ofte være sub-optimal; dermed nye regimer som reduserer bivirkninger, opprettholde effekten er søkt. Nåværende mukositt behandlinger er stort sett ineffektive som de målet bare symptomene, men ikke patogenesen av tilstanden [5]. Derfor er det viktig å søke nye alternative behandlinger som ikke bare retter seg mot mukositt, men også forbedre kjemoterapeutisk handling uten at det går utover trivsel for pasienten. I dag er den optimale kombinasjonen av midler som kan styrke både kjemoterapeutisk cytotoksisitet mot kreftceller og har minimal innvirkning på normale celler, er ennå ikke bestemt.
Grape seed extract (GSE) er viden forbrukes som kosttilskudd på grunnlag av dens potente anti-oxidant [6], anti-inflammatorisk [7] og påstått, anti-neoplastiske [8] egenskaper. Procyanidiner (PC) er en klasse av polyfenoliske forbindelser som består av flavan-3-ol subenheter (oligomerer og polymerer) [9]. PCer er allment funnet i andre matkilder som te, epler og rødvin og antas å være de viktigste bioaktive bestanddeler i GSE [10], [11]. Flere studier har rapportert at absorpsjon og biotilgjengelighet av PC i tarmen er avhengig av deres kjemiske struktur og polymeriseringsgrad [12]. PCer (polymeriseringsgrad = 7 eller høyere) beholdes i tarmkanalen, for derved å øke kontakttiden med tarm enterocytter for å fremme intestinal helse [10]. Studier som undersøker GSE i kombinasjon med 5-fluorouracil (5-FU) i normale dyr er begrenset. I tillegg har ingen studier blitt publisert undersøke kombinasjonen av 5-FU og GSE i tykktarm kreft modeller.
Tidligere har vi vist i en forstudie som GSE (400 mg /kg) var i stand til å redusere intestinal skade både i rottemodeller av tarm mukositt [13] og ulcerøs kolitt [14]. Men den dose som er nødvendig for å oppnå maksimal terapeutisk effekt, dose-respons og sikkerhet av GSE forble udefinert. Derfor undersøkte vi GSE tvers av en rekke doser for dens potensial for å optimalt og trygt redusere alvorlighetsgraden av tarm mukositt i en rottemodell. Økende doser av GSE ytterligere forhindret 5-FU-indusert mukositt skader, og disse behandlingene ble godt tolerert av dyrene som ble observert noen metabolske endringer sammenlignet med friske kontroller. I tillegg har vi også undersøkt effekten av kombinasjonen av GSE med 5-FU kjemoterapi på colonic neoplasi i et
in vitro
modell sammenlignet med effektiviteten av 5-FU alene. Kombinasjonen av GSE og 5-FU ytterligere forbedret toksisitet i tykktarm kreft celler.
Materialer og metoder
Kjemi
Catechin, epicatechin, metanol, phloroglucinols, askorbinsyre heksadecyltrimetylammoniumbromid (HTAB), natriumbikarbonat og
o
-dianisidine ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. Ltd, St Louis, MO. Folin-ciocalteau reagent og
13C sukrose ble kjøpt fra AnalaR, BDH, Merck, Pty. Ltd., Australia. Vevskultur løsninger omfatter Dulbeccos modifiserte Eagles Minimum Essential Medium (DMEM), kalvefosterserum (FCS), antibiotika (penicillin, streptomycin og gentamicin), Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning, dimetylsulfoksid (DMSO) og 3- (4,5-Dimethylthiazol- 2-yl) -2,5-difenyl-tetrazoliumbromid) (MTT) ble kjøpt fra Gibco BRL, Rednings Tehnologies Pty Ltd, Australia. De kjemoterapi narkotika, 5-fluorouracil (5-FU) ble kjøpt fra MaynePharma Pty. Ltd., Australia).
Grape seed extract (GSE) forberedelse
Grape seed extract ble velvillig donert av Tarac Techologies (North Adelaide, South Australia, batch nr: 02VIN03) og lagres i en lufttett, lys-motstandsdyktig pakke til å bli oppløst i destillert vann før bruk. Den GSE ble avledet fra kondensert tannin laget av australsk hvitvin Marc (rest skinn og frø fra vinproduksjon). Den ernæring profil GSE er angitt i tabell 1. Den GSE anvendt i denne studien ble oppnådd fra samme kilde med samme batchnummer til den som er beskrevet av Cheah et al [13]. Polyfenolforbindelsene Innholdet ble målt tidligere av Folin-ciocalteau analyse [13], og den kjemiske profilen ble kvantifisert ved phloroglucinolysis beskrevet nedenfor.
Folin-ciocalteau analysen
Det totale fenoliske innhold av GSE tidligere ble kvantifisert ved Folin-ciocalteau analyse [13]. Kort sagt ble GSE-prøvene tilsatt i triplikat til ikke-sterile 96-brønners plater og inkubert med Folin-reagens ciocalteu i 5 min. Natriumbikarbonat-løsning (7,5% w /v) ble tilsatt, og ytterligere inkubert i 4 timer i mørket. Platen ble avlest ved 740 nm ved et spektrometer (Multiskan® Spectrum, Therma Electron Corporation, Vantaa, Finland) med Skanit programvare 2.2. Catechin-standarder ble fremstilt fra 1 mg /ml lager (1/2 serielle fortynninger) og benyttes til å generere en kalibreringskurve. Data ble analysert ved hjelp GraphPad Prism versjon 4.0 for Windows® (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) og uttrykt i mg /ml catechin ekvivalenter.
Kvantifisering av procyanidins (PC) i GSE av phloroglucinolysis
procyanidin profil GSE ble karakterisert ved phloroglucinolysis som bestemmer subenheten sammensetning, midlere polymerisasjonsgrad (MDP) og galloylation av PC-er. Phloroglucinolysis ble utført i henhold til en tidligere beskrevet metode [15]. GSE ble oppløst i metanol (10 mg /ml, v /v) og 25 ul av GSE ble tilsatt til et likt volum av floroglucinol-løsning (0,2 N HCl i metanol, 100 g /l av floroglucinol og 20 g /l askorbinsyre ). Den phloroglucinolysis Reaksjonen ble utført ved 50 ° C i 25 minutter og analysert ved reversfase-høytrykksvæskekromatografi (RP-HPLC) ved anvendelse av (-) -. Epicatechin som kvantitativ standard [15]
Ethic utsagn
Denne studien fulgte den australske anbefalingen for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål og ble godkjent av både Animal Care og etiske komiteer av Barne-, ungdoms- og kvinnesykdommer service og University of Adelaide (AE : 777-3-2011)
Dyrestudier studier~~POS=HEADCOMP
Dame Mørk Agouti rotter (100-140 g, n = 64) ble plassert i individuelle metabolske bur (Tecniplast, Exton, PA, USA. ) i et temperaturkontrollert rom (22 ° C) med en lys-mørke-syklus på 12 timer. Rotter fikk
ad libitum
tilgang til vann og mat (18% kasein-basert diett) [16] i Animal Care Facility av Barne-, ungdoms- og kvinnesykdommer Service, North Adelaide, South Australia.
Rotter ble tilfeldig fordelt til 8 grupper (n = 8): Vann + Saline injeksjon; GSE 400 mg /kg + Saline injeksjon; GSE 600 mg /kg + Saline injeksjon; GSE 1000 mg /kg + Saline injeksjon; Vann + 5-FU-injeksjon (5-Fluorouracil: 150 mg /kg); GSE 400 mg /kg + 5-FU-injeksjon; GSE 600 mg /kg + 5-FU injeksjon; og GSE 1000 mg /kg + 5-FU injeksjon. Rottene ble akklimatisert i metabolismebur fra dag 0-2 og deretter gavaged med 1 ml GSE oppløst i vann (400 mg /kg, 600 mg /kg eller 1000 mg /kg) eller vann fra dag 3-11. På dag 9 ble alle rottene injisert intraperitonealt med enten 5-FU eller saltvann (kontroller). Daglige målinger av kroppsvekt, mat og vann inntak, og urin og avføring utgang ble registrert. Rotter ble avlivet ved CO
2 kvelning fulgt av cervikal dislokasjon på dag 12. Alle innvendige organer ble veid og kastet. De lengder og vekter av de gastrointestinale organer (tolvfingertarm, tynntarm og tykktarm) ble registrert. Representative prøver (2 cm) av gastrointestinale organer ble samlet og fiksert i 10% bufret formalin for histologisk analyse, mens fire cm prøver ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C i biokjemisk analyse.
13C-sukrose pusteprøve (SBT)
SBT er et indirekte mål på intestinal sukrase aktivitet og ble utført i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Tooley
et al.
[17] i korthet , rotter ble oro-gastrisk gavaged med 1 ml av sukrose-løsning inneholdende
13C (250 mg /kg) og pusteprøver ble oppsamlet ved 15 min intervaller i 120 min. Pusteprøver ble analysert for
13CO
2 innhold av isotopen forholdet massespektrometri (IRMS) utstyrt med en V410 datainnsamling system (Europa Scientific, ABCA 20/20, Crewe, Storbritannia). Dataene ble uttrykt som prosent kumulativ dose på 90 min (% CD90) ved å beregne endringen i pusten
13CO
2 nivåer fra baseline for hvert tidspunkt av pust samling i hele perioden av intervall prøvetaking. SBT bestemmelser ble utført på dag 3 (før GSE behandling), dag 9 (før 5-FU injeksjon) og dag 12 (før kill).
Myeloperoxidase (MPO) assay
Små tarmvevet prøvene (4 cm) av jejunum, koblings av jejunum og ileum (JI) og ileum ble tint på is og homogenisert med 1,5 ml fosfatbuffer (10 mM, pH 6,1) i 60 sekunder inntil løsningen var homogen. Homogenatene ble holdt frosset ved -80 ° C inntil behov.
MPO er et enzym som er til stede i de intracellulære granuler av nøytrofiler, som virker som en akutt inflammasjon markør. Nivået av MPO i tynntarmen ble bestemt ved en liten modifikasjon av forsøket, som er beskrevet ved Krawisz
et al.
[18] vevshomogenater ble tint på is og sentrifugert ved 13000 g i 13 min. Supernatanten ble kastet og cellepelletene ble resuspendert i hexadecyltrimethyl ammoniumbromid (0,5%, pH 6,0). Prøvene ble virvlet i 2 minutter, og ytterligere sentrifugert ved 13 000 g i 3 min. Supernatantene ble omsatt med
o
-dianisidine og absorbansen målt ved 450 nm ved 1 minutts intervaller over en periode på 15 minutter ved anvendelse av en mikroplateleser (Sunrise Microplate Reader, Tecan Austria GmbH, Grödig, Østerrike). MPO aktivitet ble uttrykt som enheter MPO aktivitet per gram vev.
Histologisk analyse
Gut vevsprøver (2 cm) ble innebygd i parafinvoks og 4 mikrometer snitt ble farget med haemotoxylin og eosin. Den samlede histologiske sykdommens alvorlighetsgrad score (ODS) av tarmavsnitt ble vurdert semi-kvantitativt (0-3) basert på 11 uavhengige histologiske kriterier i henhold til en protokoll beskrevet av Howarth
et al. Product: [19] Haug høyder og krypten dybder (40 villi og 40 Crypts per avsnitt) ble bestemt i de små tarmavsnitt inkludert jejunum, krysset mellom jejunum og ileum (JI) og ileum som beskrevet i Howarth
et al.
[19] Den kombinerte måle av Haug høyder og krypten dybder gitt en tilnærming av total slimhinnetykkelse i hver tynntarms prøven. Alle mikroskop baserte analyser ble utført på en blindet måte ved hjelp av et lysmikroskop (Nikon, ProgRes®CS, Tokyo, Japan) og image ProPlus programvareversjon 5.1 (Media Cybernetics, Silver Spring MD, USA).
Cell kultur
den humane koloncancer cellelinje, Caco-2 ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Caco-2-celler ble holdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2 – 95% luft og 90% relativ fuktighet i Dulbeccos modifiserte Eagles Minimum Essential Medium (DMEM) supplert med 10% (v /v ) føtalt kalveserum (FCS) og 1% antibiotika (penicillin, streptomycin og gentamicin) (v /v). Cellene ble dyrket i 75 cm
2 ventilerte vevskulturflasker, kulturmediet ble skiftet to ganger i uken, og cellene ble passert da de var 80-90% sammenflytende.
Celleviabilitet
inhiberingen av Caco-2-celler levedyktigheten ble bestemt ved 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazoliumbromid) (MTT) assay i henhold til en tidligere beskrevet metode av Huynh-Delerme
et al.
[20] celler (5 x 10
3 celler /brønn) ble sådd ut på 96-brønners vevskulturplater i 48 timer for å tillate festing. GSE ble fremstilt i dimetylsulfoksyd (DMSO) og fortynnet med DMEM og ytterligere filtersterilisert gjennom et 0,22 um filter (Millipore, South Australia, Australia). I alle forsøk var konsentrasjonen av DMSO i kontroll og behandlede prøver var mindre enn 0,025%. Etter 48 timer ble kulturmediet erstattet med serumfritt medium inneholdende GSE ved forskjellige konsentrasjoner (ug /ml) og 5-FU (uM) og videre inkubert i enten 24 eller 48 timer. MTT-løsning ble fremstilt i Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning (1 mg /ml) og sterilfiltrert for å fjerne biologiske forurensninger. Deretter ble 50 ul av MTT-løsning tilsatt til hver brønn og inkubert ytterligere ved 37 ° C i 4 timer. Mediet ble erstattet med 100 ul DMSO for å ekstrahere formazanprodukt. Platene ble plassert på en risteinkubator i 15 minutter og leses av spektrometer ved 570 nm. Data ble uttrykt som antall levedyktige celler i prosent av kontrollceller behandlet med serumfritt medium bare.
Statistiske analyser
Statistiske analyser ble utført ved bruk av PASW 18 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) og XLSTAT versjon 2011.4.02 (Addinsoft SARL, Frankrike). Alle para data inkludert kroppsvekt, daglig metabolske data, SBT, MPO, villus høyde og krypten dybde og celleviabilitet ble sammenliknet med enveis variansanalyse (ANOVA) med en Tukey s
post-hoc
test. Den samlede poengsum sykdommens alvorlighetsgrad (ODS) ble sammenlignet ved en Kruskal-Wallis-test med en Mann Whitney U-test for å identifisere betydning mellom gruppene. Data ble betraktet som signifikant på
P
. 0,05
Resultater
Karakterisering av procyanidins av phloroglucinolysis
GSE hadde lav masse konvertering (23,8% w /w), MDP (5,9) og molekylvekt (1871 g /mol), som målt ved phloroglucinolysis (tabell 2). PC-kontakten subenheter i GSE var for det meste dominert av (-) -. Epicatechin-3-
O
-gallate
Daglig metabolske parametere og kroppsvekt
Oral administrasjon av GSE (400, 600 eller 1000 mg /kg) mellom dag 3 og 9 ikke signifikant påvirke kroppsvekten, mat eller vann inntak og urin eller feces utgang sammenlignet med rotter som fikk vann (tabell 3). 5-FU injeksjons betydelig økt vanninntak og urinproduksjon og redusert kroppsvekt, matinntak og fekal utgang sammenlignet med rotter som fikk saltløsning injeksjon mellom dag 10 og 12 (tabell 4). GSE 600 og 1000 mg /kg i 5-FU behandlede rotter betydelig returnert fekal-utgang (
P
0,01), tilbake mot verdiene for normale saltvann-injisert kontrollrottene
Visceral organer
5-FU injeksjon betydelig redusert thymus vekt med 51% (
P
0,001) og milt vekt med 20% (
P
0,05). Sammenlignet med normale kontroller
Sukrose pusteprøve (SBT)
5-FU-injeksjon signifikant (
P
0,001) reduserte SBT (% CD90) med 70% i forhold til verdiene i vann + saltvann behandlede rotter, indirekte indikerer 5-FU injeksjon hadde forstyrret børstesømmen sukrase aktivitet (figur 1). Det var ingen signifikante forskjeller i% CD90 blant noen av de 5-FU behandlede rotter som fikk GSE sammenlignet med 5-FU behandlet kontrollrotter. I tillegg ble det ikke observert noen signifikante forskjeller i% CD90 mellom GSE og vannbehandling, noe som tyder ingen av GSE doser hadde beviselig påvirket på børsten grensen sukrase aktivitet i friske rotter (figur 1).
Data uttrykt som gjennomsnitt ( % CD90) ± SEM. *** Indikerer
P
. 0,001 sammenlignet med vann + Saline
Myeloperoxidase aktivitet (MPO)
Etter 5-FU-injeksjon, var det en betydelig (
P
0,001) økning i MPO aktivitet i proksimale jejunum, krysset mellom jejunum og ileum (JI) og ileum vann + 5-FU behandlede rotter (1092%, 357% og 297% henholdsvis) i forhold til vann + saltvann behandling (figur 2). GSE 600 mg /kg signifikant (
P
0,01) redusert MPO-aktivitet med 55% i forhold til vann JI + 5-FU-behandlede rotter (Figur 2B). Det var ingen signifikant forskjell i MPO aktivitet mellom GSE og vannbehandling i friske rotter (figur 2), noe som indikerer at GSE administrering ikke påvirket MPO aktivitet i friske dyr.
Data er uttrykt som middelverdi (MPO-enheter /g vev) ± SEM. * Viser
P
0,05, ** indikerer
P
0,01 og *** angir
P
0,001 sammenlignet med rotter som fikk vann og saltvann injeksjon. ## Indikerer
P
. 0,01 sammenlignet med rotter som fikk vann og 5-FU-injeksjon
Generelt sykdommens alvorlighetsgrad score
Administrasjon av 5-FU betydelig økt sykdommens alvorlighetsgrad stillingen i den proksimale jejunum når bestemt ved semi-kvantitativ histologisk alvorlighet stillingen analyse (figur 3 og 4). 5-FU kontroller oppnådd den høyeste poengsummen skade (median poengsum = 30) og var betydelig større enn vann + saltvann behandlede rotter (median poengsum = 1,
P
0,01). GSE behandling betydelig redusert sykdommens alvorlighetsgrad score i 5-FU behandlet rotter i en dose-forståelsesfull måte (GSE 400 = 21 (15,5 til 25,5),
P
0,01; GSE 600 = 15,75 (9-24)
P
0,01; og GSE 1000 = 11,75 (7-19),
P
0,01) sammenlignet med 5-FU kontroller. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i sykdommens alvorlighetsgrad poengsum mellom GSE og vann behandlet rotter som fikk saltvann injeksjon (figur 3), noe som indikerer at GSE ikke hadde forstyrret tarm integritet hos friske dyr.
Alvorlighets score ble vurdert basert på 11 parametere i ulike lag i tarmvevet basert på tidligere beskrevet protokoll Howarth
et al.
[19] boksplottene representerer spekter av sykdommens alvorlighetsgrad score og de horisontale linjene representerer median sykdomsgrad poengsum. ** Indikerer
P
0,01 i forhold til vann + Saline. ## Indikerer
P
. 0,01 i forhold til vann + 5-FU
(. Original forstørrelses 40 ×)
Villus høyde, krypten dybde og slimhinnetykkelse
5-FU injeksjon resulterte i forkorting av villi i jejunum (38%,
P
0,001), JI (39%,
P
0,001) og ileum (26%,
P
0,01) sammenlignet med vann kontroller (figur 5). 5-FU-injeksjon også redusert krypten dybde i jejunum (38%,
P
0,001), JI (23%,
P
0,05) og ileum (15%,
P
0,05). I jejunum, GSE behandlinger hadde en tendens til å dosere-responsivt forbedre villus-høyde og krypt dybde, selv om bare GSE i en dose på 1000 mg /kg signifikant (
P
0,05) økte krypt dybde sammenlignet med 5-FU kontroller (figur 5A). Viktigere, ingen av GSE behandlinger påvirket negativt på villushøyde og krypten dybde i friske dyr. 5-FU injeksjon betydelig redusert slimhinnetykkelse i jejunum (38%,
P
0,001), JI (45%,
P
0,001) og ileum (29%,
P
0,01) sammenlignet med vann-kontroller (figur 6). GSE behandlinger hadde en tendens til å dosere-responsivt øke slimhinnetykkelse i jejunum, selv om bare GSE 1000 mg /kg signifikant økt slimhinne-tykkelse (25%,
P
0,05) sammenlignet med 5-FU-kontroller (figur 6A) .
data er uttrykt som gjennomsnitt (mikrometer) ± SEM. * Viser
P
0,05, ** indikerer
P
0,01 og *** angir
P
0,001 sammenlignet med vann + Saline. # Indikerer
P
0,05 sammenlignet med vann + 5-FU
Data er uttrykt som gjennomsnitt (mikrometer) ± SEM.. * Viser
P
0,05, ** indikerer
P
0,01 og *** angir
P
0,001. # Indikerer
P
. 0,05 sammenlignet med vann + 5-FU
Effekter av 5-FU om levedyktighet Caco-2 celler
dose respons av 5-FU (0-100,000 uM) på Caco-2-celler i 24 timer og 48 timer er vist i figur 7. 5-FU-dosen ble også testet ved 72 timer (data ikke vist). Cellelevedyktigheten til Caco-2-celler ble hemmet av 5-FU i en tids- og doseavhengig måte. Ved 24 timer, 5-FU på 100 uM betydelig redusert levedyktighet i Caco-2-celler til 88% (
P
0,05) fra kontrollverdiene og en ytterligere reduksjon av cellenes levedyktighet ble observert på 70% (
P
0,05) av kontrollverdiene på 48 timer. En 100 mikrometer konsentrasjon av 5-FU ble valgt for neste forsøket fordi denne dosen var i stand til å redusere Caco-2 celler levedyktighet (70-85%) som gjenspeiler gastrointestinal toksisitet ofte observert hos kreftpasienter etter kjemoterapi.
Data er uttrykt som prosent av cellelevedyktighet i forhold til levedyktigheten til ubehandlede kontroller. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av 2-3 uavhengige eksperimenter. Bar data ikke deler samme bokstav er signifikant forskjellig
P
. 0,05
Effekter av GSE og 5-FU på Caco-2 celleviabilitet
I for å fastslå cytotoksisitet av GSE på Caco-2-celler, GSE (10-100 ug /ml) ble applisert på cellene i 24 eller 48 timer (figur 8). GSE behandling hemmet cellelevedyktighet i en dose- og tidsavhengig måte. GSE behandlinger signifikant (
P
0,05) redusert cellelevedyktighet (IC
50 = 50,24 ug /ml) ved 24 timer og ble mer toksiske for Caco-2-celler etter 48 timer (IC
50 = 37,84 pg /ml). Når cellene ble utsatt for kombinasjonen av GSE (10-100 ug /ml) og 5-FU (100 uM), større antall av døde celler var tydelig sammenlignet med celler eksponert for 5-FU alene (figur 8). Ved 24 timer, 5-FU betydelig redusert cellelevedyktigheten til 84% (
P
0,05) fra kontrollverdier. Interessant, når Caco-2-celler ble utsatt for kombinasjonen av GSE og 5-FU, den veksthemmende virkninger av 5-FU ble betydelig forbedret med 26% (GSE = 25 ug /ml;
P
0,05, kombinert behandling vs. begge legemidlene alene) på 24 timer. GSE ved høyere doser (50-100 ug /ml) som utøves større veksthemming sammenlignet med 5-FU alene. Ved 24 timer, GSE induserte signifikante veksthemmende virkning på Caco-2-celler (GSE 50 = 33% og GSE 100 = 27%;
P
0,05) sammenlignet med 5-FU-kontroll (84% av kontrollen verdi) (figur 8A). I tillegg GSE alene signifikant (
P
0,05) reduserte levedyktigheten til Caco-2 celler (GSE 50 = 31% og GSE 100 = 29%;
P
0,05) sammenlignet med 5-FU-kontroll (64% av kontrollverdien) etter 48 timer (Figur 8B).
data er uttrykt som prosent av cellelevedyktighet i forhold til ubehandlede kontroller. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av 4 uavhengige eksperimenter. Bar data ikke deler de samme bokstavene er signifikant forskjellig
P
. 0,05
Diskusjoner
Denne studien representerer den første rapporten fra GSE dose-responsivt reduserende alvorlighetsgraden av mukositt. Våre funn tyder på at høyere doser av GSE er mer effektive ved å redusere alvorlighetsgraden indikatorer på tarm mukositt hos rotter, og at disse GSE-induserte effekter i stor grad er doseavhengig og mer tydelig i den proksimale jejunum sammenlignet med den distale tynntarm.
Injeksjon av 5-FU virkninger på tynntarmen i større grad enn i tykktarmen, antagelig på grunn av større cellen omløpshastighet i mer proksimale deler av tarmen [3]. Våre resultater er i overensstemmelse med tidligere studier [18], [19], [21], karakterisert ved at 5-FU mukositt modell resultert i alvorlige tarmskade 72 timer etter induksjon av mukositt. Denne skaden var preget av en reduksjon av intestinal børste grenseenzymaktivitet [21], økt nøytrofile infiltrasjon [22], økt sykdomsgrad poengsum [23] og redusert slimhinnetykkelsen [13]. I samsvar med tidligere studier [13], blunting av villi og uorden av krypter (plassering av stamceller) var de primære hendelser assosiert med alvorlig mukositt. Jejunum er den maksimale skadestedet indusert av kjemoterapi og effekten blir mindre uttalt i de mer distale områder av tynntarmen [13]. Dette ble vist i denne studien, hvor mindre skade ble observert når det gjelder MPO aktivitet (neutrofil infiltrering), villus-høyde og slimhinnetykkelse i den distale enden av tynntarmen
Biotilgjengeligheten av PC i tarmen systemet er godt dokumentert i andre studier [24]. Den unike polymerisert struktur av PCer hemmer absorpsjon over i tynntarmen, som de holder seg til tarmslimhinnen [25]. Tsang
et al.
[26] oppdaget større former for PC-er i tynntarmen hos rotter opp til 12 timer etter inntak. Således kan en ansamling av relativt høye konsentrasjoner forekommer i PC-tarmkanalen for å beskytte den intestinale barriere. I denne studien, høyere doser av GSE (1000 mg /kg) var effektive til å opprettholde krypt dybde og slimhinnetykkelse i jejunal-regionen, med de fleste verdier som nærmer seg verdiene av friske kontroller. Videre er denne studien viste også forbedring av fekal utgang (mindre alvorlig diaré) i kjemoterapi-behandlede rotter som fikk den høyere dose av GSE (600 mg /kg og 1000 mg /kg), noe som tyder på redusert forstyrrelse av mucosal slimhinnen i tynntarmen .
Selv om GSE i den aktuelle studien var mer effektive i jejunum, stedet for store intestinal skade, bioaktivitet ble redusert i distal tynntarm. Dette kan ha vært grunnet degraderte bioaktive komponenter som når den distale delen av tynntarmen, [27], [28]. Spalting, absorpsjon og metabolisme av GSE er viktig å identifisere den skjebnen av bioaktive forbindelser i GSE. I fremtidige studier vil det være nødvendig å identifisere form, størrelse og bioaktivitet av procyanidins fra GSE ansvarlig for å fremme intestinal helse ved hjelp av
in vitro
og
in vivo
modeller av intestinal absorpsjon. I tillegg kan fremtidige studier undersøke beskyttelsen av GSE, muligens ved mikroinnkapsling, eller via stikkpille anvendelse, for bedre å målrette GSE og forbedre dens biotilgjengelighet i de mer distale områder av tarmen. På grunn av kompleksiteten av GSE-innhold, ville det være vanskelig å bestemme hvilke faktorer som er ansvarlig for den observerte bioaktivitet. Av denne grunn, GSE, i stedet for alternative proteinkilde som for eksempel bovint serum ble brukt som sin egen kontroll. Administrasjon av GSE på normale dyr tillatt mer nøyaktig sammenligning med GSE-behandlede rotter som fikk 5-FU kjemoterapi.
Interessen for GSE har vært først og fremst på grunn av sin høye antioksidant innhold. GSE er en mer potent radikaler enn andre kjente antioksidanter som vitamin C og E [29]. I den foreliggende undersøkelse, den partielle reduksjon i akutt inflammasjon av GSE, som indikert ved reduksjon av MPO-aktivitet, og reduksjon i lymfocytt-infiltrering registrert av sykdommens alvorlighetsgrad stillingen analyse, kan styrke den potensielle rolle av GSE som et potent anti-oksidant og anti-inflammatorisk middel. En rekke studier har beskrevet GSE som et anti-inflammatorisk middel. For eksempel har GSE blitt rapportert å redusere ekspresjonen av pro-inflammatoriske cytokiner (TNF-α og IL-6) i mesenteriske lymfeknuter [30], rotte-plasma [31] og karragenan-indusert poteødem hos rotter [32].
