Abstract
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom er et uløst helseproblem med nesten 75% av pasienter diagnostisert med avansert sykdom og en samlet 5-års overlevelse i nærheten 5%. Til tross for den sterke koblingen mellom dødelighet og malignitet, er mekanismene bak bukspyttkjertelkreft spredning og metastase dårlig forstått. Samsvar patologisk og cellekultur analyser tyder kjemokinreseptoren CXCR4 spiller en biologisk rolle i bukspyttkjertelkreft progresjon.
In vivo
roller for CXCR4 ligand CXCL12 i bukspyttkjertelen kreft ble undersøkt. CXCR4 og CXCR7 ble gående uttrykt i normal og kreft i bukspyttkjertelen duktalt epitel, etablerte cellelinjer, og pasient-avledet primære kreftceller. I forhold til friske eksokrine kanaler, ble CXCL12 uttrykk patologisk trykt i bukspyttkjertelen kreft vevsprøver og pasient avledet cellelinjer. For å teste de funksjonelle konsekvensene av CXCL12 stanse, bukspyttkjertelkreft cellelinjer stabilt expressingthe kjemokin ble konstruert. I samsvar med en rolle for CXCL12 som en svulst suppressor celler som produserer chemokine wereincreasingly tilhenger og migrasjon mangel
in vitro Hotell og dårlig metastatisk
in vivo
, sammenlignet med kontrollceller. Videre CXCL12 gjeninnføring betydelig redusert tumorvekst
in vitro,
med betydelig mindre svulster
in vivo
, som fører til en markert overlevelsesfordel i en preklinisk modell. Sammen utgjør disse dataene viser en funksjonell svulst undertrykkende rolle for normal uttrykk for CXCL12 i bukspyttkjertelen kanaler, som regulerer både tumorvekst andcellulardissemination til metastaser
Citation. Roy jeg, Zimmerman NP, Mackinnon AC, Tsai S, Evans DB, Dwinell MB (2014) CXCL12 chemokin Expression Undertrykker menneskelig kreft i bukspyttkjertelen vekst og metastasering. PLoS ONE 9 (3): e90400. doi: 10,1371 /journal.pone.0090400
Redaktør: Jeffrey K. Harrison, University of Florida, USA
mottatt: 11. november 2013, Godkjent: 29 januar 2014; Publisert: 04.03.2014
Copyright: © 2014 Roy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra en sunnere Wisconsin og MCW Cancer Center. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Vi har følgende interesser. Dr. Dwinell er en mottaker av et patent (# 8404640) for bruk av CXCL12 i behandling av ondartet kreft og er en co-grunnlegger av Protein Foundry, LLC. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke vår tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfattere. Tittelen på patentet er: «Metode for diagnostisering og behandling av tykktarmskreft»
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er anunrelenting form for menneskelig kreft, med ingen effektiv teknikk for tidlig diagnose. eller behandling, og en forekomst nesten lik dødelighet [1], [2]. De fleste pasientene ved diagnosetidspunktet, allerede har lokalavansert eller metastatisk sykdom, noe som gjør kirurgisk reseksjon av primærtumor av begrenset terapeutisk verdi [3] .Current farmasøytiske behandlinger for PDAC er utilstrekkelige som det store flertallet av kreft i bukspyttkjertelen pasienter dør av mikro – eller makrometastatisk sykdom [4]. En bedre forståelse av de biologiske mekanismene bak aggressivitet PDAC er nødvendig. Selv om nyere studier har funnet de molekylære faktorer involvert i utviklingen av PDAC [5] – [7], er lite kjent om de biologiske mekanismene som regulerer cellemotilitet og, i sin tur, metastaser. Kjemotaktiske cytokiner eller kjemokiner, spille keyroles i cellulær migrasjon, og er i stand til å koordinere flere aspekter av den cellemigrering maskineri. Ved aktivering av deres reseptorer, chemokinesregulate flere fasetter av normal fysiologi, inkludert leukocytt handel, epitelial cellemigrasjon er nødvendig for lukking av sår, vev vaskularisering, og organutvikling i løpet av embryogenesen [8] – [10]. Tidligere vårt laboratorium revealedthe betydningen av den doble uttrykk for chemokine CXCL12 og kognatreseptoren CXCR4 i enterocyte migrasjon, sårheling, og angiogenese [11] – [16]
Flere studier har implisert en rolle for kjemokin. reseptorer, særlig CXCR4 og CCR7, i kreft progresjon og metastase [9], [17] – [22]. CXCR4 uttrykk har vært knyttet til malignitet av over 20different kreft [17], [23]. Vi har tidligere vist at CXCL12 blir uttrykt i normale epitelceller i tarmen og melkekjertler, men er epigenetiske dempet i human bryst- og tykktarmskreft [24], [25] .Denne mønster av CXCL12 genet repressionresults i tumorceller som chemokine – reseptor profilesmirror at av høyt mobile leukocytter som uttrykker reseptorer CXCR4 og CXCR7 men ikke den ligand. Vi viste at gjen uttrykk for CXCL12 redusert evne for brystkreft og tykktarmskreftceller til å spre [24] – [26] .Several studier haveextended de forutgående funn vise gunstige effektene av autokrint CXCL12 i bryst, lunge, mage, og hodet og hals-kreft [27] – [30]. Tap av CXCL12expression i osteosarkom og brystkreftpasient tumor specimenswas korrelert med dårligere prognose [31] – [34]. I kreft i bukspyttkjertelen, motstridende og mangelfulle rapporter tyder heller på at CXCL12 uttrykk er hevet eller at CXCL12 er ikke uttrykt i de aller fleste pasientene [35], [36]. Dermed mens en økende mengde bevis antyder en tumor-undertrykkende rolle for CXCL12 i human kreft, forblir dens mekanistiske roller i PDAC dårlig forstått.
Den rådende modellen av kreft metastasering er at ondartede svulster spredt seg til fjerne vev gjennom over-uttrykk for CXCR4 [22], [37], [38], og dermed sensibiliserende ondartede celler til å spre seg i respons til fjerne gradienter av CXCL12 produsert av metastatiske destinasjon organer. Denne modellen har også blitt brukt til å forklare PDAC metastasering, som flere rapporter dokumentere ekspresjon av CXCR4 av pankreas karsinom-cellelinjer og humane vev [39] – [42]. Men ingen av disse studiene har grundig undersøkt den parallelle ekspresjonen av CXCL12 eller CXCR7 i sammenheng med CXCR4 eller definerte uttrykk for hvilken som helst av de tre komponentene av denne chemokin-aksen i normal pankreas epithelium.The formålene med denne studien var å bestemme ekspresjonsprofilen og funksjonell rolle CXCL12-CXCR4-CXCR7 aksen i både friske normale og maligne bukspyttkjertelen. Heri våre data viser at mens reseptorekspresjon økes, CXCL12 ekspresjon betydelig redusert i resected PDAC vev og et batteri ofpancreatic cancercellelinjer sammenlignet med normal pankreata. CXCL12 uttrykk ble forbigående restaurert med hemmere av epigenetisk repression.Stable gjeninnføring av CXCL12 i PDAC celler hindret rettet celle migrasjon og levermetastaser og bremset tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
, noe som resulterer i økt overlevelse i prekliniske modeller.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Fritatt, avidentifisert normal pankreata, prøver PDAC vev og unike pasient avledet PDAC celler ble hentet fra Surgical Oncology Biorepository bruker en Medical College of Wisconsin (MCW) InstitutionalReview Board # 4 godkjent protokoll. Vev og celler i biobanken ble oppnådd fra pasienter etter signert skriftlig informert samtykke og er kodet og avidentifisert, med personlig identifiserbar informasjon ikke deles med forsknings etterforskere. Prekliniske mus xenograft studier ble gjennomført ved hjelp av protokoller og prosedyrer som er dokumentert i et etablert Animal Bruk Application (AUA076) godkjent av MCW Institutional Animal Care og bruk komité og i samsvar med retningslinjer fastsatt av Office of Laboratory Animal Welfare og i samsvar med guide for Care og bruk av LaboratoryAnimals. Alle musene ble holdt under patogenfrie forhold, fikk mat og vann ad libitum, og opprettholdt i en 10 timers: 14-timers lys /mørke-cyklus i et temperaturkontrollert rom (25 ± 2 ° C) .Animals ble avlivet ved avslutningen av studien eller etter tegn på stress eller dårlig kroppens tilstand som vurderes av kvalifisert laboratoriepersonell og bekreftet av MCW Biomedical Resource Center, ansatte veterinærer å bøte smerte og ubehag forbundet med tumordannelse.
menneske~~POS=TRUNC cellelinjer
Panc1 (CRL-1469), MiaPaCa2 (CRL-1420), Capan2 (HTB-80), og HPAFII (CRL-1997) cellelinjer ble kjøpt fra ATCC. Panc1 og MiaPaCa2 cellelinjer ble holdt i DMEM supplementert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS). De Capan2and HPAFII cellelinjer ble opprettholdt i 10% (v /v) FBS supplert McCoys 5Aor MEM medium, respektivt. I noen eksperimenter ble celler dyrket i normalt medium ble behandlet daglig med 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza) eller Trichostatin-A (EMD Biosciences). MiaPaCa2 cellelinjer ble transfektert med Firefly-luciferase henhold zeocin utvalg. Resulterende luciferase-uttrykke MiaPaCa2 celler ble deretter transfektert med plasmider som koder enten EGFP eller menneskelig CXCL12, og kloner dyrket under Neomycinseleksjon forhold [26]. Cellelinjer ble avidentifisert av alle identifikasjonsparametere fra enkelt samtykkende pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og ble bekreftet å være av PDAC opprinnelse følgende DNA karyotype og protein uttrykk analyse.
Menneske bukspyttkjertelen tissuespecimens
Normal kanaler og Panin lesjoner ble isolert utelukkende fra nærliggende normalt vev utkast av organtransplantasjon eller pankreas operasjoner som ikke involverer PDAC eller andre eksokrine malignitet. Sykdomsstatus på de normale og kreft tissueswas bekreftet av en bord-sertifisert pathologist.A totalt 25 vev fra 21 ulike pasienter ble brukt for vanlige analyser. Totalt 82 vev fra 29 forskjellige pasienter ble anvendt for tumor analyser. Av de 29 pasientene som gir PDAC vev, hadde 11 pasienter fikk neo-adjuvant behandling.
RT-PCR
RNA ble isolert fra celler og vev-prøver ved hjelp av RNAeasy kit (Qiagen) og behandlet med DNase (Ambion), omdannet til cDNA, og CXCL12, CXCR4, CXCR7, og GAPDH transkripsjon ekspresjonen analyseres som definert tidligere og optimalisert for effektivitet i et lineært område [24], [43] .A-regionen til 5′-utranslaterte område av mannose-bindende lektin-genet ble amplifisert for å detektere genomiske DNA forurensninger [12]
Immunoanalyses
Ufarget glass ble generert fra pankreatiske tumorprøver og CXCL12 immunostained ved hjelp av et antistoff fra R ab72100), og Ki-67 (ab15580) ble oppdaget ved hjelp av antistoffer fra Abcam.Visualization ble gjort ved hjelp av pepperrot-konjugert sekundære antistoffer og 3,3′-diaminobenzidinePeroxidase substrat Kit (Vector Labs). For å unngå bakgrunnsstøy lysbilder ble ikke kontra. Protein uttrykk nivåer ble scoret ved hjelp av en standard 4-punkts skala [0 = fraværende, 1 = svak, 2 = blandet, og 3 = sterk fargeintensitet] [44]. Analysene ble uavhengig fullført av en etterforsker blindet for sykdomsstatus og farging protokollen. Utskilt CXCL12 protein fra supernatanten av kreft i bukspyttkjertelen celler dyrket i serumfritt medium ble oppdaget av ourpreviously etablert sandwich-ELISA-metoden ved hjelp av antistoffer fra R fig. 2A). CXCL12 chemokine ekspresjon ble begrenset spesifikt til duktalt rommet og fraværende fra acinar og endokrine celler, som begge farget for kjemokin reseptorer CXCR4 og CXCR7 (data ikke vist). Inkubering av parallelle seksjoner med isotypekontrollantistoffer confirmedspecificity (fig. 2A). Vi neste undersøkt uttrykk i pre-maligne bukspyttkjertelen lesjoner, kjent som bukspyttkjertelen Intra-epitelceller Svulster (PanINs) [48] – [51]. Som vist i figur 2C-D, CK19 + PanINsexpressed både CXCR4 og CXCR7. Til sammenligning, CXCL12 farging wasmore variabel, med blandet tomarkedly redusert ekspresjon i PanINs sammenlignet med normale bukspyttkjertelkanaler (Fig.2C-D). I en begrenset analyse, kan ingen signifikante forskjeller i CXCL12 uttrykk oppdages mellom PanIN1, PanIN2, og PanIN3 lesjoner.
Serie deler av normal og sykt bukspyttkjertelen vev ble farget for CXCL12, CXCR4, CXCR7, og CK19. CXCL12 farging tydelig i normale eksokrine kanaler ble redusert i PDAC vev. CXCR4 farging økt i Panin og PDAC i forhold til normal ductal epitel. CXCR7 uttrykk var variabel i normal epitel, Panin lesjoner, og PDAC. (A) Normal vev fra en enkelt pasient med sunn bukspyttkjertelen representerer observasjoner fra 25 forskjellige normale vev fra 21 enkeltpasienter. (B) PDAC vev fra en pasient representerer observasjoner fra 82 forskjellige vev fra 29 forskjellige pasienter. 1000 × forstørrelse representerer innfelt boks på 200 ×. (C) Farging ble kvantifisert ved blindet scoring av seriesnitt i forhold til CK19 farging. (***) Betegner
P
≤0.001.
Representative 200 × bilder av den samme (A) normal eller (B) pancreatic ductal adenokarsinom (PDAC) vev vist i 1000 × forstørrelse i Figur 1. Representative serieseksjons bilder av en bukspyttkjertelen tarm svulst (Panin) lesjon på (C) 200 × eller (D) 1000 × forstørrelse. Serie vevssnitt ble immunostained med antistoffer mot CK19, CXCL12, CXCR4, og CXCR7, eller isotype kontroller. n = 25 forskjellige normale vev fra 21 individuelle pasienter, 82 forskjellige vev fra 29 forskjellige PDAC pasienter, eller 19 patologisk bekreftet Panin lesjoner.
Analyse av PDAC svulstvev revealeda videre, og mer uttalt, utryddelse av CXCL12 i CK-19 + tumorceller (Fig.1B, Fig.2B). I heterogene tumorvev inneholdende både ondartede og normale kjertler, ble CXCL12 farging redusert i ondartede celler, butpreserved i tilstøtende normale ductal-celler (data ikke vist). Analyse av serie vev sectionsrevealed som ondartet vev med lave nivåer av CXCL12had en resiprok økning i CXCR4, så vel som CXCR7, farging (fig. 1B, fig. 2B). Kvantifisering av CXCL12, CXCR4, og CXCR7 farging intensitet bekreftet betydelig reduksjon i CXCL12 uttrykk under progressionfrom normalt å forløper Panin til ondartet bukspyttkjertelen vev (Fig. 1C). I motsetning til dette ble CXCR4 uttrykk i forhøyet PanINsand PDAC sammenlignet med normale kanaler (Fig.1C). Scoring av CXCR7 uttrykk avslørte en bifasisk mønster med lavere uttrykk som forekommer på Panin scenen og høyere uttrykk tilbakevendende i PDAC (Fig.1C) .Da pasientene ble delt inn i grupper avhengig av hvorvidt de hadde fått neo-adjuvant behandling, pasienter som får standard-of-care regimer med gemcitabin eller FOLFIRINOX terapi [52] – [54] hadde signifikant (
P
≤0.05) høyere score for CXCL12 uttrykk (0,82 ± 0,18) sammenlignet med pasienter som ikke fikk neoadjuvant terapi (0,43 ± 0,09)
CXCL12 uttrykk og epigenetisk regulering i bukspyttkjertelen kreftcellelinjer
for ytterligere å karakterisere chemokin -. reseptor uttrykk og identifisere en passende modell for å studere funksjonen av CXCL12 i PDAC, primær pasient avledet og etablerte bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble analysert ved RT-PCR ved hjelp av våre tidligere optimalisert primersett for CXCL12, CXCR4, og CXCR7 [24], [43]. RT-PCR indikerte konsekvent mangel på CXCL12 avskrift i pasient-avledet primære samt Panc1, MiaPaCa2, Capan2, og HPAFII cellelinjer (Fig.3A-B). Etter avtale med immunhistokjemiske analyser, ble CXCR4 mRNA opprettholdt i 7of de 8 PDAC cellelinjer, mens CXCR7 uttrykk var mer variabel (Fig.3A-B). Flowcytometri bekreftet celleoverflate lokalisering av CXCR4 og CXCR7 på representative cellelinjer (Fig.3C). For å fastslå om mangelen på CXCL12 uttrykk reflektert epigenetisk stanse, ble cellene behandlet med titrerte doser av DNA metyltransferase hemmer 5-aza. Den hemmer reddet CXCL12mRNA uttrykk i representative cellelinjer (Fig.3D). Behandling med histondeacetylase inhibitor Trichostatin-aalso restaurert uttrykk for CXCL12 i Capan2 celler (Fig. 3E). Basert på våre tidligere undersøkelser som undersøker de spesifikke mekanismene for CXCL12 promoter hypermethylation i colorectal og brystkreft [24], [25] Disse dataene tyder på at CXCL12 uttrykk er regulert gjennom epigenetiske mekanismer i bukspyttkjertelkreft som well.Cumulatively, indikerer thesedata CXCL12 gen undertrykkelse i menneskelig tissueand et batteri av nye og etablerte PDAC celle lines.The MiaPaCa2 cellelinjen ble identifisert som en ideell modell, som sin CXCL12-CXCR4-CXCR7 uttrykk mønster etterligner det observert hos ondartet menneskelig PDAC vev.
RT PCR-analyse viste at (A) pasient-avledet bukspyttkjertelcancercellelinjer (# 1, # 2, # 3, # 4) eller (B) etablerte cellelinjer manglet ekspresjon av CXCL12 og opprettholdt ekspresjon av CXCR4. CXCR7 mRNA var tilstede i 3 av 8 PDAC lines.Flow cytometrisk deteksjon (C) av overflate CXCR4 eller CXCR7 proteinekspresjon. Cellelinjer treatedseven dager med en konsentrasjon kurve av (D) 5-aza-2-deoksycytidin (5-aza) gjenopprettet ekspresjon av CXCL12.Linestreated 4 dager med en konsentrasjon kurve av (E) Trichostatin-A (TSA) gjenopprettet CXCL12 mRNA-ekspresjon i Capan2 celler.
CXCL12 re-uttrykk i humane PDAC celler disruptedchemotaxis, økt lim potensial, og nedsatt levermetastaser
Den konvensjonelle paradigme for chemokin mediert metastasering av kreft celler er at uttrykket av CXCR4 er pro-metastatisk. Denne modellen stammer fra muligheten av eksogent CXCL12 å stimulere vandring av kreftceller
in vitro
[13], [45], [55]. Som forventet, måling av det native migrering potensialet av flere CXCL12-manglende pankreatiske cellelinjer avdekket at CXCR4-uttrykkende PDAC celler migrerer mot akutt CXCL12 stimulering (Fig. 4A). Viktigere, Panc1 og MiaPaCa2 celler migrert mot CXCL12 i tofase-konsentrasjonsavhengig måte som er forenlig med dagens forståelse av kjemotaktisk migrasjon [55], [56]. Den HPAFII cellelinje som manglet overflate ekspresjon av enten CXCR4 eller CXCR7 var ute av stand til å migrere i respons til CXCL12 behandling (Fig. 4A). Panc1 cellsalso invaderte en ekstracellulær matriks som reaksjon på akutt eksogen stimulering CXCL12 (Fig. 4B).
(A) Panc1 og MiaPaCa2 celler migrerte mot eksogene gradienter av CXCL12 i et område fra 1 nM til 1000 nM i henhold til serum- frie forhold (*), (**), og (***) betegne
P
≤0.05,
P
≤0.01, og
P
≤0.001, henholdsvis , sammenlignet med ustimulerte celler (NS). Reseptor-null HPAFII cellene ikke migrere som respons på CXCL12. (B) CXCL12 retning Panc1 celle chemoinvasion inn i en tre-dimensjonal Matrigel plugg. Den positive kontrollen (+) var 10% serumholdig medium. (*), (**), Og (***) betegne
P
≤0.05,
P
≤0.01, og
P
≤0.001, henholdsvis i forhold til ustimulerte celler (NS).
Vi tror at den pro-metastatisk respons av PDAC celler skyldes stanse av uttrykk for CXCL12. For å teste dette ble introdusert uttrykk for chemokine, ved hjelp doublestable plasmid integrering, inn MiaPaCa2 celler. Cellene ble først stabilt transfektert med ildflue-luciferase og deretter transfektert med flere gener ved hjelp av en annen valg reagent.Several CXCL12-uttrykke kloner ble generert sammen med en kontroll klone transfektert med EGFP, hver utstilling ekvivalenter nivåer av luciferase aktivitet (Fig.5A-B ). Viktigere, mangel på chemokine produksjonen var confirmedby ELISA i Panc1, MiaPaCa2, Capan2, og HPAFII cellelinjer (Fig. 5C). Funksjonell chemokine produksjon i CXCL12-uttrykkende kloner sammenlignet med GFP-uttrykkende kloner av MiaPaCa2 celler ble validert ved hjelp av ELISA andtranswell migrering av U937-celler (Fig.5C-D) .MiaPaCa2 celler som utskiller CXCL12demonstrated en betydelig reduksjon i vandrings reaksjon på TGF-βor CXCL12 , både kjente førere av
in vitro
PDAC celle migrasjon (Fig.6A-D). Gitt viktigheten av klebemiddelpotensialet i de metastatiske egenskaper til kreftceller, ble celleadhesjon neste målt. CXCL12 positive celler var signifikant mer vedheftende til vevskultur plasticcompared til kjemokin null-celler (fig. 6E). Disse
in vitro
data indikerer at den totale malignitetspotensiale av kreft i bukspyttkjertelen celler, både i den evnen som disse celler til å migrere og unngå substrat adhesjon er redusert etter gjeninnføring av den CXCL12 transkripsjon inn i PDAC celler.
luciferase-nivåer i kontroll GFP eller tre forskjellige (31, # 2, # 3) CXCL12-uttrykkende kloner MiaPaCa2 som målt ved spektrofotometrisk (A) eller IVIS-100 BioPhotonic imager (B). Nivåer av CXCL12 ble målt med ELISA (C) i etablerte PDAC cellelinjer samt GFP- og CXCL12-uttrykke MiaPaCa2-luciferase kloner. (D) CXCL12-utskilt av transfekterte MiaPaCa2-luciferase-klonene # 1 og # 2 stimulerte U937-kjemotaksis. Celler behandlet med nøytraliserende antistoffer til CXCL12 (αL12) bekreftet spesifisiteten av U937 chemotaxis. Verdier i A, C og D er gjennomsnitt ± SEM, n = 2-3.
(A) Transwell migrasjon analyser avslørte betydelig redusert kjemotaksis av CXCL12-uttrykke kloner (# 1 og # 2) sammenlignet med ligand null (GFP) celler. Tiltrekningsmidler var serum-fritt media (-), 10% serum (+), eller 10 nM CXCL12 (L12) i serumfritt medium. betegne
P
≤0.01 og
P
≤0.001, henholdsvis, sammenlignet med 10 Nm CXCL12 stimulert GFP celler, n = 5. (B) CXCL12 re-uttrykk redusert TGF-β (5 ng /ml) indusert kjemotakse forhold til CXCL12-null-celler. (##) Betegner
P
≤0.01 forhold til TGF-B-stimulerte GFP-celler, n = 4. (C) og amp; (D) Representative bilder av eksperimenter i (A) og (B) respektivt. (E) CXCL12-uttrykkende celler var signifikant mer vedheftende til vevskultur plast forhold til CXCL12-null-celler. Ubehandlede celler = (-), nøytraliserende antistoff for CXCL12 aktivitet = (αL12), og en positiv kontroll = 1 ng /ml EGF (+). (##) Betegner
P
≤0.01 sammenlignet med 10% serum-stimulerte kontrollceller. (*), (**), Og (***) betegne
P
≤0.05,
P
≤0.01 og
P
≤0.001, henholdsvis i forhold til ustimulerte GFP celler, n = 7.
neste søkt å finne ut om den samtidige økt limet og redusert migratoryphenotypes i PDAC cellene ville suppressmetastatic spre
in vivo
opptakerendinkandugjennomføreopptakfraen heterotop xenograft mus modell. CXCL12-uttrykkende og CXCL12-null-celler ble injisert inn i milten hos SCID-mus. Over 28 dager,
in vivo
sporing av celler indikerte at, sammenlignet med kontrollceller, var det en signifikant forandring i evnen til CXCL12-uttrykkende celler MiaPaCa2 å formidle bort fra den første området av inokulasjon (figur 7a -B).
Ex vivo
analyse indikerte at luminescens på stedet av milten inokulasjon var uendret, mens mus injisert med PDAC som produserer CXCL12had betydelig lavere levertumor belastning enn mus injisert med GFP-kontrollceller (Fig.7C-E). Disse dataene antyder at CXCL12 endrer spesielt evnen til kreft i bukspyttkjertelen celler til hjem til leveren, et organ med høy uttrykk for CXCL12 og en felles metastatisk destinasjon PDAC pasienter.
(A) Representative Bioluminescens bilder av mus xenopodet med GFP- eller CXCL12-uttrykke celler ved implantasjon (dag 0), eller studieslutt (dag 28). (B) Whole-body
in vivo
utstråling over tid GFP- og CXCL12-mus. (C)
Ex vivo
utstråling skåret milt (C), noe som reflekterer kreftceller på injeksjonsstedet, eller metastatisk destinasjon (D), som gjenspeiler redusert levermetastaser fra CXCL12-uttrykkende celler i forhold til GFP-celler . (**) Betegner
P
≤0.01, n = 4-5. (E) Representant H . E-bilder viser uttalt tumormasse i leveren av kontroll (GFP), i forhold til eksperimentell (CXCL12) xenopodet mus
Samtidig CXCL12, redusert CXCR4 og CXCR7 uttrykk tumor celleproliferasjon og metastasering og forlenget overlevelse i en preklinisk PDAC modell
Tidligere hadde vi observert at re-uttrykk for CXCL12 i kolorektal kreft celler føre til økte anoikis, avløsning basert apoptose [24], [43]. Vi testet om gjeninnføring av CXCL12 inn PDAC celler ville endre sin apoptotisk eller proliferativ potensialer. I serumfrie betingelser, ble en økning i apoptose detektert i adherente CXCL12-uttrykkende kreft i bukspyttkjertelen celler når sammenlignet med GFP-uttrykkende kontroller, selv om denne responsen ble dempet ved tilsetning av serum (fig. 8A-B). Ved anvendelse av en etablert modell for å studere avløsning-indusert apoptose, ble cellene dyrket på poly-HEMA [43]. Som med adherente celler ble øket apoptose i ikke-adherente CXCL12-positive PDAC-celler sammenlignet med kontroller, men igjen tilsetning av serum ga ingen endring i apoptose (Fig.8C-D). Celle nummer forble uendret mellom ikke-heft CXCL12-positive og negative cellepopulasjoner (Fig. 8C-D).
apoptose av GFP og CXCL12-uttrykke MiaPaCa2 celler ble vurdert ved hjelp av caspase 3/7 glo assay.Cells ble sultet i 24 timer og dyrket i 0% serum (A, C) eller 1% serum (B, D) inneholdende medium. (A-B) apoptose i adherente CXCL12-uttrykkende celler ble hevet sammenlignet med enten GFP-uttrykkende kloner i serumfrie betingelser med ingen endring sett i 1% serum. GFP-celler werestimulated med 100 uM gemcitabin som en kontroll. (C-D) for å måle celleantall og løsgjøring basert apoptose av celler i suspensjon, MiaPaCa2-luciferase celler ble dyrket på poly-HEMA. Ved hjelp av Viacount reagenset og flowcytometrisk celletelling, var det ingen forskjell i levende celle nummer observert i ikke-klebende CXCL12-null (GFP) eller uttrykkende celler når de dyrkes enten i 0% (C) eller 1% serum (D). Apoptose av poly-HEMA dyrkede celler avslørte en i økning av aktiv caspase-3/7 begrenset til celler dyrket i serumfrie betingelser bare (C) uten noen endring observert i 1% serum (D). Gemcitabin (GEM) ble brukt som en kontroll for redusert celletall og økt apoptose. (*), (**), Og (***) betegne
P
≤0.05,
P
≤0.01, og
P
henholdsvis ≤0.001 i forhold til å kontrollere celler (GFP). Verdier er gjennomsnitt ± SEM, n = 4-5.
Gitt minimal endring i anoikis-følsomhet i CXCL12-uttrykke PDAC celler i serumholdig forhold, vi neste testet sitt vekstpotensial. I sterk kontrast til våre data i menneskelige kolorektal eller brystkreft [24] – [26], [43], befolkningsvekst på CXCL12 uttrykke PDAC ble betydelig redusert sammenlignet med chemokin manglende celler (fig.9). Lavere vekst av CXCL12-uttrykke celler ble observert i både serum-fri og serumholdig forhold (Fig.9A-B).
