Abstract
For å identifisere aggressivitet-forbundet molekylære mekanismer og biomarkør kandidater i blærekreft, vi utførte en SILAC (stabile isotoper Merking av aminosyrer i cellekultur) proteomikk analyse som sammenligner en invasiv T24 og en aggressiv metastatisk avledet T24T blærecancercellelinje. Totalt 289 proteiner ble identifisert uttrykt forskjellig mellom disse cellene med høy selvtillit. Komplementær og validering analyser inkluderte sammenligning av protein SILAC data med mRNA uttrykk forholdstall hentet fra oligonukleotid mikromatriser og immunoblotting. Cul3, en overuttrykt protein i T24T, involvert i ubiquitinering og påfølgende proteasomal nedbrytning av target proteiner, ble valgt for videre undersøkelser. Funksjonelle analyser viste at Cul3 stanse redusert proliferativ, migrasjon og invasive priser av T24T celler, og restaurert uttrykk for cytoskjelett proteiner identifisert til å være underexpressed i T24T celler ved SILAC som ezrin, moesin, filamin eller caveolin. Cul3 immunhistokjemiske protein mønstre utført på blæren svulster oppdaget på microarray (n = 284), var assosiert med svulst staging, lymfeknutemetastase og sykdomsspesifikk overlevelse. Dermed blir SILAC tilnærmingen identifisert som Cul3 modulert aggressiv fenotype av T24T celler ved å modifisere ekspresjonen av cytoskjelett proteiner involvert i blærekreft aggressivitet; og spilte en biomarkør rolle for blærekreft progresjon, nodal metastaser og klinisk utfall vurdering
Citation. Grau L, Luque-Garcia JL, González-Peramato P, Theodorescu D, Palou J, Fernandez-Gomez JM, et al. (2013) En kvantitativ proteomikk analyse avdekker relevans CUL3 i blærekreft Aggressivitet. PLoS ONE 8 (1): e53328. doi: 10,1371 /journal.pone.0053328
Redaktør: John Matthew Koomen, Moffitt Cancer Center, USA
mottatt: May 19, 2012; Godkjent: 30 november 2012; Publisert: 08.01.2013
Copyright: © 2013 Grau et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning (SAF2009-13035) fra den spanske utdanningsdepartementet og kultur (til MS-C.). J.L.L.-G. ble støttet av «Ramón y Cajal» program, og CTQ2010-18644 tilskudd fra det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft representerer den fjerde vanligste kreftformen blant menn og den åttende hyppigste årsaken til mannlige kreftdødsfall [1]. Klinisk, ca 75% av overgangscellekreft (TCC) er ikke-muskel invasiv (TIS, Ta og T1), 20% muskel infiltrerende (T2-T4), og 5% metastatisk ved diagnosetidspunktet [1]. Lavgradige svulster er papillær og vanligvis ikke-invasiv, mens høyverdig svulster kan være enten papillær eller ikke-papillær, og ofte invasiv. Pasienter diagnostisert med lokalisert TCC har en 5-års overlevelse over 90%. Pasienter med regional og fjernt metastatisk sykdom har en 5-års overlevelse under 50% og 10%, henholdsvis [1]. Blærekreft progresjon følger komplekse sekvensielle trinn, ikke helt forstått [2] – [4]. Forskjeller i aggressivitet adferd er beskrevet mellom invasiv T24 blærekreft cellelinje og mer aggressive T24T variant som utvikler metastaser etter halevenen injeksjon [5] – [9]. Identifisering av ulikt uttrykte proteiner mellom disse cellene kan avdekke molekylære mekanismer forbundet med tumor aggressivitet in vitro kan føre til metastasering. Proteiner deltar i slike baner kan fungere som biomarkører for enten tidlig identifisering av aggressive utfall og /eller potensielt være terapeutisk målrettes.
Kvantitative proteomikk bidrar til oppdagelsen av kandidaten sykdomsspesifikke mål og biomarkører. Mens protein og antistoff-arrayer tillater differensial kvantifisering av kjente proteiner [10], [11], massespektrometriteknikker anført for protein identifikasjon [12]. Stabil isotop merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC) omfatter tilsetning av (12) C- og (13) C-merkede aminosyrene til vekstmediet separat dyrkede celler, gir opphav til celler inneholdende «lys» eller «tunge» proteiner, henholdsvis [12] – [31]. Så vidt vi vet, har SILAC ikke blitt rapportert i blærekreft. Her ble en kvantitativ proteomikk analyse anvendt til T24 og T24T celler for å identifisere proteiner og veier relatert til deres differensial aggressivitet følgende vårt eksperimentelle utforming (figur 1).
Funksjonelle analyser ble utført for å vurdere den differensial aggressiv fenotype av T24 og T24T blære kreftceller på: A) spredning, B) invasjon, og C) migrasjon. Gjennomsnittet av to eksperimenter for hver enkelt funksjonell analyse av disse cellene ved flere tidspunkter er vist i hvert panel. D) Skjematisk diagram som viser arbeidsflyten brukes for multipleksede SILAC baserte eksperimenter. Intern Merkingen ble utført
in vitro
, ble proteinekstrakter fraksjonert via SDS-PAGE, spaltet med trypsin i gel, og tryptiske fordøyinger ble analysert ved LC-MS /MS til både å identifisere og kvantifisere proteinene til stede. E) Sammenligning av proteinforandringer identifisert av SILAC ble utført med de som ble observert ved oligonukleotid arrays. F) Validering av proteinforandringer identifisert av SILAC i Western blot av proteinekstrakter hentet fra T24-T24T celler. G) Immunohistokjemi på vev arrays som inneholder blæren svulster servert å validere sammenslutninger av identifiserte proteiner med clinicopathological variabler i blærekreft. H) siRNA stanse av identifiserte proteiner og påfølgende funksjonelle analyser og immunblot validering servert for å evaluere effekten av identifiserte kandidater på den aggressive fenotype av T24T og regulering av andre differensielt uttrykte proteiner identifisert av SILAC.
Material og metoder
1. Funksjonell analyse av T24 og T24T blærekreftceller
Cellekultur.
T24 ble oppnådd fra American Type Culture Collection og dyrket som tidligere beskrevet [32], [33]. T24T ble avledet fra T24 på Dr Theodorescu laboratorium [5] – [9]. Celler ble dyrket i 4-6 passeringer og høstet ved 75% -90% konfluens. Cellepelletene ble vasket tre ganger i kald PBS og frosset ved -20 ° C før RNA og protein utvinning.
proliferasjonsanalyse
1.2×10
4 celler per brønn ble sådd ut i 96 -vel plater i triplikat i DMEM inneholdende 10% FBS. Etter dyrking i 24, 48, 72 og 96 timer, ble spredning målt med MTT analysen (Roche, Mannheim, Tyskland).
Sårtilheling analysen.
3.5×10
5 celler ble sådd i 6-brønns plater, og et sår ble laget på den monolaget ved hjelp av en steril pipette når cellene nådde konfluens. Fotografier av celler invaderer såret ble tatt på de angitte tider.
Invasion analysen.
Cell kultur 24-brønners plater inserts (porestørrelse 8 mikrometer, BD Biosciences, San José, California) var seeded med 2.5×10
4 T24 og T24T celler, og også med T24T celler etter 24 og 48 timer etter transfeksjon med Cul3 siRNA (50 nM) i 500 ul DMEM-medium med 0,1% FBS i det øvre kammer. Medium med 10% FBS (500 ul) ble tilsatt til det nedre kammer som et kjemotaktisk middel. Matrigel invasjons kamre (BD) ble opprettholdt i 24 timer i en fuktet inkubator ved 37 ° C, 5% CO
2 atmosfære. Cellene på begge sider av matrigel kammeret ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter, vasket med PBS, farget med 1 ug /ml 4′-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI: Sigma, St. Louis, MO) i 10 minutter og analysert ved konfokalmikroskopi (Leica TCS-SP5, Wetzlar, Tyskland). Antallet invaderende celler ble vurdert med Imaris programvare (Bit Plane, Zürich, Sveits), beregning av prosenten av invasjonen som:.. Antall invadere celler /totalt antall celler × 100
Cul3 stanse
Cul3 slått ned ble utført i T24T ved transient transfeksjon med Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, California) bruker kontroll (ikke-targeting) lite forstyrrende dobbelttrådet RNA (siRNA) og smart bassenget siRNA rettet mot Cul3 (både fra Dharmacon, Waltham, MA). Cul3 stanse transfektanter utsatt for 50 nM og 100 nM av målrettet siRNA var samlet på 24 og 48 timer etter spredning, migrasjon eller invasjon analyser, som beskrevet ovenfor. Cul3 stanse ble bekreftet av immunoblotting.
2. SILAC protein profilering
Cell Kultur og Metabolsk merking.
T24 og T24T celler ble opprettholdt i lysin og arginin-utarmet DMEM (Millipore, Billerica, MA) supplert med 10% dialysert FBS (Invitrogen, Carlsbad, California), 100 enheter /ml penicillin /streptomycin (Invitrogen) og enten naturlig forekommende isotopen hopetall ( «lys») (T24) eller stabile isotop-merket ( «tunge»)
13C
6 lysin og
13C
6 arginin aminosyrer (Cambridge Isotope Labs, Andover, MA) (T24T). Kulturmedier ble fornyet etter 2 dager ved å fjerne halvparten av volumet til stede på hver plate, og erstatte det med friskt medium. Celler ble dyrket i minst 6 doblinger å tillate full innarbeiding av merkede aminosyrer. To store SILAC gjentak (2 × 10
7 celler per tilstand) ble utført. Komplett inkorporering av
13C-Arg og
13C-Lys i T24 og T24T celler etter seks celledelinger i isotopically tung medium (direkte og revers merking) ble verifisert ved MS av et protein fordøye.
protein fraksjone~~POS=TRUNC.
for å redusere kompleksiteten av prøven, en kjernefysisk /cytosol fraksjonering ble utført. Celler ble lysert i en lyseringsbuffer (20 mM HEPES, pH 7,0, 10 mM KCl, 2 mM MgCl, 0,5% Nonidet P40, 1 mM Na
3VO
4, 1 mM PMSF, 0,15 U mL
-1 aprotinin) og homogenisert med 30 slag i en Dounce homogenisator. Homogenatet ble sentrifugert ved 1500 g i 5 minutter for å sedimentere kjernene. Supernatanten ble deretter resedimented ved 15.000 g i 5 minutter, og den resulterende supernatant dannet ikke-nukleær eller cytosol fraksjon. Den nukleære pellet ble vasket tre ganger og resuspendert i den samme buffer inneholdende 0,5 M NaCl. Det ekstraherte materialet ble sedimentert ved 15 000 g i 10 minutter og den resulterende supernatant ble betegnet som den nukleære fraksjonen.
SDS-PAGE og in-gel-fordøyelse.
Proteiner i cytosol og atom fraksjoner ble separert ved SDS-PAGE på 10% SDS-polyakrylamidgeler. Totalt 80 pg protein ble applisert per kjørefelt. Etter elektroforese ble proteinene visualisert ved Coomassie blå farging og gelen kjørefelt ble kuttet horisontalt inn i 20 seksjoner. Skåret ut gel bånd ble kuttet i små stykker og avfarget i 50:50 25 mM ammoniumbikarbonat /acetonitril, dehydrert med acetonitril og tørket. Gelbitene ble rehydrert med 30 ul av 12,5 ng /ml trypsin-oppløsning i 25 mM ammoniumbikarbonat og inkubert over natten ved 37 ° C. Peptidene ble ekstrahert ved bruk av acetonitril og 5% maursyre, ble tørket ved vakuumsentrifugering og resuspendert i 15 pl av 2% acetonitril i 0,1% maursyre. Alle prøver ble ultralydbehandlet i 10 min før MS-analyse.
Nanoflow LC-MS /MS.
peptid blanding fra i-gel tryptiske digestions (med 30 mL av trypsin på 12,5 ng /ml ) ble analysert ved bruk nanoflow LC-MS /MS. Peptidene ble påsatt på en kolonne felle (Reprosil C
18, 3 um partikkelstørrelse, 0,3 x 10 mm, 120 Å porestørrelse, SGE) og deretter eluert med analytisk kolonne (Acclaim PepMap 100, C
18, 3 um partikkelstørrelse 75 um x 15 cm, 100 Å porestørrelse, Dionex, LC emballasje) med en lineær gradient av 5-80% acetonitril i 0,1% maursyre. Prøven ble levert over 120 min med en nano-LC ultra 1D pluss system (Eksigent) på en 200 Nl /min strømningshastigheten til en rustfritt stål nano-boringen emitter (OD 150 mikrometer, ID 30 mikrometer, Proxeon, Odense, Danmark) . Peptider ble skannet og fragmentert med en LTQ XL lineær ionefelle massespektrometer (Thermo, San Jose, CA), som brukes i data-avhengige ZoomScan og MS /MS bytte modus ved hjelp av de tre mest intense forløpere påvist i en undersøkelse skanning 400-1600 u (tre μscans). ZoomScan masse vindu ble satt til 12 Da muliggjør overvåking av hele
12C /
13C isotoper konvolutten av de fleste dobbelt og tredobbelt ladede peptider. Enkeltvis ladede ioner ble ekskludert for MS /MS-analyse. Normalisert kollisjonsenergien ble satt til 35% og dynamisk eksklusjon ble brukt under 3 min perioder for å unngå repetitive fragmentering ioner.
Protein identifikasjon og kvantifisering.
Generated .RAW filer ble konvertert til .mgf filer for MASCOT database søk. En database som inneholder NCBInr Homo Sapiens sekvenser som inneholder 34180 protein oppføringer (som av 04-03-2008) ble søkt hjelp MASCOT programvare (versjon 2.3 Matrix Science) for protein identifikasjon. Søkekriterier inkludert trypsin spesifisitet med en savnet cleavage tillatt, og metionin oksidasjon,
13C-Arg og
13C-Lys som variable modifikasjoner. Et minimum forløper fragment-ion mass nøyaktighet på 1,2 og 0,3 Da, henholdsvis, og et krav om minst to bold røde (unike peptider) per protein var nødvendig for protein kvantifisering. Cut-off verdier for Mascot score av peptider og proteiner ble satt til 39 (
p
0,05) og 46 (
p
0,01), henholdsvis for å vurdere dem så nøyaktige identifikasjoner . Den falske positive ble beregnet å søke på samme spektra mot NCBInr Homo Sapiens lokkefugl randomisert database. Relative kvantifisering prosenter av identifiserte proteinene ble beregnet ved hjelp QuiXoT (versjon 1.3.26). SILAC T24T /T24 forhold ble definert av intensitetene av de tunge peptider (C
13) dividert med intensiteter av lys peptider (C
12). Protein prosenter innhentet av QuiXoT ble manuelt kontrollert for alle peptider. En andel av
13C
6-Arg ble omdannet til
13C
5-Pro fører til en reduksjon i intensiteten av det isotop-merkede peptid topp; dette ble korrigert for alle peptider som inneholder ett eller flere prolinrester ved å legge intensiteten funnet med peptid inneholdende
13C
6-Arg
13C
5-Pro eller
13C
6 -Lys
13C
5-Pro til intensiteten av toppen inneholdende bare
13C
6-Arg eller
13C
6-Lys. En kombinert liste av proteiner identifisert i alle forsøkene ble kondensert ved 80% homologi med ProteinCenter programvarepakken (Proxeon Bioinformatikk AS, Odense, Danmark) for å fjerne overflødige IDer som menneske ortologe sekvenser, redundante databaseoppføringer og utvisket isoformer basert på observerte peptid dekningen. Subcellulære lokalisering og funksjonelle prosesser av proteiner identifisert ved SILAC ble tildelt basert på biologisk kunnskap tilgjengelig i Gene Ontologi (GO) merknader. Oppfinnsomhet Pathway (IPA) programvare ble også brukt til å gi innsikt i biologiske nettverk [33], [34].
3. Gene Expression Profilering med oligonukleotid Arrays
RNA ekstraksjon.
Total RNA ble isolert ved hjelp TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, California) etterfulgt av RNeasy rensing. RNA kvalitet ble evaluert basert på 260:280 prosenter av absorbans og integritet ble kontrollert ved gel elektroforese med 2100 Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, California) [32], [34].
Gene arrays.
Komplementær DNA ble syntetisert ved
in vitro
transkripsjon fra 1,5 ug av det totale RNA ble renset ved anvendelse av en T7-oligo (dT) primer promotoren Assay (Affymetrix, Santa Clara, CA), merket med biotinylert nukleotider (Enzo Biochem, Farmingdale, New York), og hybridiserte å teste GeneChips (Affymetrix), for å vurdere prøven kvalitet før hybridisere på de U133A menneskelige GeneChips inneholder 22,283 sonder som representerer kjente gener og uttrykk sekvens koder (Affymetrix) [34].
analyse av data.
Skannede bildefiler ble visuelt inspisert for gjenstander og analysert ved hjelp av Affymetrix Microarray Suite 5.0 (MAS 5.0). Differensial uttrykk ble evaluert ved bruk av signal som hoved respons tiltaket hentet for hvert gen i hver prøve, som bestemmes av standardinnstillingene for MAS 5.0. Korrelasjoner mellom gen- og protein forhold ble analysert ved hjelp av Kendall tau test. Å sammenligne SILAC og oligonukleotid arrays resultater, ble den kumulative sannsynligheten for forventede og observerte resultater representert over området differensial uttrykk forholdstall.
4. Validering av immunoblotting
Total-protein ble ekstrahert fra blærecancerceller ved hjelp av RIPA-lyseringsbuffer og kvantifisert med Bradford-analysen ved bruk av BSA som standard (Protein Assay, Bio-Rad, Hercules, CA). Total proteinekstrakter (50 ug) ble blandet med 5 x SDS-prøvebuffer (62,5 mM Tris-HCl [pH 6,8], 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-merkaptoetanol, 0,005% bromfenolblått) og løses ved hjelp av SDS-PAGE på 10 % akrylamid geler. Proteiner ble elektrooverført på PVDF membraner (Millipore, Bedford, MC) og aktivering med metanol. Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig tørrmelk i PBS og 0,1% Tween-20 i 1 time ved romtemperatur og inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer mot: Annexin2 (39 kDa, mus, 1:2000, # 610068 , BD Transduction Laboratories, San José, CA USA), Bcas2 (26 kDa, mus, 1:6000, # H00010286-M01, Abnova, Heidelberg, Tyskland), L-Caldesmon (80kDa, mus, 1:100, # C56520, BD Transduction Laboratories), calreticulin (48 kDa, kanin, 1:5000, # C4606, Sigma, St. Louis, MO, USA), Caveolin1 (20-22 kDa, mus, 1:100, # C37120, BD Transduction Laboratories) , cdc2 (34 kDa, kanin, 1:1000, # sc-954, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), CD44 (80 kDa, mus, 01:50, # NCL-CD44v3, Novocastra, Wetzlar, Tyskland) , Copine3 (38 kDa, kanin, 1:100, vennlig levert av Dr. Piris, som ligger på CNIO, Madrid, Spania), Cul3 (89 kDa, kanin, 1:100, # RB1575PCS, NeoMarkers, Fremont, CA, USA) , Cytokeratin18 (48 kDa, mus, 1:100, # IF14, Oncogene-Merck, Darmstadt, Tyskland), DDX21 (87 kDa, kanin, 1:3500, # 10528-1-AP, Proteintech, USA), DNMT1 (183 kDa, mus, 1:100, # IMG-261, IMGENEX, San Diego, CA, USA), Dynactin p50 (44 kDa, mus, 1:100, # D74620, BD Transduction Laboratories), dynamin (mus, 97 kDa, 1:5000, # D25520, BD Transduction Laboratories,), EGFR (175 kDa, mus, 1:100, # GRO1, Oncogene-Merck), ezrin (80 kDa, mus, 1:7000, # E8897, Sigma), Filamin A (250 kDa, mus, 01:50, # NCL-FIL, Novocastra, UK), gelsolin (47 kDa, mus, 1:100, # G4896, Sigma), HSP70 (70 kDa, mus, 1:200, # SC-66048, Santa Cruz), importin 9 (116 kDa, geit, 1:100, sc-103567, Santa Cruz), MCM6 (92 kDa, kanin, 1:200, vennlig levert av Dr. Mendez, som ligger på CNIO, Madrid, Spania), MAPK-4 (65 kDa, kanin, 1:1000, sc-68169, Santa Cruz), Moesin (68-77 kDa, mus, 01:50, # MS-727-P0, NeoMarkers), MSH6 (152 kDa, mus, 1:200, # 610918, BD transduksjon Laboratories), Nucleophosmin /B23 (32kDa, mus, 1:5000, # 18-7288, Zymed, SF, CA, USA), NUP133 (133 kDa, mus , 1:500, # SC-101290, Santa Cruz), Rab14 (23 kDa, kanin, 1:100, # PRO-873, Avivasybio, San Diego, CA), RCC1 (44 kDa, geit, 1:300, # SC-1161, Santa Cruz), VDAC (30 kDa, kanin, 1:100, # 4866, Cell Signaling, Beverly, MA). Blottene ble vasket i PBS og 0,1% Tween-20 og inkubert med pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved værelsestemperatur: anti-mus (1:1000), anti-kanin (1:2000) og anti-geit ( 1:2000, alt Dako, Glostrup, Danmark). Antistoffbinding ble visualisert ved hjelp av en forsterket kjemiluminescerende immunoblotting deteksjonssystem (ECL, GE Healthcare). a-tubulin (50 kDa, mus, 1:4000, # T5168, Sigma) ble anvendt som laste- og normaliseringskontroll. Immunoblotter ble skannet og analysert ved hjelp av ImageJ1.43u programvare (Wayne Rasband, National Institute of Health).
5. Klinisk evaluering av uttrykk for metastaser relaterte biomarkører
Vevsprøver og mikromatriser.
Sju skreddersydde blærekreftmicroarray ble bygget på tumormarkører konsernet inkludert tre eksemplarer eller quadriplicate kjerner (1,0 mm) av primære blære svulster (n = 284) etter randomiserte design. Parafininnstøpte svulster for vev rekke bygging ble samlet inn og behandlet anonymt følgende etiske og juridiske beskyttelse retningslinjene for mennesker etter skriftlig samtykke godkjenning og Institutional Review Board (IRB) godkjente protokoller tilsvarende forskningsprosjektet SAF2009-13035 ved samarbeidende institusjoner: Fundacio Puigvert og Hospital Central de Asturias. Demografisk informasjon indikerte tilstedeværelsen av 251 menn og 33 kvinner, med en median alder på 66,0 år (spredning: 25-81). Tumorstadium fordeling var: PT1 (n = 87), pT2 (n = 121), pT3 (n = 48) og pT4 (n = 28), og tumor karakter fordeling var: lav grad (n = 58) og høy- Karakter (n = 226), definert i henhold til konsensuskriteriene [35]. To av disse microarray inkludert et sett med 71 muskel-invasiv (pT2 +) høy klasse TCC blæren svulster med kjent lymfeknute metastatisk status (N0 = 37, N + = 34). Clinicopathologic og kommenterte oppfølgingsinformasjons tillatt sammenslutninger av Cul3 med histopatologi og utfall.
Immunohistochemistry.
Protein uttrykk for Cul3 ble vurdert ved immunhistokjemi på microarray for hjelp avidin-biotin immunoperoxidase prosedyrer. Antigen gjenfinning (0,01% sitronsyre i 15 minutter under mikrobølge) ble anvendt før inkubering over natten ved 4 ° C med den Cul3 kanin-antistoff anvendes i immunblotting (1:300 fortynning). Antistoff binding ble oppdaget med en biotinylert geit anti-kanin sekundært antistoff (1:1000, Vector Laboratories). Fravær av primært antistoff ble anvendt som negativ kontroll. Testikler ble benyttet som positiv kontroll. Diaminobenzidine ble benyttet som det endelige kromogen og hematoxylin som atom counterstain [32] -.. [34]
Statistical Analysis
Midler av funn fra to uavhengige observatører av alle kjerner fra hver tumorprøve klædd ble brukt for statistiske analyser. Sammenslutninger av Cul3 uttrykk ved immunhistokjemi med histopathologic scenen og tumor grad ble vurdert ved hjelp av ikke-para Wilcoxon-Mann-Whitney og Kruskall-Wallis tester [36]. Cul3 ekspresjon ble evaluert som en kontinuerlig variabel basert på antall celler som uttrykker proteinet i kjernen. Intensiteten av fargingen ble kategorisert som negativ (-) til lav (+), intermediat (++) og høy (+++). I tillegg til det intracellulære lokalisering, ble det også undersøkt hvorvidt proteinet var til stede eller ikke i den ekstracellulære matriks som omgir neoplastiske celler. Cul3 cut-off-nivået for prognostisk evaluering ble valgt på basis av medianverdiene uttrykk blant grupper under analysene. Association of Cul3 med sykdomsspesifikk overlevelse ble evaluert ved bruk av log-rank test i tilfeller med tilgjengelige oppfølging. Sykdomsspesifikk Overlevelsestiden ble definert som månedene har gått mellom transuretral reseksjon eller cystektomi og død som et resultat av sykdom (eller den siste oppfølging dato). Pasienter i live i siste oppfølging eller tapt for oppfølging ble sensurert. Overlevelseskurver ble plottet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden [36]. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS statistikkpakke (versjon 17.0).
Resultater
Funksjonelle analyser
in vitro
Flere aggressivitet aspekter av T24-T24T celler ble først analysert. T24T hadde betydelige høyere spredning priser enn T24 på fire tidspunkter studert (p 0,05, Figur 1a). Invasion analyser indikerte at T24 var i gjennomsnitt 50% mindre invasiv enn T24T celler på 48t (Figur 1b). Sårheling analyser avdekket betydelig raskere migrasjonsrate for T24T (figur 1C). I
n vitro
analyser antydet at T24T cellene hadde mer aggressive fenotyper.
Endringer i protein overflod mellom T24 og T24T celler ved hjelp SILAC
Totalt 1830 proteiner ble identifisert i de to SILAC eksperimenter, der 831 ble samtidig identifisert i både paralleller og bestått de kriterier som er fastsatt for protein kvantifisering. Den samlede falsk funn satsen var 2,1% blir beregnet av antall treff mot den omvendte rekkefølge /totalt antall hits (p 0,01). Den midlere relative standardavvik (SD) av forholdene oppnådd fra replikater var 0,24, noe som indikerer god overensstemmelse mellom eksperimentene.
Angå SILAC forhold fordeling, de fleste av proteinene identifisert var innenfor SILAC forholdsområde mellom 1,5 og 0,67, som forventet når analysere nært beslektede cellelinjer i en 01:01 proteinblanding (figur 2A). Ved å bruke 1,5 som terskelforholdet, ble 289-proteiner uttrykt forskjellig mellom de to cellelinjer, 88 som var mer tallrike i T24T. Blant de 289 differensielt uttrykte proteiner (tabell S1), Tabell 1 inneholder de proteiner som tidligere knyttet til blærekreft metastaser, og dem som er validert ved immunoblotting. Den fullstendige listen over proteiner identifisert i begge replikater (n = 831) ved hjelp SILAC er i tabell S2.
Proteiner ble sortert og plottet ved SILAC forholdet. Som forventet for en 01:01 blanding, de fleste proteiner viste en SILAC forhold innenfor 1,5 og 0,67 tidsavgrensninger. Klassifisering av proteinene identifisert basert på deres funksjonelle anmerkninger ved å bruke Gene ontologi: B) Molecular funksjon, C) Biologiske prosesser og D) cellulære komponenter. Disse analysene ble utført med 289 proteiner som finnes for å bli uttrykt forskjellig. Når mer enn én oppgave var tilgjengelig for et gitt protein, ble alle de funksjonelle merknader vurderes i analysene. Disse klassifiseringene var overflødig (over 100%) som proteiner kunne anmerkes i mer enn én oppgave.
Funksjonell klassifisering av proteiner identifisert
Den funksjonelle annotering av 289 ulikt uttrykte proteiner i T24 og T24T celler ble opprinnelig tildelt bruker Protein Center-programvaren. Tre hovedtyper av merknader ble oppnådd fra GO-konsortiet webside: cellulære komponenter, molekylær funksjon, og biologiske prosesser (figur 2B, C, D). En GOslim tilnærming definert spesielt for ProteinCenter redusert flere GO merknader til en overkommelig sett av ca 20 høyt nivå termer som ble brukt til å filtrere informasjon i prosentberegninger. De viktigste molekylære funksjoner som hører til proteinbinding (78%) eller katalytisk aktivitet (67%). Metabolske prosesser (84%) og cellulære organisasjon og biogenesis (54%) var hyppig biologiske prosesser. Protein merknad distribusjon støttet
in vitro
funksjonelle analysene beskrevet ovenfor knytte mobil omorganisering med migrasjon og invasjon fenotyper (figur 1). Et høyt antall av proteiner lokalisert i cytoplasma (87%) ble funnet i forhold til kjernen (48%). Denne observasjonen førte oss til å fokusere på proteiner som kan spille en relevant rolle i cytoskeletal omorganisering og aggressive fenotype av T24T.
Sammenligning av gen- og protein expression ratios
SILAC protein expression forhold ble sammenlignet med mRNA uttrykk levert av oligonukleotid mikromatriser for kandidatene identifisert av begge metoder (n = 438) (Tabell 1, Tabell S3). En positiv korrelasjonskoeffisient (Kendalls tau) på 0,206 (p 0,0005) ble oppnådd (figur S1 A). Viktigere, median SILAC protein uttrykk forholdet var 0,98 for disse kandidatene (spredning: 0,16 til 9,44), som var lik median på 1,02 observert for oligonukleotid arrays (spredning: 0,01 til 100,80). Eksklusive to uteliggere oppdages av begge teknikkene økt korrelasjonskoeffisienten til 0.210 (p 0,0005, N = 438: Figur S1B). Å tolke forskjellene mellom forventet og de observerte sammenhenger mellom RNA og protein uttrykk, var den kumulative sannsynligheten for det observerte forholdet for differensial uttrykk representert mot forventede forholdet for begge teknikkene (figur S1C, D). Tallene fremhevet større områder av differensial uttrykk observert i oligonukleotid arrays sammenlignet med de samme kandidatene i SILAC analyser.
Validering av SILAC identifisert kandidater ved hjelp av immunoblotting
For å validere SILAC uttrykk prosenter av proteiner identifisert i begge replikater ble immunoblotting utført (figur 3). Økt ekspresjon i T24T ble observert for gelsolin, Cul3, importins, nucleoporins og EGFR, og redusert ekspresjon ble funnet for ezrin, moesin, filamin, caveolin eller CD44, blant andre. Immunoblotter ble kvantifisert å korrelere med uttrykksforhold som oppnås ved SILAC og i genet arrays. Basert på den gode avtalen av disse observasjonene for Cul3, et protein som er kjent for å være involvert i ubiquitinering og påfølgende nedbrytning av target proteiner, ble det valgt for videre analyser til: a) vurdere sin kliniske relevansen som en biomarkør kandidat til å vurdere aggressiv klinisk atferd og b) for å evaluere Cul3 innvirkning på aggressiv fenotype av T24T og ved å modulere ekspresjon av andre differensielt uttrykte proteiner identifisert ved SILAC. Figur S2 viste ytterligere kontroll og godkjenning av immunoblot av kandidater forskjellig uttrykt i T24T celler i oligonukleotid arrays som ikke ble kvantifisert ved SILAC, og
vice versa
, som antistoffer var tilgjengelig. Vi observerte ikke store forskjeller i eksperimentelle molekylvekt i forhold til anslåtte størrelser.
(A) Validering av SILAC resultatene av utvalgte proteiner i immunoblotter av proteinekstrakter fra blæren kreftceller analysert. Resultatene validert uttrykket nivåer av proteiner identifisert av proteomikk tilnærmingen, herunder differensiert og ikke-forskjellig uttrykt kandidater. Antistoffer som viser en enkelt dominerende bånd ved de forventede molekylvekter ble tillatt: og α-tubulin, ble anvendt som kontroll lasting. GSN, gelsolin; Cul3, Cullin 3; IPO9. Importin 9; EGFR, epidermal vekstfaktor reseptor; NUP133, Nucleoporin 133; HSP70, Heat Shock Protein 70kDa; MCM6, Minichromosome Vedlikehold Complex Komponent 6; RCC1, Regulator av kromosom Kondens 1; BCAS2, brystkreft Amplified Sequence 2; DNM, dynamin; NPM, Nucleophosmin; DCTN, Dynactin; CALR, Calreticulin; MAPK, mitogenaktiverte Protein Kinase; DDX21, DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) boksen polypeptid 21; CDC2: Celledeling Cycle 2; DNMT1, DNA (cytosin-5) metyltransferase 1; MSH6, muts homolog 6; RAB14, GTPase Rab14; VDAC, spenningsavhengig Anion Channel; CK18, Cytokeratin 18; Cald, Caldesmon; CD44, CD44 antigenet isoformen en forløper 2; Esr, ezrin; MSN, Moesin; ANXA2, Annexin A2; CPNE3, Copine 3; FLNA, Filamin A;
