Abstract
Thiazole antibiotika, Thiostrepton ble nylig identifisert som proteasominhibitor. Vi undersøkte terapeutiske potensialet av kombinasjonen av tiostrepton og proteasom-inhibitoren bortezomib (VELCADE) på forskjellige humane tumorcellelinjer. Kombinasjon av subletale konsentrasjoner av tiostrepton og bortezomib indusert potent apoptose og inhibisjon av langsiktig kolonidannelse i et bredt spekter av humane kreftcellelinjer. Den synergistisk forhold mellom tiostrepton og bortezomib Kombinasjonen ble også demonstrert ved å beregne kvantitativt sine kombinasjon indeksverdier som var mye lavere enn en på alle undersøkte cellelinjer. Synergien mellom disse stoffene var basert på deres proteasomer hemmende aktiviteter, fordi Thiostrepton modifikasjon, Thiostrepton methyl ester, som ikke har intakt quinaldic syre ring og hemmet ikke proteasome aktivitet ikke klarte å påvise noen synergi i kombinasjon med bortezomib.
Citation: Pandit B, Gartel AL (2011) Thiazole Antibiotika Thiostrepton synergize med bortezomib å indusere apoptose i kreftceller. PLoS ONE 6 (2): e17110. doi: 10,1371 /journal.pone.0017110
Redaktør: Joseph Bauer Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 30 september 2010; Godkjent: 20 januar 2011; Publisert: 18 februar 2011
Copyright: © 2011 Pandit, Gartel. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var levert av National Institutes of Health gir 1RO1CA1294414 og 1R21CA134615 (AL Gartel). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kombinasjonen av målrettede narkotika /agenter har fått en konsensus som en levedyktig potensiell strategi for behandling av kreft. Behandling med en kombinasjon av midler som er rettet mot nøkkel cellulær mekanisme eller proteiner kritiske for ulike kreftformer blir undersøkt mot en rekke svulster. Kombinasjon av legemidler tillater deres bruk ved subtoxic konsentrasjoner og reduserer sannsynligheten for utvikling av resistente kreftceller.
proteosomet er et proteinkompleks som er rettet mot ubiquitin-merkede proteiner for nedbrytning i en ATP-avhengig måte. Nylige fremskritt i forståelsen av mekanismene for proteasome aktivitet førte til utviklingen av proteasomhemmere som effektive legemidler mot kreft hos mennesker [1]. Siden visse typer kreft er avhengige av en funksjonell proteasomet for vekst, vil inhibering av proteasomet aktivitet selektivt å drepe disse tumorene. Bortezomib (VELCADE) er ett av den første i klasse proteasomhemmere som inhiberer 26S-proteasomet ved binding til N-terminale treoninrester i det aktive sete av proteasome katalytiske regionen. Den er godkjent for klinisk bruk i tilfeller av tilbakefall myelomatose, men har vist liten eller ingen aktivitet for behandling av solide svulster som monoterapi. Men ved å hemme proteasome sti og påfølgende effekten av viktige veier, viser bortezomib synergistisk forhold når det kombineres med andre anti-kreft narkotika og forsterker effekten av legemidler mot kreft.
I våre tidligere undersøkelser vi vist at tiazol antibiotika Siomycin A og tiostrepton indusere apoptose i humane kreftceller [2], [3] og virke som proteasomhemmere [4]. Det er vist før den kombinasjon av to proteasomhemmere laktacystin og MG132 synergized mot prostata kreftceller in vitro [5]. I tillegg synergi ble demonstrert ved å kombinere bortezomib med curcumin (som demonstrerer proteasomal inhiberende aktivitet i tillegg til andre virkninger) mot multiple myelomceller [6]. Tilsvarende har vi vist at kombinasjonen av Thiostrepton og bortezomib viste sterk synergi mot prostatakreft [7]. I denne studien fikk vi bekreftet at samtidig behandling av forskjellige tumorcellelinjer av ulik opprinnelse med subletale konsentrasjoner av proteasomhemmere Thiostrepton og bortezomib avslører en sterk synergi som demonstrert ved induksjon av apoptose, kombinasjon indeksverdier og langsiktig klonogene analysen.
Resultater og diskusjon
Vi viste tidligere at proteasominhibitor Thiostrepton hemmet veksten av ulike kreftcellelinjer med IC
50 verdier av (1-5 mikrometer /L) og induserte apoptose [2 ], [3]. Effekt er blitt demonstrert å hemme levedyktigheten til tumorcellelinjer med IC
50 verdi på 10-100 nM /L. For å bestemme hvorvidt tiostrepton kan virke synergistisk med bortezomib mot humane kreftcellelinjer av forskjellig opprinnelse vi behandlet av flere humane cancer-cellelinjer med enten sub-apoptotiske konsentrasjoner på tiostrepton eller bortezomib alene eller med kombinasjonen av de to i 24 timer og anvendt caspase-3 for å tjene som en indikator på apoptotisk celledød (figur 1). Mens behandling med tiostrepton eller bortezomib alene induserte lite eller ingen caspase-3 spalting i disse celler, behandling med kombinasjonen av disse legemidlene viste potent caspase-3-spalting i U2OS-C3 osteosarkom, MiaPaca-2 bukspyttkjertel, PA-1 eggstokkreft, HCT116 tykktarm og MDA-MB-231 brystcancerceller (figur 1), og nivåer av apoptose inverst korrelert med FoxM1 uttrykket (fig S1). Siden vi etablerte tidligere synergi mellom bortezomib og Thiostrepton i prostatakreftceller [7], våre nåværende data tyder på at denne effekten kan ha generell betydning for kreftbehandling.
A. Osteosarkom, U2OS-C3, B. MiaPaca-2 bukspyttkjertel, C. PA-1 eggstokkene, D. HCT-116 kolon, E. MDA-MB-231 brystkreft celler ble behandlet med sub-apoptotiske konsentrasjoner av Thiostrepton, bortezomib eller begge deler som vist i 24 timer, ble totale cellelysater trukket ut og immunoblottet med antistoffer for kløyvde caspase-3 og β-aktin.
for ytterligere å demonstrere at kombinasjonsbehandling av Thiostrepton og bortezomib induserer synergistisk apoptose, vi farget disse cellene (DMSO behandles, tiostrepton behandles, bortezomib behandlet og behandles sammen med de to legemidlene) med annexin V-PE /7AAD og analysert dem ved strømningscytometri. Som vist i figur 2A, behandling av HCT-116-celler med 0,75 uM tiostrepton eller 10 nM bortezomib indusert apoptose av bare 6,1% og 6,9% i forhold til kontrollen, mens behandling med begge legemidler ved de samme doser som forårsaket 35,2% av cellene til å gjennomgå apoptose . Lignende synergistisk effekt av Thiostrepton /bortezomib kombinasjonen ble observert av annexin-VPN-7AAD flekker i MDA-MB231 bryst og MiaPaca-2 kreft i bukspyttkjertelen celler (figur 2B og C).
A. HCT-116, tykktarm, B. MDA-MB-231, bryst og C. MiaPaca-2, kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med sub-apoptotiske konsentrasjoner av Thiostrepton, bortezomib og Thiostrepton /bortezomib kombinasjon for 24 timer, farget med AnnexinV-PE og 7-AAD og analysert ved flowcytometri.
for å kvantitativt validere synergistiske natur samspillet mellom Thiostrepton og bortezomib, undersøkte vi celleviabilitet etter enkle og kombinasjons medikamentell behandling ved hjelp av Chou-Talalay median effekten ligning fremgangsmåten [8]. CI-verdier under 1 indikerer en synergistisk anti-proliferativ effekt, og CI områdeverdier for de kombinerte behandlinger med Thiostrepton /bortezomib i HCT-116, Mia-Paca-2, MDA-MB231 og PA-1 humane kreftcellelinjer var 0,1 til 0,8 (figur 3A, B, C, D) for fraksjonert virkning som tilsvarer 0,3 til 0,9, noe som tyder på en sterk synergistisk effekt. De langsiktige effektene av kombinasjonsbehandling med Thiostrepton og bortezomib ble vurdert av klonogene analysen. Vi fant at kolonidannelse i HCT-116 colon og MDA-MB 231 brystkreft celler ble behandlet med kombinasjoner av disse stoffene i 24 timer ble undertrykket 5- til 10 ganger (figur 4A og B).
Kombinasjonsindeks diagram for Thiostrepton /bortezomib legemiddelkombinasjonen ble plottet med CI på y-aksen og brøk effekt (FI) på x-aksen. Prosent hemming av proliferasjon ble bestemt etter behandling med monoterapi eller Thiostrepton /bortezomib kombinasjon. Kombinasjon indeks (CI) verdiene av de to agentene plottet for HCT-116 (A), Miapaca-2 (B), MDA-MB231 (C) og PA-1 eggstokkreft celler (D).
A. Klonogene analyse av HCT-116 celler behandlet med DMSO eller Thiostrepton /bortezomib kombinasjon for 24 timer som detaljert; et fotografi av petriskåler i et representativt eksperiment er vist. B. klonogene analyse av MDA-MB231 celler behandlet med DMSO eller Thiostrepton /bortezomib kombinasjoner i 24 timer.
Etter demonstrasjon av synergi mellom Thiostrepton og bortezomib kombinasjon, betydningen av proteasomal hemmende aktivitet av Thiostrepton utnyttes i kombinasjonen ble undersøkt. Aktiviteten av kombinasjonen av tiostrepton-metylester (åpen ring inaktive strukturell analog av tiostrepton) og bortezomib kombinasjoner ble sammenlignet med tiostrepton og bortezomib. Det ble demonstrert tidligere som en intakt quinaldic syre makrocyklus ring i tiostrepton er nødvendig for proteasom-inhiberende aktivitet av antibiotika tiazol [9]. Fravær av denne ring eller nærvær av en åpen ring gjengis molekylet inaktive [10]. I motsetning til kombinasjonen av tiostrepton /bortezomib, bortezomib og tiostrepton metylester mislyktes i å demonstrere induksjon av apoptose, noe som bekrefter betydningen av proteasomet inhiberende aktivitet av tiostrepton anvendes i legemiddelkombinasjonen (figur 5). Noen studier har vist en synergi ved samtidig behandling med proteasomhemmere, laktacystin og MG132 [5], botezomib og curcumin [6] mot kreft. I denne studien ved bruk av forskjellige metoder rapporterer vi at tiostrepton synergizes med bortezomib ved samtidig behandling med subletale konsentrasjoner av de to midlene, noe som tyder på at kombinasjonen av to proteasomhemmere for å være av potensiell verdi som en generell strategi mot kreft.
Behandling med kombinasjonen av tiostrepton /bortezomib resulterer i opptreden av sub-G
0 topp som reduserer fluorescensintensiteten i HCT-116-celler, i motsetning til ubehandlede kontrollceller på grunn av fragmentering av kromatin. Skiftet av FI var sammenlignbar med den positive kontrollen i settet (Staurosporin, data ikke vist). Thiostrepton-methyl ester med åpen B ring påvirker ikke fluorescens intensitet i motsetning til ubehandlede (kontroll) celler.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
U2OS-C3 osteosarkom, HCT116 tykktarm, PA1 eggstokkreft og MiaPaca-2 kreft i bukspyttkjertelen celler ble dyrket i DMEM medium (Invitrogen). MDA-MB231-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Invitrogen). Mediene ble supplert med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals) og 1% penicillin-streptomycin (GIBCO), og cellene ble holdt ved 37 ° C i 5% CO
2. Cellelinjer ble testet for mykoplasmaforurensning ved hjelp av MycoAlert Mycoplasma deteksjonssett (Lonza Rockland) og ble funnet å være negative. Thiostrepton ble kjøpt fra Sigma, bortezomib ble vennlig levert av Millennium legemidler /Takeda. Åpen ring analog av Thiostrepton, Thiostrepton metylester vennlig levert av legene. Walsh og Bowers (Harvard University).
Kombinasjons indeksen analysen
MTT analysen ble utført for å måle levedyktighet av celler etter behandling med enkle midler eller kombinasjon av Thiostrepton og bortezomib. Hvert forsøk involvert behandling med ulike konsentrasjoner av Thiostrepton, bortezomib, kombinasjon av Thiostrepton og bortezomib og ikke medikamentell behandling. I tillegg ble de høyeste konsentrasjonene av tiostrepton, bortezomib og medikamentkombinasjonen ble testet i fravær av celler og viste ikke noen interferens med de MTT analysereagensene.
3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl- ) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble anskaffet fra Sigma. Celler ble sådd ut i en tetthet på 1 x 10
4 per brønn i 200 ul av fullstendig kulturmedium og behandlet med tiostrepton alene, bortezomib alene og kombinasjonen av tiostrepton og bortezomib i 96-brønners mikroplater titer. Etter inkubasjon i 72 timer ved 37 ° C i en fuktet inkubator, 10 ul MTT (5 mg /ml i PBS) ble tilsatt til hver brønn, hvoretter platen ble sentrifugert kort. Etter nøye fjerning av medium, ble 0,1 ml bufret DMSO tilsatt til hver brønn. Absorbansen ble registrert på en mikroplateavleser ved en bølgelengde på 540 nm. I våre eksperimenter IC
30, IC
50, IC
70, IC
80, og IC
90-verdiene (dvs. til den legemiddelkonsentrasjonen som trengs forårsake 30%, 50% , 70%, 80% og 90% reduksjon i celleviabilitet) ble valgt for sammenligning.
for å evaluere effekten av kombinasjonsbehandlingen med tiostrepton og bortezomib, kombinasjonsindeksen (CI) isobologram fremgangsmåte ifølge Chou og Talalay ble brukt [8]. Denne metoden innebærer å plotte dose-effektkurver for hver agent og kombinasjoner i flere utvannet konsentrasjoner ved hjelp av median-effekt ligningen og kombinasjonen indeksen ligningen. Kombinasjon indeksverdier på 1, 1, og 1 indikerer en additiv effekt, synergisme, og antagonisme, henholdsvis. Kombinasjonen indeksverdier ble bestemt ved forskjellige effektnivåer, og isobologrammer plottet.
Påvisning av apoptose
AnnexinV-PE flekker kit (Roche Diagnostic Corp.) ble brukt for påvisning av apoptotiske organene som følger leverandørens protokollen. Dette settet benytter en to-fargeprotokoll hvor cellene viser fluorescens av Annexin V (apoptotiske celler) og fluorescens av 7AAD (nekrotiske celler eller slutten av apoptotiske celler). I korthet tumorcellene ble dyrket ved en tetthet på 50% konfluens på 100 mm kulturskåler og ble behandlet med varierende konsentrasjoner av legemidlene i 24 timer. Cellene ble trypsinert, vasket med PBS, og ble bearbeidet for merking med annexinV-7AAD. De merkede celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri.
Immunoblotting
aktivt delende celler ble sådd ut på en 100 mm plate ved en tetthet på 7,5 x 10
5 celler. Celler ble behandlet med bortezomib alene, tiostrepton alene og kombinasjonen av tiostrepton og bortezomib i 24 timer hvoretter cellene ble lysert. Celler ble lysert i IP-buffer (20 mM HEPES, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM Na
4P
2o
7, 1 mM natriumortovanadat, ble 0,2 mM PMSF supplert med protease inhibitor tablett (Roche Applied Sciences) og proteinkonsentrasjonen bestemt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse reagens. Femti mikrogram cellelysatene ble separert ved elektroforese på SDS-polyakrylamid-mini-gel og overført til PVDF membran. Immunoblotting ble utført med spesifikke antistoffer for kløyvde caspase-3 (9664 cellesignalisering), FoxM1 (gaver fra Dr. Costas lab) og β-aktin (A5441, Sigma).
kjerne- ID Grønn Chromatin Kondens deteksjon
Celler ble farget ved hjelp av
in vitro
apoptose deteksjon kit (Cat # ENZ-51021-K200 Enzo Life Sciences), i henhold til produsentens anbefalinger. Kort 3-4 × 10
5-celler ble sådd ut på 60 mm kulturskåler og tillatt å vokse over natten. celler ble behandlet med subletale konsentrasjoner av tiostrepton, bortezomib eller tiostrepton-metylester eller en kombinasjon av tiostrepton og bortezomib og tiostrepton-metylester og bortezomib. Etter natten inkubasjon av narkotika celler ble trypsinert og sendt inn for flowcytometri analyse. Analysen ble utført ved hjelp av en FL-kanal for strømningscytometer med eksitasjonsbølgelengde på 488 nM. Staurosporin, i settet ble brukt som en positiv kontroll.
klonogene overlevelse analyse
HCT-116 og MDA-MB231 celler ble platet og mellomplater på 3 × 10
5 celler samløpet og behandlet med kombinasjon av Thiostrepton og bortezomib i 24 timer. Cellene ble så trypsinert, re-suspendert i media og telles. Cellene ble sådd ut på nytt (750 celler pr medium plate) og inkubert i 10 dager. Frisk media ble lagt på den femte dagen. På den tiende dag ble mediet fjernet fra skålene og vasket en gang med iskald PBS. Koloniene ble farget med 2 ml hver av 0,25% 1, 9-dimetyl-metylenblått i 50% etanol i 45 minutter på en gyngende plattform. Rettene ble skylt tre ganger med PBS og lufttørket, og koloniene ble telt.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført med Microsoft Excel ved hjelp av Student
t
test.
P
verdier av 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
relative nivåer av FoxM1 kan påvirke følsomheten til Thiostrepton /bortezomib kombinasjonsbehandling i humane kreftceller. U2OS-C3 osteosarkom og MIA PACA-2 kreft i bukspyttkjertelen celler ble behandlet med DMSO eller indikerte konsentrasjoner av tiostrepton og borteozomib sammen i 24 timer. Cellelysater ble immunblottet for FoxM1, kløyvde caspase-3 og β-actin som lasting kontroll
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0017110.s001 plakater (TIF)
Takk
Vi ønsker å takke Dr. Albert Bowers og Dr. Christopher Walsh for bes gi Thiostrepton methyl ester brukt i denne artikkelen.
