Abstract
Kreftceller kan få sin evne til å invadere og metastasise ved gjennomgår epithelial-til-mesenchymale overgang ( EMT). Utnyttelse denne mekanismen av mobilnettet plastisitet, kan ondartede celler fornye sin aktin cytoskjelettet og ned-regulere proteiner som trengs for celle-celle kontakter. Mekanismene for cytoskeletal omorganisering som resulterer i mesenchymale morfologi og økt invasiv potensial er dårlig forstått. Actin kjerne formins har vært innblandet som sentrale aktører i EMT. Her, analyserte vi som formins endres i plateepitelkarsinom relatert EMT. FHOD1, en dårlig studert formin, syntes å være markert oppregulert på EMT. I menneskelige vev FHOD1 var først og fremst uttrykt i mesenchymalceller, med lite uttrykk i epitel. Men prøver fra muntlige plateepitelkreft kreft demonstrert konsistent FHOD1 oppregulering i mesenchymally transformerte celler ved invasiv kanten. Dette oppregulering ble bekreftet i en muntlig plateepitel karsinom modell, der FHOD1 uttrykk ble markant økt på EMT i et PI3K signaleavhengig måte. I EMT cellene FHOD1 bidratt til spindel-formet morfologi og mesenchymale F-aktin organisasjon. Videre funksjonelle analyser viste at FHOD1 bidrar til celle migrasjon og invasjon. Til slutt, FHOD1 uttømming redusert evne EMT kreftceller til å danne invadopodia og å degradere ekstracellulær matriks. Våre resultater tyder på at FHOD1 deltar i cytoskeletal endringer i EMT. I tillegg viser vi at FHOD1 oppregulering oppstår under kreftcelle EMT
in vivo
, noe som indikerer at FHOD1 kan bidra til tumorprogresjon
Citation. Gardberg M, Kaipio K, Lehtinen L, Mikkonen P, Heuser VD, Talvinen K, et al. (2013) FHOD1, en Formin oppregulert i epithelial-Mesenchymale Transition, Deltar i Cancer Cell migrasjon og invasjon. PLoS ONE 8 (9): e74923. doi: 10,1371 /journal.pone.0074923
Redaktør: Pontus Aspenstrom, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 15. april 2013; Godkjent: 07.08.2013; Publisert: 26.09.2013
Copyright: © 2013 Gardberg et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av midler fra The Academy of Finland, Finska Läkaresällskapet, Sigrid Juselius Foundation, K Albin Johansson Foundation, Den finske Kreft Organisasjoner og Turku universitetssykehus forskningsmidler. Maria Gardberg er en Ph.D. student støttet av National Graduate School of Clinical Investigation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
aktin cytoskjelettet er en svært plast struktur med evne til raskt å renovere på mange ekstra og intracellulære signaler. I epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT), epitelceller dissosiere deres celle-celle kryss, og fornye sitt cytoskjelettet for å danne et spindelformet celle med rikelig spennings fibre. Det faktum at EMT gjør det mulig for cellene å være bevegelig benyttes av epiteliale kreftformer for å oppnå invasivitet. EMT kan induseres både av miljømessige faktorer, så som hypoksi, og ved ekstracellulære signalmolekyler slik som TGF-β. Oppregulering av EMT transkripsjonsfaktorer, inkludert snegle, Slug, ZEB1 og ZEB2, fører til EMT-definerende nedregulering av E-cadherin [1], [2]. Selv om den dramatiske økningen i F-aktin og stress fibre og fibroblast-lignende morfologi er alle kjennetegnene til EMT har aktin kimdannende involvert i denne cytoskeletal ombygging vært dårlig karakterisert.
Formins er høyt konservert aktin kjerne proteiner som er til stede i alle eukaryote organismer. Den formin homologi 2 (FH2) domenet er det definerende elementet i formins. Flankerer regionene varierer betydelig mellom enkelt formin proteiner, sannsynligvis resulterer i ulike cellulære funksjoner og reguleringsmekanismer. Formins katalyserer kjerne av aktin på pigg slutten av aktin filamenter. I forlengelse av dimeriserte formins holde festet til filament, og dermed beskytte den fra skille molekyler [3]. Aktiviteten av formins reguleres av Rho GTPases, molekylære brytere som renovere cytoskjelettet i forskjellige cellulære avdelinger, kontrollere stress fiber sammenstillingen, fokal adhesjonsdannelse og modus av motiliteten i kreftceller [4], [5].
som modulatorer av celle organisasjon, bevegelse og utvikling, formins er gode kandidater i jakten på aktin arrangører som gjør de dype cytoskeletal endringer i EMT. Imidlertid er rollen til formins i EMT ikke kjent i detalj. Ved å bruke en muntlig plateepitelkreft (SCC) EMT-modell, viser vi her at FHOD1, et primært mesenchymally uttrykt formin, er spesielt oppregulert under EMT. I videre studier, viser vi at FHOD1 uttrykkes også
in vivo
på invasiv foran SCC, og at det er nødvendig for vedlikehold av mesenchymale morfologi, effektiv migrasjon og invasjon.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Oral plateepitelkarsinom (SCC) cellelinje UT-SCC-43A ble avledet fra en primær gingival svulst i en 75-år gammel kaukasisk kvinne. Svulsten ble iscenesatt som T
4 N
1 mill
0, og var histologisk en grad 2 SCC [6]. UT-SCC-43B ble avledet fra en tilbakevendende svulst fra samme pasient etter strålebehandling og kirurgi. Cellelinje 43A-SNA har blitt generert ved trans 43A celler med full-lengde hemagglutinin-merket cDNA av muse Snail. De tre cellelinjene er blitt fastslått tidligere, og har tidligere blitt funnet å vise endringer i epitelcelledifferensiering program gjennom ulike mekanismer for E-cadherin undertrykkelse [7]. Før etableringen av både primære cellelinjer UT-SCC-43A og UT-SCC-43B for forskning, godkjenning av komiteens Etikk av Universitetet i Turku og Turku universitetssykehus ble innhentet samt skriftlig samtykke fra donor [ ,,,0],7]. Den telomerase-udødeliggjort menneskelige mikrovaskulær endotelet cellelinje (TIME) og menneskelig dermal microvascular endothelial cellelinje (HMEC) var en slags gave fra MSc Johannes Keuschnigg (Universitetet i Åbo, Turku, Finland, cellelinjer opprinnelig fra ATCC). Andre cellelinjer ble kjøpt fra ATCC og vedlikeholdt i henhold til distributørens instruksjoner.
Transcriptomic microarray data og kvantitativ real-time-PCR
Gene uttrykk ble analysert ved hjelp av Illumina HumanHT-12 v4 Expression BeadChip på den finske Microarray og Sequencing Centre, Turku senter for bioteknologi. Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge produsentens protokoll og bearbeidet til cDNA med cDNA syntesesett (Applied Biosystems, Foster City, CA). Matrisen baserte data på cellelinjer har blitt lastet til ArrayExpress (tiltredelse antall E-mtab-1420).
TaqMan QRT-PCR ble utført med en Applied Biosystems 7900HT instrument (finsk microarray og Sequencing Centre). Prober og primere var fra oliqomer, Helsinki, Finland. Kvantifisering ble utført med RQ leder 1.2-programvaren med ΔΔCT metoden (Applied Biosystems). Tre gjentatte prøver ble undersøkt for påvisning av mål-mRNA-ekspresjon og β-actin anvendt som en endogen kontroll. Mengdene ble uttrykt som en n-ganger forskjell i forhold til UT-SCC-43A cellelinje. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Student
t
-test og Pearsons korrelasjonskoeffisient, med mindre annet er angitt. Gene spesifikke primere var: DIAPH1 (frem 5′-cagtcaggggcagcattc-3 «, reverse 3′-cactgttcttggacaccttgg-5»), FHOD1 (forover 5’cctcagctgacacctccag-3 «, reverse 3′-cagcgcaacctgcttctc-5′), FHOD3 (forover 5»-ggccaggttggaaaggtc-3 «, reverse 3′-tctgctgccagtgactcttg-5′), FMNL3 (forover 5»-ccatcgaggacatcatcaca-3 «, reverse 3′-ccgagagggtctcagtgg-5»).
FHOD1 antistoffer
En FHOD1 kanin anti-human polyklonale monospesifikke antistoff ble produsert av human Protein Atlas program (HPA) [8], og er for tiden tilgjengelig for allmennheten (HPA024468, Atlas antistoffer, Stockholm, Sverige). Videre antistoff karakterisering er beskrevet under resultatene. I noen forsøk ble en annen polyklonalt antistoff FHOD1 (Millipore, Bedford, MA, USA) benyttet. Den reaktivitet av de to antistoffene var identiske i western blotting og immunostainings.
Vest og Nord-blotting av humane cellelinjer
Cellelinjer MDA-MB-231 (brystkreft celler), WM164 (melanom celler), A431 (plateepitelkarsinom celler), U138MG (glioblastom celler), HUVEC (human navlevene endotelceller), HMEC (menneskelig dermal mikrovaskulære endotelceller), tid, UT-SCC-43A, UT-SCC-43B og 43A -SNA ble høstet og lysert i RIPA-buffer supplementert med proteasehemmere. For hvert eksperiment ble prøver ble normalisert for proteinkonsentrasjon og like mengder av materiale i Laemmli prøvebuffer ble utsatt for SDS-PAGE og overført til nitrocellulosefiltre. For immunoblotting HPA anti-FHOD1 antistoff ble inkubert over natten ved 1:2000 fortynning i BSA /TBS /Tween 0,1%, etterfulgt av sekundært antistoff [HRP-konjugert svin-anti-kanin (Dako, Glostrup, Danmark)]. Bundede proteiner ble påvist ved forsterket kjemiluminescens. I peptidet konkurranseeksperiment antistoffet ble først inkubert med et 100-gangers molart overskudd av GST-FHOD1 fusjonsprotein inneholdende de antigene epitoper i 1 time, eller med GST som en kontroll. Protein lasting ble kontrollert av immunblotting med en α-tubulin antistoff (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Epitel /mesenchymale transdifferentation ble sjekket av immunoblotting med anti-E-cadherin og anti N-cadherin antistoffer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
ble utført Northern blot analyse som beskrevet [9]. Sekvensen til proben er inkludert mesteparten av antistoff epitop (NCBI RNA RefSeq klon GenBank NM_013241.2, baser 1517-1810).
Inhibering av MAPK /ERK og PI3K signalveier
UT- SCC-43B-celler ble sådd ut i fullstendig medium og dyrket i 24 timer før mediet ble erstattet med serumfritt medium og inkubert over natt. Deretter ble cellene inkubert i 4 dager i 10 uM MEK 1/2 inhibitor U0126 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) eller PI3 kinase inhibitor LY294002 (Tocris Bioscience, Bristol, UK) i 1% serum medium for U0126 og 10 % serum medium for LY 294002. Kontrollceller celler~~POS=HEADCOMP ble behandlet med samme volum av kjøretøyet. Etter inkubering, ble effekten av MAPK-reaksjonsveien inhibering undersøkt ved immunblotting som beskrevet ovenfor under 1:1000 fortynninger av polyklonalt anti-fosfo-P44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (p-ERK 1/2) (Cell Signaling Technology) og polyklonale anti-ERK 2 (MAPK 2) antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). PI3K veien hemming ble sjekket av immunoblotting med monoklonalt anti-Phospho-Akt (Ser473) (p-Akt), monoklonalt anti-Akt (pan) (begge fra Cell Signaling Technology).
Gene stanse
FHOD1 uttrykk ble midlertidig slått ned i MDA-MB-231, TIME og UT-SCC-43B celler ved hjelp av
SMART
basseng siRNA (Dharmacon Research, Boulder, CA). Ikke-målsøkende Pool siRNA (Dharmacon) ble anvendt som en kontroll. Cellene ble transfektert med Dharmafect 1 (Dharmacon) i henhold til produsentens instruksjoner. FHOD1 nivåer ble undersøkt i cellelysatene 72 timer etter transfeksjon av immunoblotting.
I silico
transcriptomics analyse
GeneSapiens databasen ble benyttet for å studere FHOD1 mRNA uttrykk på tvers av all menneskelig normalt vev [10]. Prøvene som er inkludert i denne databasen har blitt analysert på Affymetrix plattformen og på grunn av unike normaliserings og datakvalitet verifikasjoner, kan genekspresjonsprofiler innsamlet fra ulike studier bli kombinert for å generere en oversikt av uttrykket profilen i humane vev.
Immunohistokjemi
Normal vev ble samlet, med fast og immunhistokjemisk farget som beskrevet [9]. Samlingen av normalt vev for denne studien ble godkjent av Den blandede komité Etikk ved Universitetet i Turku og Turku universitetssykehus samt skriftlig samtykke fra giverne. De 10 parafin innebygde muntlige SCC prøver ble samlet inn fra vevet arkiv av Avdeling for patologi ved Åbo universitetssykehus med godkjenning av Joint Committee Etikk av Universitetet i Turku og Turku Universitetssykehus. Ifølge finsk lovgivning (Lov om bruk av vevsprøver for forskning, [11, 20 §]), tillatelse til å bruke prøver samlet for diagnostiske formål, er gitt av lokale institusjonelle myndigheter i situasjoner der pasientinformasjon ikke er inkludert. Pasienter har ikke blitt godkjent, men tillatelse er gitt av lokale etikkutvalg og medisinsk direktør Turku Universitetssykehus. HPA FHOD1 antistoff ble brukt ved en fortynning 1:250. Individuell vev og celletyper ble evaluert av ledelsen med fargeintensitet med gradering fra 0 (ingen flekker) til +++ (sterk farging).
immunfluorescens mikroskopi og kvantifisering av F-aktin
UT -SCC-43A og UT-SCC-43B-celler ble dyrket på gelatin-belagt Dekk, og festes med 4% paraformaldehyde i 15 min. Cellene ble permeabilised med kald aceton i 4 min. Etter 30 min i 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS, ble cellene inkubert i 1 time med FHOD1 antistoff (1: 250), fulgt av et sekundært antistoff, Alexa 568-konjugert geit-anti-kanin (1:500 , molekylære prober, Eugene, OR, USA). F-aktin ble visualisert med Alexa 488-konjugert phalloidin (molekylære prober). Monterings media inneholdt DAPI for farging kjerner (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Invadopodia ble visualisert ved farging immunofluorescens med anti-cortactin 1:200 (Millipore). Plasmaceller ble identifisert med anti-CD138 mAb (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, USA). Alexa Fluor 568-konjugert geit anti-mus ble anvendt som sekundært antistoff (Molecular Probes). Cellene ble fotografert med immunfluorescens mikroskopi eller en Zeiss LSM 510 Meta konfokal mikroskop (Carl Zeiss, 63 × Plan Apochromat objektiv, Göttingen, Tyskland). Bilde J 1.42q (NIH, USA) programvare ble brukt i bildeanalyser. Kvantifisering av F-aktin i UT-SCC-43B-celler ble gjort ved å analysere Alexa 488-konjugert phalloidin flekker fra confocal bilder av 20 celler fra hvert forsøk. Mean fluorescerende intensiteter ble målt fra cellen cytoplasma. Betydningen av forsøket ble beregnet ved hjelp Studenter uavhengige utvalg
t
-test.
sårtilheling og invasjon analyser
Migrering av UT-SCC-43B celler behandlet med FHOD1 eller ikke-måls sirnas ble studert på gelatin-belagt 24-brønnplater. Et sår ble opprettet av manuelt skrape monolag av celler med en 10 mL pipette tips. Cellene ble vasket med PBS, og ble filtrert medium ble tilsatt. Et bilde av celler som migrerer inn i såret ble tatt ved 10 minutters intervaller i 24 timer. ImageJ programvare ble anvendt for å måle sårområdet ved 1 timers intervaller. Sårene ble analysert ved hjelp av gjentatt målinger analyse av varians (rmANOVA). Tiden ble holdt som gjentatt effekt og gruppen som fast effekt. Statistiske analyser ble utført med SAS system for Windows, versjon 9.2 (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA). Effekten av FHOD1 stanse på invasiv kapasitet på UT-SCC-43B-celler ble undersøkt ved hjelp av IncuCyte sanntid bildesystem (Essen BioScience, Ann Arbor, Michigan, USA). UT-SCC-43B-celler behandlet med FHOD1 siRNA eller ikke-kodende siRNA og ubehandlede kontrollceller ble platet ut på 96-brønners plater (ImageLock plate, Essen BioScience, MI) belagt med 50 ul 10% vekstfaktor Redusert Matrigel (BD Biosciences) etter hvoretter cellene ble tillatt å feste o /n ved + 37 ° C. Et sår ble ripete over hver brønn (Wound Maker, Essen BioScience) og vekstmedier ble fjernet. Cellene ble deretter forsiktig dekket med 50 pl 25% Matrigel i normal vekstmedium og inkubert i 37 ° C i 2-3 timer for å tillate gelering, hvoretter 100 ul vekstmedium ble forsiktig tilsatt til hver brønn. Satsen for invasjonen (sårheling gjennom matrisen) ble overvåket hver time med Incucyte bildebehandlingsprogrammer (Essen BioScience) i 72 timer. Invasion effektivitet ble bestemt som prosentandel av den relative såret løpet i forhold til respektive negativ kontroll (regnes som 100%).
Måling av ekstracellulære matrise nedbrytning og invadopodia kvantifisering
For å analysere påvirkning av FHOD1 knockdown den ekstracellulære matriks (ECM) nedbrytning og invadopodia dannelse av UT-SCC-43B-celler, ble cellene behandlet med ikke-kodende siRNA og FHOD1 siRNA som beskrevet ovenfor, og sådd ut på 8-brønns glassplater forhåndsbelagt med Cy3-merket gelatin ifølge produsentens instruksjoner (QCM Gelatin Invadopodia analyse (rød), Millipore). Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd og farget for immunofluorescens-mikroskopi med anti-cortactin eller phalloidin. ECM degradering var synlig så mørkt foci blottet for fluorescens. Bilder ble kjøpt med et Olympus BX60 fluorescens mikroskop (Olympus mikroskop, Essex, UK). Nedbrytnings hulrom som produseres av cellene ble fotografert og resorpsjon områder per celle (px) ble målt med ImageJ programvare. For hver gruppe ble middelverdien degradering av 100 celler fra åtte brønner sammenlignes. For å evaluere invadopodia formasjon, celler ble sjekket for aktin rike comet- eller ring-lignende fremspring med positiv cortactin flekker på ventral overflaten. Prosentandelen av celler inneholdende invadopodia ble tellet fra 10 forskjellige felter i hver gruppe. Forskjeller mellom grupper ble testet for signifikans ved ANOVA (Tukey post hoc) i begge forsøkene.
Resultater
Transkripsjonell regulering av formins under kreft-assosiert EMT
Vi brukte tre modell cellelinjer for å vurdere endringer i formin uttrykk under kreft-assosiert EMT. UT-SCC-43A er en muntlig SCC cellelinje fra primærtumor og UT-SCC-43B er en linje fra samme svulst tilbakevendende etter operasjonen og strålebehandling. Den tilbakevendende svulst har gjennomgått en spontan EMT, som demonstrert av flere markører [7]. Den tredje cellelinje, 43A-SNA, ble etablert ved trans UT-SCC-43A celle med Snail å indusere EMT.
Transcriptomic analyse viste at mesenchymale cellelinjer UT-SCC-43B og 43A-SNA har 35 oppregulert gener (logFC ≥2, p≤0.001) og 153 nedregulert gener (logFC ≤ -2, p≤0.001) i vanlige (figur 1 A; gen listene presentert i tabell S1). I UT-SCC43B og 43A-SNA, etablerte EMT-markører som N-cadherin, vimentin og kollagen var oppregulert (figur 1 B), mens epiteliale markører som E-cadherin, keratin, inte og laminins var samtidig ned- regulert som indikerer at transcriptomic endringer er i samsvar med EMT.
A) Microarray transcriptomic profilering av UT-SCC-43A, UT-SCC-43B og 43A-SNA celler. Transkripsjoner betydelig endret i UT-SCC-43B celler sammenlignet med UT-SCC-43A celler er angitt av den blå sirkelen og transkripsjoner endret på 43A-SNA celler sammenlignet med UT-SCC-43A er angitt med den grønne sirkelen. Antallet gener endret i begge sammenligninger er vist i det overlappende området. Antallet oppregulert gener vises på toppen og ned-regulerte gener på bunnen. B) mRNA nivå endringer for valgt epitel (øverst) og mesenchymale (nederst) gener. Avbildet genene koder følgende proteiner: CDH1 = E-cadherin, CLDN3 = claudin 3, CLDN 7 = claudin 7, KRT5 = Keratin 5, KRT6B = Keratin 6b, CDH2 = N-cadherin, VIM = vimentin. C) mRNA nivåer for formins med betydelige endringer i både UT-SCC-43B og 43A-SNA celler som senere ble bekreftet av RT-PCR. D) mRNA nivåer for formins bekreftet av RT-PCR.
Av de 13 formin familiemedlemmer inkludert i array (DAAM1, DAAM2, DIAPH1, DIAPH2, DIAPH3, FHOD1, FHOD3, FMN1, FMN2, FMNL1, FMNL2, FMNL3, INF2), to var konsekvent oppregulert og fire ble nedregulert i løpet av EMT. Den mest betydningsfulle oppregulering ble sett med FHOD1, som ble økt 2,3 ganger i UT-SCC-43B og 3,2 ganger hos 43A-SNA sammenlignet med UT-SCC-43A (figur 1 C). De betydelige transkripsjons forskjeller ble ytterligere bekreftet ved QRT-PCR, som viste oppregulering av formins FHOD1 og FMNL3 og nedregulering av FHOD3 og DIAPH1 både UT-SCC-43B og 43A-SNA celler (figur 1 D).
karakterisering av menneskelig FHOD1 og dens uttrykk mønster
Som FHOD1 var den mest oppregulert formin i EMT, bestemte vi oss for å studere dette dårlig karakterisert protein. Uttrykket profil av menneskelig FHOD1 er ikke kjent, hovedsakelig på grunn av mangel på egnede antistoffer. Vi tok fordel av en FHOD1 antistoff dannet av Human Protein Atlas-prosjektet. I Western blotting, antistoffet reagerte med flere humane endotelceller og kreftcellelinjer. Et enkelt bånd på 145 kDa, som er litt større enn den forutsagte 127 kDa ble påvist i alle de testede cellelinjer (figur S1 A). En lignende bandet ble også sett med en annen FHOD1 antistoff. Den brede reaktivitet er i tråd med tidligere funn som viser FHOD1 uttrykk i de fleste immortaliserte cellelinjer [11].
For ytterligere å teste spesifisitet av HPA antistoff, ble reaktivitet blokkert med antigen GST-FHOD1 fragment eller GST . Som FHOD1 er ansett for å være en endotelial formin [12], brukte vi lysater fra tre endoteliske cellelinjer: HMEC, TIME og HUVEC. Inkubasjon med GST-FHOD1-peptid nesten avskaffet påvisning av 145 kDa band i alle cellelinjer (figur S1 B), mens inkubasjon med GST ikke hadde noen effekt. Til slutt fikk vi bekreftet spesifisiteten ved trans MDA-MB-231 celler med FHOD1 lite forstyrrende (si) RNA eller med ikke-måls kontroll siRNA. Etter FHOD1 siRNA behandling ble antistoffreaktivitet betydelig redusert, mens reaktiviteten i celler transfektert med kontroll siRNA var upåvirket (figur S1 C).
FHOD1 transkriptet i cellelinjer ble analysert ved Northern blotting. Analysen avdekket en enkelt 4,0 kb transkript i alle fem cellelinjer, samsvarer med resultatet fra Western blot analyse (figur S1 D).
For å systematisk undersøke hvilke vev og celletyper uttrykke FHOD1, immunhistokjemisk farging med HPA FHOD1 antistoff ble utført på 26 forskjellige humane vev. I praktisk talt alle prøvene kapillære endotelceller var immunreaktivt, men med variabel fargeintensitet. Den mest intensive FHOD1 farging ble sett i de små blodkarene i milt (figur 2 A), endometrium (figur 2 B), eggstokk (figur 2 C) og i peritoneal fartøy under mesothelium. I de fleste vev og celletyper, de parenkymceller vist liten eller ingen FHOD1 reaktivitet. For eksempel, i hjernen, verken nerveceller eller gliaceller uttrykt FHOD1 (figur 2 D). Endotelceller i cerebrale blodkar, på den annen side, uttrykt FHOD1. En liten undergruppe av lymfocytter i lymfeknuter (figur 2 E), milt, benmarg (figur 2 F) og intestinal mucosa (figur 2 G) farget intenst. I lungen, ble moderat ekspresjon sett i alveolære makrofager (figur 2 H). Resultatene av den immunhistokjemiske analyse er presentert i tabell 1. Etterfølgende farging med lymfocytt subtype-spesifikke markører viste at den delmengde av lymfocyttene som uttrykte FHOD1 besto av CD138-positive plasma-celler (fig 2 I og J).
parafininnstøpte normale menneskelige vev ble farget med FHOD1 antistoff. A) I milten endotelceller foring blodkar viser intensiv FHOD1 immunoreaktivitet. B) Livmor stroma og kjertler uttrykke litt FHOD1. Endotelceller i blod fartøy vegger er farget sterkt (pilspisser). C) I eggstokken, ubefruktede egg (O) og hårsekkceller (stjerne) uttrykker lite FHOD1. D) I hjernen, verken nevroner eller gliaceller vise FHOD1 farging. Endotelcellene i liten kapillærer (piler) flekk svakt. E) I lymfeknute, de fleste lymfocytter flekker svakt. Sporadiske sterkt flekker celler har plasmacelle morfologi (åpne pilspisser). F) I benmargen, trenger erytropoetiske celler ikke uttrykke FHOD1. Myelopoietiske celler og megakaryocytter (M) flekk svakt. Sporadiske små celler som uttrykker FHOD1 sterkt (åpne pilspisser) er plasmaceller. G) I colonic slimhinnene, epitelceller viser bare svak FHOD1 farging. Stromal plasmaceller (åpne pilspisser) uttrykker FHOD1 sterkt. H) Alveolar epitel i lungene flekker svakt for FHOD1, mens alveolære makrofager (MP) viser moderat FHOD1 farging. I, J) Dobbelt immunfluorescens farging av FHOD1-positive inflammatoriske celler viser at de samme celler uttrykker CD138 (pilspisser). Den cellemorfologi og CD138 tyder på at de er plasmaceller. I A-H skala bar = 100 mikrometer.
Vi konkluderer med at FHOD1 er uttrykt i mange vev, men bare i begrenset celletyper. Av notatet, alle sterkt flekker celletyper er av mesenchymale opprinnelse. Dette samsvarer med
i silico
mRNA profil hentet fra en GeneSapiens database søk [10] (figur S2). Den lave allestedsnærværende FHOD1 uttrykk på tvers av alle normale vev kan tilskrives uttrykk i endotelceller. Høyere uttrykk kan sees i vev der parenkymceller også farget i immunhistokjemi,
dvs.
Skjelettmuskulatur, bryst og eggstokk. Selv om mRNA nivå i mesothelial vevsprøver er relativt høy, gjorde mesothelial celler ikke flekker med FHOD1 antistoff. De høye mRNA nivåer er trolig på grunn av det rike endotelet i blodkar under mesothelium. I slike fartøyer, immunhistokjemisk FHOD1 farging var sterk.
EMT fører til PI3K sti-avhengige FHOD1 oppregulering og morfologiske forandringer
Selv om immunhistokjemiske resultatene og i
silico
mRNA profilen foreslo minimal FHOD1 ekspresjon i epiteliale celletyper, våre transcriptomics resultater og GeneSapiens bioinformatikk undersøkelse av karsinomer (ikke vist) viste moderat mRNA-nivåer i visse kreftformer. For eksempel, den midlere normaliserte uttrykk verdi av lunge adenokarsinom var 850 sammenlignet med 400 i luftveiene, og verdien av oral SCC var 800 sammenlignet med 100 i normal hud (verdier for oral mucosa ikke var tilgjengelig). For å undersøke om oppregulering av FHOD1 oppstår i klinisk oral SCC, vi tilfeldig valgte ti muntlige SCC prøver for immunhistokjemisk analyse. Som EMT er tenkt å skje
in vivo
ved invasiv kanten av epiteliale kreftformer, microarray kunne ikke brukes. Vi fant ingen reaktivitet i ikke-neoplastiske stratifisert plateepitel av munnslimhinne i noen av tilfellene, mens moderat til sterk FHOD1 farging ble gående sett i invasive SCC-celler med en mesenchymale spindelformet morfologi (figur 3 A). Interessant, FHOD1 immunreaktivitet var mild eller fraværende i de godt differensierte områder av invasiv kreft, noe som indikerer at tumoren bulk som består av cellulære områder med epitelial differensiering uttrykker lite FHOD1.
A) I normal eller ikke-neoplastisk lagdelt plateepitel, kan ingen FHOD1 oppdages (øverst). I invasive plateepitelkarsinom, moderat til sterk FHOD1 immunoreaktivitets er sett i spindelformede celler ved invasiv foran som på morfologiske begrunnelse har gjennomgått EMT (nederst; detaljer i innfelt). I tumoren delen, som består av celler med en epitelial morfologi, er bare svak immunreaktivitet til stede. Skala: 200 mikrometer. B) Western blot analyse av cellelinjer viser at epitel SCC cellelinje UT-SCC-43A ikke uttrykker påviselig FHOD1, mens både spontan EMT cellelinje UT-SCC-43B og sneglen-indusert EMT cellelinje 43A-SNA uttrykke FHOD1. UT-SCC-43A uttrykker epitel markør E-cadherin men ikke N-cadherin, mens UT-B SCC43 og 43A-SNA uttrykke N-cadherin men ikke E-cadherin. C) F-aktin organisering av UT-SCC-43A (øvre panel) er vanligvis epitel, med tydelig celle submembraneous filamenter og snaut stresset fiber. UT-SCC-43B viser funksjonene mesenchymale organisasjon (midtre panelet). Celle-celle-kontakter er få, celler er langstrakte og inneholde lamellopodia, filopodia og spennings fibre. Innsatsen (nederst panel) viser at en brøkdel av FHOD1 co-lokaliserer med stress-fibre i UT-SCC-43B celler (pilspisser). Kjerner er farget med DAPI (blå). D) FHOD1 oppregulering i UT-SCC-43B-celler er avhengig av PI3K signalering. Behandling med MEK 1/2 inhibitor U0126 reduserer fosforylering av ERK 1/2 men påvirker ikke FHOD1 uttrykk. I kontrast, PI3K hemming av LY294992 markant reduserer FHOD1 uttrykk. Reduksjonen av p-Akt indikerer at veien er effektivt sperret.
Deretter studerte vi om FHOD1 uttrykk var assosiert med morfologiske og funksjonelle endringer i EMT. Av de tre orale SCC cellelinjer, ble påviselig FHOD1 sett i UT-SCC-43B og 43A-SNA, men ikke i UT-SCC-43A, hvilket indikerer at også på proteinnivå, FHOD1 oppregulering forekommer i EMT både i den spontane og Snail-indusert modell (figur 3 B). Som forventet, uttrykte UT-SCC-43A E-cadherin men ikke N-cadherin, mens UT-SCC-43B og 43A-SNA uttrykt N-cadherin men ingen E-cadherin (figur 3 B).
cellelinjer viste også tydelige morfologiske funksjoner og organisering av aktin cytoskjelettet. UT-SCC-43A-celler hadde en typisk epitelial fenotype, som de dannet ark av celler med celle-til-celle-kontakter og knappe spenningsfibre (figur 3 C, øvre panel). UT-SCC-43B, på den annen side, besto av litt langstrakte celler med mange filopodia og rikelig stresset fiber (figur 3 C, midt panel). Fordelingen av FHOD1 var delvis Punktum og cytoplasma, men det også klart lokalisert til reke fibre (figur 3 C, lavere panel).
I oral SCC, signalveier som vanligvis aktiveres i EMT inkluderer phosphatidylinositol-s- kinase (PI3K) og mitogenaktivert proteinkinase (MAPK /ERK 1/2) trasé [13]. For å undersøke hvorvidt FHOD1 oppregulering var avhengig av aktivering av en av disse signalveier, ble cellene behandlet med PI3K og MEK1 /2-inhibitorer. Inhiberingen av MEK1 /2 påvirket ikke FHOD1 ekspresjon, selv om reaksjonsveien ble effektivt inhibert. I motsetning til dette, PI3K hemning vesentlig redusert FHOD1 uttrykket (figur 3 D). Dette funnet viser at FHOD1 uttrykk i UT-SCC-43B er avhengig av PI3K signalering.
FHOD1 knockdown undertrykker mesenchymale morfologi, migrasjon og invasjon i UT-SCC-43B celler
Den funksjonelle betydningen av
