Abstract
positron utslettelse levetid spektroskopi (PALS) gir en direkte måling av fri volum ugyldige størrelser i polymerer og biologiske systemer. Det frie volum er kritisk for å forklare og forstå fysikalske og mekaniske egenskaper til polymerer. Videre PALS er nylig blitt foreslått som en potensiell verktøy i å oppdage kreft på et tidlig stadium, sondering forskjellene i subnanometer skala gratis volum tomrom mellom kreft /sunn hud prøver av samme pasient. Til tross for flere undersøkelser på fritt volum i komplekse kreft vev, har ingen positron annihilasjon studier av levende kreftcellekulturer er rapportert. Vi viser at Pals kan anvendes i studiet i humane leve 3D-cellekulturer. Teknikken er også i stand til å detektere atommålestokk endringer i størrelsen av det frie volum hulrom på grunn av de biologiske responser til TGF-β. PALS kan utvikles for å karakterisere effekten av ulike kulturforhold i de frie volum hulrom av celler dyrket
in vitro
Citation. Axpe E, Lopez-Euba T, Castellanos-Rubio A, Merida D, Garcia JA, Plaza-Izurieta L, et al. (2014) Påvisning av Atomic Scale Endringer i Free Volume Void Størrelse tredimensjonale Colorectal Cancer Cell Culture Bruke positron annihilasjon Lifetime spektroskopi. PLoS ONE 9 (1): e83838. doi: 10,1371 /journal.pone.0083838
Redaktør: Varda Rotter, Weizmann Institute of Science, Israel
mottatt: 12 juli 2013; Godkjent: 17 november 2013; Publisert: 02.01.2014
Copyright: © 2014 Axpe et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Basque Department Industri gi no. SAI11 /263 – PRODETEC og baskiske Institutt for utdanning, universiteter og forskningsstipend nei. IT /443/10. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Gratis volum hulrom spille en nøkkelrolle i en rekke mekaniske egenskaper i polymerer [1] og dynamiske prosesser i biologiske systemer, inkludert permeabilitet av små molekyler og spredning av narkotika gjennom cellemembraner [2]. Positron utslettelse levetid spektroskopi (PALS) gir en direkte måling av fri volum ugyldige størrelser i polymerer og biologiske systemer på molekylært nivå, og dette gratis volum er avgjørende for å forstå fysiske og mekaniske egenskaper av komplekse biomolekylære systemer som kollagen [3], svin eye linse [4], rottehjerne deler [5] og menneskelig hud [6].
det er nylig vist at PALS er følsom for endringer i den frie volum hulrom størrelse som er forbundet med visse typer svulster og er i stand til å skjelne mellom friske og hudkreft prøver fra den samme pasient. Således har PALS blitt foreslått som en potensiell verktøy for å påvise kreft-dannelse ved de tidlige stadier av tumorutvikling [6], [7]. Imidlertid cellulære sammensetning av vevsprøver varierer fra samme organisme og kan innebære endringer i hulroms størrelsene [8].
hypotese er at biologiske respons på miljøfaktorer, slik som cellulær differensiering og forandringer i cellestrukturen koloni ledsages av atom omfattende endringer i det frie volumet tomrommet størrelsen på cellene, og at disse endringene kan være preget av PALS. For å teste denne ideen, vi brukte en T84 menneskelige tykktarmskreft 3D cellekultur modellen under to forskjellige tilstander som medfører forskjellig
in vitro
flercellet organisering av kolonier. Cellene ble dyrket i en type I kollagen-gel matriks, med eller uten transformerende vekstfaktor-β (TGF-p), en fibroblast-avledet faktor som påvirker epitelcelleproliferasjon, differensiering, motilitet, og T84 celledifferensiering. Celler i kollagen danner uorganisert 3D-cellegruppene innenfor geler, men når den dyrkes i nærvær av TGF-β, T84 epitelceller er i stand til å organisere og differensiere til en distinkt fenotype som ligner tarm krypter [9]. Vi viser at PALS målinger er i stand til å oppdage atom omfattende endringer av hulrom størrelse i menneskets tarm adenokarsinom 3D cellekulturer utvikler seg over tid, og ved behandling med TGF-β.
Materialer og metoder
Cellekultur
Menneskelig colon adenokarsinom T84 cellelinje (CCL 248, ATCC Rockville, MD, USA) ble vennlig levert av professor Markku Maki (cøliaki Study Group, Universitetet i Tampere, Finland). Celler ble holdt i kultur i laboratoriet. Dulbeccos modifiserte Eagles medium F12 næringsblanding (01:01) (DMEM-F12 ref 31330), penicillin-streptomycin (ref 15070) og natriumbikarbonat ble kjøpt fra Life Technologies (Spania). Varme-inaktivert føtalt bovint serum (ref F9665), 10 x RPMI-1640 (ref R1145), trypsin /EDTA (ref T4049), Triton X-100 (ref T9284), albumim fra bovint serum (ref B4287) og ribonuklease A (ref R6513) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (Spania). Rottehalecollagen jeg (ref 354236) ble kjøpt fra Beckton Dickinson (Spania). Transforming growth factor beta 1 rekombinant human (rhTGF-β, ref 240-B) ble kjøpt fra R For normale vekstforhold gjennomsnitts tomrommet volum i toppen var 102 ± 1 A
3 på 34 dager, mens for kulturen med TGF-β var 111 ± 1 A
3 på 20 dager. Som vist i figur 2, når den gjennomsnittlige tomroms-størrelse nådd et maksimum, begynte denne verdien for å avta gradvis: den midlere hulromsvolum sank 7% under normale betingelser i en uke, og 16% i 3 uker i henhold til TGF-β betingelser
den blå kurven representerer kontrollkulturer og den røde kurven representerer kulturer behandlet med TGF-β.
bilder
gjennomsnittlig levetid og distribusjon
o
-ps i tre dimensjonale cellekulturer var henholdsvis 2-12% og 20-120% større enn i kollagen (tabell 1). Avhengig av vekst tidspunkt,
o
-ps levetid distribusjon for TGF-beta kulturer var mellom 0,11 ± 0,08 ns til 0,26 ± 0,07 ns større enn ved unstimulated vekstvilkår.
Diskusjoner
Vi har vist at T84 3D kulturmodell gjør det konkrete studiet av fritt volum i levende celler ved PALS. Vi fant ut at PALS oppdager atom omfattende endringer av midlere fri-volum ugyldig størrelse i menneskets tarm adenokarsinom 3D cellekulturer over tid. Morfologiske endringer observert ved immunfluorescens mikroskopi i cellekulturer i ulike forhold er sikkert konsekvensen av molekylære hendelser som skjer i cellene og er også reflektert i PALS målinger. Selv om cellekultur utviklings hendelser ikke kan være korrelert direkte til fri volum, resultatene tyder på at celleforandringer er faktisk gjenspeiles i nanostrukturen av disse kulturene.
o
-ps levetid endringer sannsynligvis dukke opp fra de dynamiske prosessene i cellekulturer (vekst, divisjon og død). Videre induserer TGF-β celle differensiering, og dette acompained av en økning i fordelingen av
o
-ps levetid (og dermed av fritt volum størrelse) i 3D-cellekulturer. Dette resultatet innebærer en større spredning av hullstørrelse i prøvene som er behandlet med TGF-β sammenlignet med ikke-stimulerte betingelser. Celledød kan være involvert i rulle i
o
-ps levetid.
Vi er ved begynnelsen av PALS applikasjoner i komplekse cellesystemer, men våre resultater viser at 3D-cellekulturer (
o
-ps levetid måles i en blanding av celler og kollagen) kan være et godt utgangspunkt for denne type forskning. Foreløpig PALS tillater bare bulk målinger som ikke gir tilstrekkelig oppløsning til å skille
o
-ps levetid i enkeltceller fra hele kulturen. Likevel må den målte økningen i levetid og utdeling skyldes molekylære og strukturelle endringer som påvirker det frie volumet av cellene og dermed at av 3D-kulturen. Videre PALS er en ikke-perturbative teknikk; det perturbs hverken strukturen av 3D-kultur eller celle dynamikk. Vi brukte Tao-Eldrup modell for polymerer ved beregning av størrelsen på frie volum hulrom fra
o
-ps levetid, som tidligere har gjort i mange PALS studier i biologiske systemer [3] -. [7]
Så langt vi kjenner til, er dette den første studien av anvendelsen av PALS i 3D levende cellekulturer og faktisk, flere målinger i ulike cellelinjer og dyrkningsforhold som endrer ulike biologiske parametere er nødvendig før denne metoden kan være ansett som et potensielt nyttig diagnostisk verktøy i menneskelig sykdom. Sammen med eksperimentell forskning, studier for å vise hvorvidt den lokale elektriske felter som forårsakes av transmembrane spenning av cellene påvirker positron signal, eller som deler av cellen er foretrukket mål for den positron utslettelse bør også foretatt. I tillegg beregnings simuleringer for å vurdere tilpasning av Tao-Eldrup modell (implementert for gratis-volum karakterisering i polymerer) til mer komplekse biologiske saken vil være nødvendig.
I konklusjonen, er dette den første studien søker PALS for karakterisering av levende celler. Våre resultater viser at 3D-cellekulturer er nyttig for å måle fritt volum i levende celler ved PALS på en realistisk og kontrollert måte, og for observasjon av endringer i frie volum ugyldige størrelser i cellekulturer på grunn av spesifikke faktorer (for eksempel vekst tid og TGF-β). Denne studien er i samsvar med PALS teknikk som en gyldig verktøy for karakterisering av biologiske systemer, og kan gi nyttig informasjon om kreftforskning på atomært og molekylært skala.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Design og oppsett av prøveholderen og positron kilde for anvendelse av PALS i biologiske prøver og væsker. Vi utformet og fabrikkert en aluminiumprøveholder for å måle biologiske prøver og væsker. De scintillatorer og fotomultiplikatorer som brukes i dette arbeidet ble plassert i en vertikal stilling. Figuren viser lengdesnitt av prøveholderen (1). I (2) beskriver vi prøven fyller den nedre side av holderen. I (3), plasserer vi Kapton kilde over prøven, sitter på aluminium projeksjon. Vi kan også se hvordan
22Na er tidligere avsatt bare i midten av Kapton, så alle positroner tilintetgjøre i prøven, og ikke i holderen. Dette Kapton kilde må være robust, slik at vi brukte en tykkere kapton folie på 75 um for den del som sitter på holderen fremspring (Kapton folie B), i forhold til 7,5-um kapton folie A. I (4) vi vise hvordan positron kilde er klemt av to identiske væske /biologiske prøver
doi:. 10,1371 /journal.pone.0083838.s001 plakater (TIFF)
Video S1.
Confocal immunfluorescens av tredimensjonale T84 kolonier etter 7 dager i kultur
doi:. 10,1371 /journal.pone.0083838.s002 plakater (AVI)
Video S2.
Confocal immunfluorescens av tredimensjonale T84 kolonier etter 17 dager i kultur
doi:. 10,1371 /journal.pone.0083838.s003 plakater (AVI)
Video S3.
Confocal immunfluorescens av tredimensjonale T84 kolonier etter 7 dager i kultur med 10 ng /ml TGF-β
doi:. 10,1371 /journal.pone.0083838.s004 plakater (AVI)
Video S4 .
Confocal immunfluorescens av tredimensjonale T84 kolonier etter 17 dager i kultur med 10 ng /ml TGF-β
doi:. 10,1371 /journal.pone.0083838.s005 plakater (AVI)
Takk
Teknisk og menneskelig støtte fra SGIker (UPV /EHU, MICINN, GV /EJ, ERDF og ESF) er takknemlig anerkjent.
