Abstract
trans-membrane slimstoffer, MUC4 og MUC16 er forbundet med tumorprogresjon og metastatisk potensial i menneskelige bukspyttkjertelen adenokarsinom. Vi oppdaget at Mir-200c samhandler med spesifikke sekvenser i den kodende sekvensen av MUC4 og MUC16 mRNA, og evaluert de regulatoriske natur denne foreningen. Bukspyttkjertelkreft cellelinjer S2.028 og T3M-4 transfektert med MIR-200c viste 4,18 og 8,50 ganger nedregulering av MUC4 mRNA, og 4,68 og 4,82 ganger nedregulering av MUC16 mRNA forhold til mock-transfekterte celler, henholdsvis. En betydelig reduksjon av glykoprotein-ekspresjon ble også observert. Disse resultatene indikerer at Mir-200c overekspresjon regulerer MUC4 og MUC16 slimstoffer i bukspyttkjertelen kreftceller ved direkte rettet mot mRNA kodende sekvens av hver, noe som resulterer i reduserte nivåer av MUC4 og MUC16 mRNA og protein. Disse dataene viser at det i tillegg til å regulere proteiner som modulerer EMT, MIR-200C påvirkninger uttrykk for celleoverflateslimstoffer i bukspyttkjertelkreft
Citation. Radhakrishnan P, Mohr AM, Grandgenett PM, Steele MM, Batra SK, Hollingsworth MA (2013) mikroRNA-200c modulerer uttrykk for MUC4 og MUC16 ved direkte rettet mot deres sekvensene i human kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 8 (10): e73356. doi: 10,1371 /journal.pone.0073356
Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland Medical School, Tyskland
mottatt: 31. mai 2013; Godkjent: 19 juli 2013; Publisert: 25 oktober 2013
Copyright: © 2013 Radhakrishnan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd fra National Cancer Institute: SPORE (1P50CA127297), Early Detection Research Network (5U01CA111294), Alliansen av Glycobiologist for diagnostisering av kreft og kreftrisiko (5U01CA128437), svulstens mikromiljø Network (U54 CA163120), og R01CA57362 . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er små (~ 20-22 nukleotider) ikke-kodende RNA som regulerer genekspresjon ved å samhandle med enten den 3 «ikke-translaterte region (3» UTR) eller kodende region til mål mRNA. Uttrykk for målrettede genprodukter påvirkes av miRNA indusert mRNA degradering eller hemming av oversettelses [1]. Endret uttrykk for miRNAs i kreft resultater i tumor fremme og krefthemmende funksjoner. For eksempel har MIR-155, MIR-17-5p og MIR-21 kjente onkogene aktiviteter [2,3], mens MIR-15a, MIR-16-1, la-7 og MIR-145 funksjon som tumor suppressors [ ,,,0],4-9]. Det er blitt vist at MIR-200c er differensielt uttrykt i kreft i bukspyttkjertelen, hvor høy ekspresjon var assosiert med bedre overlevelse og lav ekspresjon er assosiert med dårligere overlevelsen [10]. Overekspresjon av MIR-200c hemmer kreft celle invasjon av modulerende faktorer viktige i EMT [10]. Ektopisk uttrykk for MIR-200c induserer høyere nivåer av E-cadherin i bryst og kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom direkte målretting av transkripsjon faktor 8 (TCF8 /ZEB1), en negativ regulator av E-cadherin [11-14]. Derfor celler med høye nivåer av MIR-200c har en mer epiteliale og mindre mesenchymale fenotype som kan påvirke metastasering. Nylig, overekspresjon av MIR-200c ble vist å hemme melanoma tumorprogresjon og narkotika motstand [15].
Aberrant uttrykk for slimstoff glykoproteiner er assosiert med kreft i bukspyttkjertelen progresjon til metastasering. De transslimstoffer, MUC4 og MUC16 er abnormt overuttrykt i mange adenokarsinomer, inkludert menneskelig kreft i bukspyttkjertelen [16-18]. Den MUC4 mucin er et stort glykoprotein uttrykt av epitel-celler i et mangfold vev. MUC4 blir ikke uttrykt i normal pankreas, men er abnormt uttrykkes i en høy prosentandel av premaligne og maligne lesjoner i bukspyttkjertelen [16,19]. MUC4 fremmer kreft vekst og metastasering blant annet gjennom interaksjon med HER2 oncoprotein [20,21]. MUC16 (ca125) er en høy molekylvekt mucin glykoprotein normalt uttrykt i okulær overflate, luftveiene og reproduktive organer inneholder epitelceller [22]. CA 125, en epitop på MUC16, blir brukt som en tumormarkør for påvisning av kreft i eggstokkene i sera fra pasienter [23] og kreft vekst MUC16 påvirker ovarial og metastase [24]. Økt uttrykk for MUC16 er også observert i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen [17,18], og vi har nylig vist at det er økt uttrykk i metastatiske lesjoner av bukspyttkjertelkreftpasienter [25].
Vi rapporterer her at speil 200c samvirker med spesifikke sekvenser innenfor den kodende sekvensen til MUC4 og MUC16 mRNAer og regulerer deres nivå av ekspresjon. Høyere uttrykk for transslimstoffer og tap av MIR-200c er sterkt assosiert med metastatiske egenskapene til kreftceller.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur
Menneske kreft i bukspyttkjertelen celler CAPAN-en (American Type Culture Collection, ATCC), S2.007, S2.013, S2.020, S2.028 [26], HPAF (sjenerøs gave fra retten Metzgar, Institutt for mikrobiologi og immunologi, Duke University Medical Center, Durham. North Carolina), og T3M-4 (gaver fra Tetsuro Okabe, University of Tokyo, Japan) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Hyclone, Logan, UT, USA), supplert med 10% føtalt bovint serum (dalen Biomedical Inc., Winchester, VA, USA), 100 ug /ml streptomycin og 100 enheter /ml penicillin (Mediatech Inc, Manassas, VA, USA) og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktet inkubator.
mikroRNA isolasjon og real time-PCR (RT-PCR) analyse av MIR-200c
miRNA ble hentet fra kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp av Mirvana miRNA isolasjon kit (Ambion, Carlsbad, CA, USA). Uttrykk av MIR-200c ble kvantifisert ved bruk av TaqMan mikroRNA analysesett (ABI, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll.
miRNA-200c overekspresjon i S2.028 og T3M-4 bukspyttkjertelkreft cellelinjer
Oligonukleotider av primær transkripsjon av MIR-200c ble klonet inn p
Silencer
4,1-CMV plasmid (Ambion, Carlsbad, CA, USA) (tabell S1) for å etablere en stabil ekspresjonsvektor. Celler ble sådd ut på 75 x 10
3-celler per brønn (12-brønns plate) dagen før transfeksjon, og 1 ug plasmid ble transfektert inn i cellene neste dag ved hjelp av Lipofectamine LTX med PLUS-reagens (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Celler ble plassert under utvalg med G418 (200 ug /ml) 48 timer etter transfeksjon. Kloner ble deretter plukket og analysert for MIR-200C ekspresjon i S2.028 cellelinjen (klon 7), mens et polyklonalt utvalgt populasjon ble brukt for den T3M-4-cellelinje. Celler transfektert med egge sekvens inneholdende vektoren fra settet (Ambion, Carlsbad, CA, USA) tjente som en negativ kontroll. Uttrykk av MIR-200c ble kvantifisert ved bruk av TaqMan mikroRNA analysesett (ABI, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. U6 rRNA ble anvendt som en intern kontroll. Den sammenleggbare endringen i uttrykket ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metoden [27].
metylenblått Cell Proliferation Assay
Celleproliferering ble analysert ved hjelp av en metylenblått celle fargestoff som tidligere beskrevet [28]. S2.028 og T3M-4 kontroll- og MIR-200C uttrykkende celler ble tellet og sådd ut i 2000 celler per brønn i en 96-brønns plate og 200 pl totalt volum, åtte replikater for hver tidsramme. Ved hvert tidspunkt (24, 48, 72 og 96 timer) media ble fjernet, og cellene ble vasket en gang med 150 ul Dulbeccos PBS og fiksert med 150 pl 10% formalin i 30 minutter ved romtemperatur. Formalin ble fjernet, og cellene ble farget i 2 timer med 80 ul av 1% metylenblått (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ble fortynnet med 0,01 M boratbuffer, pH 8,5. Cellene ble vasket med 150 ul av 0,01 boratbuffer, pH 8,5, fire ganger. Metylenblått ble ekstrahert med 100 pl 0,1 N HCl /etanol (1: 1) og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Absorbans ved 650 nm ble bestemt ved spektrofotometrisk analyse. To-veis ANOVA ble brukt til å analysere statistisk forskjell mellom gruppene. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Sanntids-PCR (RT-PCR) analyse av slimstoffekspresjon
Totalt RNA ble isolert fra S2.028 og T3M-4-celler ved hjelp TRI Reagens (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert ved hjelp av Verso cDNA-sett (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Analyse av MUC1, MUC4, MUC16 og GAPDH mRNA nivåer ble utført med SYBR Grønn PCR Master Mix (ABI, Carlsbad, CA, USA). De følgende primere ble anvendt for RT-PCR: MUC1, F-5-CTGCTCCTCACAGTGCTTACAGTTG-3; R-5- TGAACCGGGGCTGTGG CTGG-3; MUC4, F-5-GCCCAAGCTACAGTGTGACTCA-3; R-5-ATGGTGCCGTTGTAATT TGTTGT-3; MUC16, F-5-ACATCAACTCCTGCCTTCCCAGAA-3; R-5-ACCAGTGGGCAT TCCAGAAAGAGA-3; GAPDH, F-5-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3; R-5-ACCAA ATCCGTTGACTCCGACCTT-3. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer. Forskjeller i slimstoffgenekspresjon, uttrykt som fold-endringer, ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metoden bruker GAPDH som intern kontroll.
immunoblotanalyse av slimstoffer
SDS-agarosegelelektroforese ble brukt til å analysere mucin uttrykk som tidligere beskrevet [29]. Celler som uttrykker MIR-200c eller en kryptert kontroll ble høstet og protein ble ekstrahert ved bruk av NP-40 cellelyseringsbuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, pH 8,0) supplementert med proteasehemmere (Promega, Madison, WI, USA). Cellelysater (50-100 ug protein) ble løst i SDS (0,1%) – agarose (2%) gel elektroforese og overført til PVDF-membran. Membranene ble blokkert i 5% ikke-fettholdig tørrmelkpulver i Tris-bufret saltoppløsning (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl) med 0,1% Tween 20 pH 7,4. Membranene ble inkubert med følgende primære antistoffer: MUC1 (AR20.5-mus IgG, quest Pharma Inc, Edmonton, Alberta, CA), MUC4 (8G7- Mouse IgG, snill gave fra Dr. Surinder K Batra, Avdeling for biokjemi og molekylærbiologi, UNMC), MUC16 (AR9.6R333 Mouse IgG, quest Pharma Inc, Edmonton, Alberta, CA) og α-tubulin (Mouse IgG, utviklingsstudier hybridoma bank, Iowa, USA) (1: 1000 fortynninger med 5% ikke -fat tørrmelkpulver i TBS-T), over natten ved romtemperatur. Membranene ble deretter vasket (3 x 10 min) med TBS-T ved romtemperatur og probet med 1: 5000 fortynnet geit-antimus HRP-konjugert sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) i 1 time ved romtemperatur og vasket 3 x 10 minutter med TBS-T. Signalet ble påvist med Super signal
® West Pico kjemiluminescenssubstrat (Thermo vitenskapelig, Rockford, IL, USA). En densitometrisk kvantifisering av MUC4 og MUC16 proteinbånd ble utført ved bruk av ImageJ program (NIH). Den ganger endring i proteinbånd intensitet (prosent vilkårlige enheter) ble beregnet ved å dividere proteinet tettheten av MIR-200c uttrykkende celler av protein tettheten av vektorkontrollceller. Påvisning av a-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting.
vektorkonstruksjoner
ORF regioner av MUC16 og MUC4 mRNA som ble anslått til å interagere med MIR-200c ble syntetisert og satt inn i pMIR-RAPPORT
TM miRNA Expression Reporter Vector-systemet (ABI, Carlsbad, CA, USA) ved hjelp av Spel og Hindi restriksjonsseter (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA). Villtype og mutant MUC4 og MUC16 /mir-200C interaksjoner sekvenser ble syntetisert og anvendt i denne studien (tabell S1). Mutasjoner i potensielle Mir-200C bindingsseter ble generert ved nukleotid erstatning av villtypesekvensen til å hemme MIR-200c bindende. Innsettingen og orienteringen av fragmentet ble bekreftet ved sekvensanalyse. De plasmider ble betegnet pMIR-RAPPORT
TM-wild (MUC16 og MUC4 wt) og pMIR-RAPPORT
TM-mutant (MUC16 og MUC4 mt) (tabell S1).
Transfeksjon og Luciferase analyser
kreft i bukspyttkjertelen (S2.028 og T3M-4) celler ble dyrket i en 6-brønns plate og transient transfektert ved 60-80% konfluens med plasmidene som er angitt ovenfor ved hjelp av Lipofectamine
TM 2000-reagens (Invitrogen life Technologies, Carlsbad, CA, USA) som per produsentens instruksjoner. Luciferase-aktivitet ble målt ved anvendelse av luciferase reporter analysesystemer (Promega, Madison, WI, USA), 48 timer etter transfeksjon. Luciferase analysene ble utført i henhold til produsentens instruksjoner på en 96 brønners plate leser (Polar Star Optima mikroplateleser, Offenburg, Tyskland). Alle verdier ble presentert som gjennomsnitt ± SEM av relative luciferase enheter (RLU) fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller. En uparet t-test (tosidige) ble utført for statistisk analyse ved hjelp av GraphPad PRISM® versjon 5.0 program. Forskjeller med en p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
MIR-200c. Uttrykk profilering og overekspresjon i bukspyttkjertelen kreftcellelinjer
Vi undersøkte uttrykk for MIR-200c i 7 kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer ved kvantitativ sanntids RT-PCR. Som vist i figur 1A, 5 bukspyttkjertelkreft cellelinjer, inkludert CAPAN-en, S2.007, S2.013, S2.028, og T3M-4, uttrykke høyere nivåer av MIR-200c enn S2.020 og HPAF celler.
(A) uttrykket av MIR-200c i syv kreft i bukspyttkjertelen celler ble bestemt ved real-time PCR. Hver prøve ble kjørt i kvadruplikat og Feilstolpene representerer SD. S2.028 (B) og T3M-4-celler (C) stabilt uttrykker den primære transkripsjon av MIR-200c ble evaluert for MIR-200c uttrykk ved Real-time PCR. Hver måling ble utført i tre eksemplarer. Disse verdier ble normalisert med den interne kontrollen U6 rRNA. Den ganger økning i transkripsjonsnivåer enn vektorkontroll er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. Den p-verdi ble bestemt ved hjelp av t-test. Forskjeller med en p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Den modne sekvens av MIR-200c ble syntetisert og klonet inn i en uttrykksvektor som beskrevet ovenfor (p
Silencer
4,1-CMV-MIR-200c) og stabilt uttrykt i S2.028 celler og T3M-4. Kvantitativ RT-PCR analyse av MIR-200c uttrykk i S2.028-MIR-200C celler viste en 3,68 ganger økning og T3M-4-MIR-200C celler viste en 2,6 ganger økning i modne MIR-200C nivåer i forhold til vektorkontroll transfekterte celler (Figur 1B og 1C). Vi bekreftet at rekombinant moden form av MIR-200c var aktiv ved å observere nedregulering i uttrykket av ZEB1, et kjent mål for MIR-200c, i både S2.028 og T3M-4 celler (figur S1).
Vi undersøkte også endringer i celle spredning egenskapene til Mir-200c uttrykke S2.028 og T3M-4 kreft i bukspyttkjertelen celler. En betydelig reduksjon i vekstraten til S2.028 MIR-200c ble observert ved 72 og 96 timer (*** p 0,0001) sammenlignet med S2.028 vektorkontrollceller (Figur S2A). Imidlertid ble det ikke observert noen endring når T3M-4 MIR-200c ble sammenlignet med vektorkontrollceller som helst punkt testet (figur S2B).
MUC4 og MUC16 uttrykk er undertrykt av MIR-200c
Vi vurderte muligheten av MIR-200c å regulere membranbundne slimstoffer ved å uttrykke MIR-200c (p
Silencer
4,1-CMV-MIR-200c) i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer S2.028 og T3M-4. Det var en dramatisk reduksjon av MUC4 protein i S2.028-miR200c (1,7 ganger) og T3M-4-MIR-200c (4,46 ganger) celler i forhold til å kontrollere celler (Figur 2A og 2B). Likeledes var det en signifikant reduksjon i MUC16 protein (høy og lav molekylvekt isoformer) i S2.028-miR200c (18,1 og 5,9 ganger henholdsvis) og T3M-4-MIR-200 ° C (5,2 og 6,1 ganger henholdsvis) celler sammenlignet kontrollceller (figur 3A og 3B).
Lysater fra (A) S2.028 og (B) T3M-4-MIR-200c og respektive vektorkontroll transfekterte celler ble separert på SDS-agarosegel-elektroforese, utsettes til western blot hjelp av en anti-MUC4 antistoff (venstre panel) og signalene ble kvantifisert ved densitometri og analysert ved hjelp av ImageJ programmet (høyre panel). MIR-200c uttrykkende celler viste en signifikant reduksjon av MUC4 protein sammenlignet med kontrollceller i (A) S2.028 og (B) T3M-4-celler. Påvisning av a-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting.
(A) S2.028 og (B) T3M-4-miR200c og respektive vektorstyre transfekterte cellelysatene ble separert ved SDS-agarosegelelektroforese og utsatt for western blot ved anvendelse av et anti-MUC16 antistoff (venstre paneler). Band intensiteten ble kvantifisert ved densitometri og analysert ved hjelp av ImageJ programmet (høyre panel). Betydelige reduksjoner av både høy og lav molekylvekt MUC16 protein isoformene ble observert i MIR-200c uttrykker S2.028 (A) og T3M-4-celler (B) enn sammenlignet med vektorkontrollceller. α-tubulin ble brukt som en lasting kontroll.
MIR-200C mål transcriptionally membranbundne slimstoffer MUC4 og MUC16
Vi observerte også en betydelig reduksjon av både MUC4 og MUC16 mRNA nivåer i miR200c uttrykker cellelinjer. MUC4 transkripsjoner ble redusert 4,18 og 8,50 ganger i S2.028-miR200c og T3M-4-miR200c henholdsvis (figur 4A og 4B) sammenlignet med kontrollceller. MUC16 transkripsjoner ble redusert 4,68 og 4,82 ganger i S2.028-miR200c og T3M-4-miR200c henholdsvis sammenlignet med kontrollceller (Figur 4C og 4D). Disse funnene tyder på at Mir-200c regulerer uttrykket av onkogen MUC4 og MUC16 transkripsjon og oversettelse.
QRT-PCR analyse av MUC4 (A og B) og MUC16 (C og D) ble utført i vektor kontroll og MIR -200c transfektert S2.028 (A og C) og T3M-4-celler (B og D). Den relative uttrykk for MUC4 og MUC16 ble evaluert ved to
-ΔΔCt metode med GAPDH som en intern kontroll. Mir-200C uttrykke celler (S2.028 og T3M-4) viste signifikant reduserte nivåer av MUC4 mRNA forhold til vektorkontrollceller (A og B). Uttrykk for MUC16 transkripsjon ble redusert i MIR-200c uttrykke S2.028 og T3M-4 celler (C og D). Alle målinger ble utført i triplikat. Økning av transkripsjonsnivåer enn vektorkontroll ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. En p-verdi mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Prediksjon av MIR-200c bindende sekvenser på MUC4 og MUC16
Potential MIR-200c rettet mot regioner i MUC4 og MUC16 transkripsjoner ble identifisert ved hjelp av RegRNA mikroRNA målet prediksjon webserveren (https://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php). RegRNA miRNA mål prediksjon identifisert høy sannsynlighet for MIR-200c binding til koding sekvenser av MUC4 mellom basepar 820-842 (Exon-1) (figur 5A) (Figur S3) og ti ulike regioner, inkludert ni forskjellige eksoner innenfor MUC16 mRNA sekvens (figur 5B) (Figur S3). Disse data førte oss til å finne ut om MIR-200c kan direkte målrette MUC4 og MUC16 transkripsjoner innenfor de oversatte regionene.
Mulig MIR-200c rettet mot regioner i MUC4 og MUC16 ble identifisert ved hjelp av RegRNA mikroRNA målet prediksjon webserveren ( https://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php). A, RegRNA miRNA mål prediksjon viser at Mir-200c binder mellom basepar 820-842 i første ekson av MUC4. B, I MUC16 mRNA blir MIR-200c spådd å binde ni forskjellige eksoner inkludert E1, E3, E19, E39, E44, E49, E54, E64 og E73. Tallene angir regionen mRNA som samhandler med MIR-200c.
MIR-200c er rettet mot de kodende sekvenser av MUC4 og MUC16 direkte
Vi evaluerte binding av MIR-200c til antatte målet sekvens ved å klone de regioner som inneholder menneskelige MUC4 og MUC16 kodende sekvenser inn i pMIR-luciferase reporter vektor (pMIR-MUC4 og MUC16 vekt). Negative kontroller ble produsert der pMIR-MUC4 og MUC16 sekvensene ble mutert ved de antatte bindingsseter for MIR-200c og slimstoffer (pMIR-MUC4 og MUC16 mt) (Figur 6A). S2.028 og T3M-4 /MIR-200C-celler ble transient transfektert med plasmid-DNA som koder for vektor alene, villtype MUC4 og MUC16 sekvenser i vektoren, og mutant typen MUC4 og MUC16 sekvenser i vektoren. Vi observerte at luciferaserapportørplasmid aktivitet ble betydelig undertrykt for både MUC4 og MUC16 i S2.028 og T3M-4 MIR-200C celler transfektert med villtypesekvensen vektorer i forhold til vektorkontroll transfekterte celler (*** p 0,0001, MUC4-wt , MUC16-wt vs vektor kontroll) (figur 6B-E). Men cellene transfektert med mutant sekvens inneholder vektorer viste signifikant økt luciferase reporter aktivitet (*** p 0,0001, MUC4-wt vs MUC4-mt, MUC16-wt vs MUC16-mt)., (Figur 6B-E)
(A) villtype og muterte sekvenser av MUC4 og MUC16 ble klonet inn i pMIR-Luciferase vektor (pMIR-MUC4 vekt og MUC16 wt) og (pMIR-MUC4 mt og MUC16 mt) hhv. Vektorer som uttrykker pMIR-Luc, pMIR-MUC4 wt, pMIR-MUC16 wt, pMIR-MUC4 mt og pMIR-MUC16 mt ble transfektert inn S2.028miR-200c (B og D) og T3M-4miR-200C celler (C og E) og luciferaseaktivitet ble kvantifisert 48 timer etter transfeksjon. Resultatene ble uttrykt som relativ luciferaseaktivitet (gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige bestemmelser). Den p-verdi ble fastsatt ved hjelp t-test (
Diskusjoner
I denne studien demonstrerer vi for første gang at en MODIR-200C målene høy molekylvekt mucin glykoproteiner av målretting deres kodende sekvens for nedbrytning eller translasjons-inhibering. Nærmere bestemt er rettet mot MIR-200c MUC4 og MUC16 ekson-sekvenser for å regulere mRNA og proteinnivåene for hvert av disse slimstoffer. Vi har vist at MIR-200c er differensielt uttrykt i kreft i bukspyttkjertelen celler. Yu et al observert en signifikant høyere overlevelse i bukspyttkjertelen kreftpasienter med høyere nivåer av MIR-200c sammenlignet med de med lavere nivåer av MIR-200c [10]. Tidligere arbeid har også vist at kreft i bukspyttkjertelen celler overekspresjon MIR-200c utstillings redusert invasjon og økt nivåer av E-cadherin mRNA, noe som tyder på at MIR-200c spiller en hemmende rolle i bukspyttkjertelkreft vekst og invasjon [10]. Overekspresjon av MIR-200C økte frekvensen av spredning inne farge-2, PANC-1 og KP-3 kreft i bukspyttkjertelen celler [10], men vi har observert redusert celledeling av S2.028 MIR-200C uttrykke celler, noe som tyder på at cellevekstegenskaper forskjellig regulert av MIR-200c er kontekstavhengig. MiR-200c er blitt beskrevet som en kraftig mester regulator av epitelial-til-mesenchymal overgang i bryst- og eggstokk-kreft celler gjennom å endre ekspresjonen av ZEB1 og E-cadherin ved å binde seg til 3′-UTR og kjøre degradering eller blokkere translasjon av mål-mRNA [11-14]. Restaurering av MIR-200c uttrykk i svært aggressiv brystkreft og eggstokkreft celler betydelig redusert invasjon, migrasjon og narkotika motstand av disse krefttypene [30,31]. Disse rapportene tyder på at innføringen av MIR-200c til kreftceller kan reversere tumorprogresjon og gi en ny behandlingsstrategi
Et flertall av rapportene viser at mirnas målrette ikke-kodende 3’UTR av mRNA.; Imidlertid har de siste rapporter vist at mirnas kan også målrette sekvenser av pattedyr gener. Vi rapporterer her at Mir-200C mål ekson sekvensene i utskrifter av høy molekylvekt slimstoff glykoproteiner MUC4 og MUC16 og reduserer mRNA og protein uttrykk. Tilsvarende, Huang et al, rapporterte at MIR-181a er rettet mot et stort antall av sink finger-gener ved å binde seg til sitt kodende sekvenser [32] og Duursma et al rapporterte at MIR-148 mål humant DNA-metyltransferase 3b (DNMT3b) aminosyre-kodende regioner [ ,,,0],33]. La-7 miRNA er rettet mot den kodende region av miRNA behandling enzymet Dicer [34]. Murine Nanog, OCT4 og Sox2 gener inneholder mange bindingsseter i ekson kodende sekvenser for naturlig forekommende mirnas [35]. Disse rapportene tyder på at mirnas målrette bestemte genet familier i kodende områder.
Regulering av MUC4 og MUC16 av MIR-200c kan være gjennom virkninger på enten transkripsjon eller oversettelse. I begge cellelinjer undersøkt her, ble MUC16 proteinnivåer reduseres i større grad enn MUC4. Denne økte målretting av MUC16 ved MIR-200c kan være på grunn av tilstedeværelsen av ti forskjellige MIR-200c bindende regioner i MUC16 mRNA sammenlignet med den eneste bindende region i MUC4-kodingssekvensen, øke muligheten for at antallet målrettet mot områder i en transkripsjon påvirker følsomheten som transkripsjon til miRNA regulering.
Nylig Ponnusamy et al rapporterte at overekspresjon av MUC4 resultater i epitelial til mesenchymale overgang gjennom nedregulering av E-cadherin og økt kreftcelle migrasjon og invasjon i eggstokkreft celler [36]. Disse resultatene er i tråd med vår studie, som viser at overekspresjon av mesenchymale til epitelial fremme MIR-200c ned regulerer ZEB1 og MUC4 i kreft i bukspyttkjertelen celler.
MUC16 er sterkt overuttrykt i eggstokkreft og moderat overexpressed i bukspyttkjertelkreft , men rollen MUC16 i bukspyttkjertelkreft progresjon har ikke blitt grundig undersøkt. Den betydelig redusert nivå av MUC16 observert i MIR-200c overekspresjon celler, sammen med det godt dokumentert rollen MIR-200c i flere stadier av kreft progresjon antyder at MUC16 kan ha en rolle i bukspyttkjertelkreft cellevekst og metastase. Disse studiene viser at oppregulering av slimstoffer og nedregulering av MIR-200c forbedre kreftcellen ondartede egenskaper, og dermed forårsake kreft i bukspyttkjertelen vekst og metastasering.
Flere studier har vist at avvikende og økt uttrykk av MUC4 og MUC16 skjer i løpet av bukspyttkjertelkreft progresjon til metastase [17-19,25]. Nylig Mohr et al viste MIR-200c uttrykk ble redusert i primær bukspyttkjertelen tumorvev i forhold til enkelte metastaser [37]. Disse resultatene støtter generelt hypotesen om at svingninger i MIR-200c bidra til regulering av uttrykk for MUC4 og MUC16 under bukspyttkjerteltumorprogresjon og metastaser.
I konklusjonen, presenterer vår studie første bevis på at MUC4 og MUC16 er regulert på post-transkripsjonsnivået av en miRNA, MIR-200c, som direkte retter seg mot MUC4 og MUC16 innenfor sine aminosyre kodende områder. Disse resultatene indikerer at Mir-200c kan ha en potensiell hemmende rolle i kreft i bukspyttkjertelen vekst og metastasering og ytterligere studier er nødvendig for å avgrense regulatoriske forhold mellom membranbundne slimstoffer og MIR-200c.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
QRT-PCR analyse av ZEB1. Overekspresjon av MIR-200C betydelig redusert ekspresjon av ZEB1 i både (A) S2.028 og (B) T3M-4-celler. Økning av transkripsjonsnivåer enn vektorkontroll ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. En p-verdi på mindre enn 0,05 anses å være statistisk signifikant
doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s001
(EPS)
Figur S2.
celleproliferasjonsanalyse. S2.028 (A) og T3M-4 (B) (MIR-200C og vektorkontroll) celler proliferasjon ved forskjellige tidspunkter ble målt ved hjelp av metylenblått-analyse. Two Way ANOVA ble benyttet for å oppnå statistisk signifikans (***, p 0,001; ns, ikke-signifikant)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s002
(EPS)
Figur S3 .
Prediksjon av MIR-200c bindingsseter i slimstoffer. Potensielle MIR-200C bindingssteder i membranbundne slimstoffer (MUC4 og MUC16) transkripsjoner ble identifisert ved hjelp av RegRNA mikroRNA målet prediktor webserveren
doi:. 10,1371 /journal.pone.0073356.s003
(EPS)
Tabell S1.
Liste over oligonukleotider brukes til MIR-200c uttrykk og luciferase assay system.
doi: 10,1371 /journal.pone.0073356.s004 plakater (docx)
Takk
Vi takker Dr. David Kelly for sakkyndig teknisk bistand i luciferase assay
.
