Abstract
Våre tidligere studier tyder på at Th17 celler akkumuleres i tumorvev og korrelerer med tilbakefall av livmorhalskreftpasienter. Men fortsatt kilden til økt tumor infiltrere Th17 celler dårlig forstått. Vi undersøkte forekomsten, fenotype og trafficking eiendom Th17 celler hos pasienter med livmorhalskreft. Våre resultater viste at Th17 celler svært samlet innenfor tumorvev i en aktivert fenotype med betydelig økt uttrykk av CCR6. På tilsvarende nivå av CCL20 i tumorvev var signifikant høyere enn i ikke-tumor og normal kontroll vev, og sterkt positivt assosiert med Th17-celler. Videre, in vitro migrasjonsanalyse viste CCL20 måtte effektiv kjemotaksen til sirkulerende Th17-celler. I konklusjonen, er Th17 celler rekruttert inn i tumorvev fortrinnsvis gjennom CCR6-CCL20 sti, som kan tjene som en roman terapeutisk mål for livmorhalskreft
Citation. Yu Q, Lou XM, Han Y (2015) Fortrinnsrett Rekruttering av Th17 celler til livmorhalskreft via CCR6-CCL20 Pathway. PLoS ONE 10 (3): e0120855. doi: 10,1371 /journal.pone.0120855
Academic Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 15 oktober 2014; Godkjent: 27 januar 2015; Publisert: 13 mars 2015
Copyright: © 2015 Yu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste kreftformen hos kvinner over hele verden [1]. Det er økende bevis for at CD4
+ T-hjelper (Th) celler spiller en viktig rolle i å opprettholde immunresponser mot kreft [2, 3]. Th17-celler er en ny undergruppe av interleukin IL-17-produksjon av CD4
+ T-celler [4] som har vist seg å spille en avgjørende rolle i inflammasjon og autoimmune sykdommer [5-7], mens også akkumuleres i tumorer så som leverkreft [8], magekreft [9], lungecancer [10], og spiserøret karsinom [11]. Vår tidligere studie fant også økt antall Th17 celler i tumor vev av livmorhalskreft og deres uavhengig forening med tilbakefall etter operasjon [12]. Disse studiene tyder på at Th17 celler kan bidra til immunpatogenese av mange typer kreft.
Før T-celler kan utøve sine effekter på kreftcelle, må de nå målområdet. Migrering av T-celler til målstedet er en flertrinnsprosedyre, hvori signalene fra kjemokiner /kjemokinreseptorer spille en avgjørende rolle [13]. Ulike CD4
+ T-cellepopulasjoner i mennesker og mus viser tydelige mønstre av chemokin reseptor uttrykk. I svulstens mikromiljø, Th1-celler uttrykker CCR5 og CXCR1, Th2-celler uttrykker CCR4 og CCR8, mens regulatoriske T-celler i hovedsak uttrykker CCR4 [14]. Nyere studier tyder på at Th17 celler uttrykker CCR2, CCR4, og CCR6 i voksent menneske perifere blod [15, 16]. Men trekk determinanter for Th17-celle migrasjon inn i tumorvev av livmorhalskreftpasienter er fortsatt ukjent. I denne studien fant vi at CCR6-CCL20 aksen bestemmer i hovedsak migrasjon av sirkulerende Th17 celler i tumorvev i livmorhalskreftpasienter.
Pasienter og metoder
Etikk erklæringen
studien protokollen ble godkjent av Institutional Review Board of Hangzhou Obstetrics and Gynecology Hospital. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra pasienter i henhold til Helsinkideklarasjonen.
Fag
Totalt 35 pasienter med livmorhalskreft, som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved første Folkets sykehus i Hangzhou mellom 2012 og 2013, ble inkludert i studien. Matchet perifert blod (PB), tumorer, og tilsvarende ikke-tumorvev ble oppnådd fra disse pasientene. Ingen av pasientene fikk anticancerterapi eller andre medisinske inngrep. Pasienten egenskaper (slik det er angitt i tabell S1).
Isolering av PBMC, TIL, og NIL
Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert ved Ficoll-Hypaque (Sigma-Aldrich , St. Louis, MO) densitetsgradient separasjon. Tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL) og ikke-tumor-infiltrerende lymfocytter (NIL) ble isolert som beskrevet av Pang og kollega [17]. I korte trekk ble vev skåret i små stykker og inkubert i en enzymblanding inneholdende 0,05% kollagenase IV (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 0,001% DNase I (Sigma-Aldrich) i 1 time. Dissosierte vev ble deretter bakken gjennom en 70-mikrometer sil, og mononukleære celler ble oppnådd ved tettshetsgradient separasjon ved hjelp av Ficoll-Hypaque.
Flow cytometri
PBMC, TIL og NIL ble farget med fluorochrome- konjugerte monoklonale antistoffer mot human CD3, CD4, CD45RO, HLA-DR, CCR2, CCR4, CCR6, CD11 a, CD49d, CD103, PD-1, granzyme B, og IL-17 (BD PharMingen, San Diego, CA). Celler ble stimulert til å skille ut cytokiner i 4 timer med 100 ng /ml forbolmyristatacetat (PMA), 1 ug /ml ionomycin (Sigma-Aldrich) og 2 uM monensin (Enzo, Plymouth, PA). For intracellulær farging ble cellene permeabilized og festes ved hjelp Cytofix /Cytoperm (BD PharMingen) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter farging ble tre- eller fire-farge flowcytometri utført ved hjelp av LSR II strømningscytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA), og data ble analysert ved hjelp FlowJo programvare (Tre Star, Inc., Ashland, Oregon).
immunhistokjemisk farging
Parafin-embedded, formalinfiksert levervev ble kuttet i 4-mikrometer seksjoner. Antigen gjenfinning ble utført via Trykkoking i 10 minutter i citrat-buffer (pH 6,0). Antistoffer av mus anti-human foxp3 (fortynning 1: 200; Abcam, Cambridge, UK) og kanin-anti-humant IL-17 (fortynning 1: 150; R CCL17: CCA GGG ATG CCA TCG TTT (fremover), GGT GGA GGT CCC AGG Tags TC (bakover); CCL20: GAC ATA GCC CAA GAA CAG AAA (fremover), GAC AAG TCC AGT GAG GCA CAA (bakover); og CCL22: GGA GGC AAA GAG Tags GGT GTA AT (fremover), TCA GCC AGA AAG GCA Tags ATA GA (bakover). Prøvene ble kjørt i tre eksemplarer, og deres relative uttrykk ble beregnet i følgende formel bruker GAPDH som endogene kontroller:. 2
-ΔΔCt
Chemotaxis analysen
Migrasjon analyser ble utført på PBMC hjelp transwellsystemet, som tidligere beskrevet [18]. PBMC (1 x 10
6) i et volum på 200 ul ble tilsatt til de øvre brønnene (insert porestørrelse, 5 um; Millipore, Billerica, MA). Menneske kjemokiner (CCL20, CCL21 og CCL22, 100 ng /ml av hver, alt fra R D System, Minneapolis, MN), eller supernatanten av HeLa-celler, Siha celler eller C-33A-celler (Cell Research Institute of Chinese Academy of Sciences, ble Shanghai, Kina) tilsatt til det nedre kammer i et volum på 900fxl. De HeLa-celler (HPV-18-infiserte cervical-cellelinjer), Siha celler (HPV-16-infiserte cervikale-cellelinjer) og C-33A-celler (HPV-negative livmorhalskreft-celler) ble dyrket i RPMI-1640 medium supplementert med 10% FCS i en fuktig 5% CO2 ved 37 ° C. Supernatanten av kreftceller som brukes for kjemotaksi-analysen ble oppsamlet etter 3 til 5 dager gammel kultur. Antistoffer mot CCL20, CCL21 og CCL22 (R 0,05.
Resultater
Distribusjon av Th17 celler hos pasienter med livmorhalskreft
For å studere fordelingen av Th17 celler på tumorlokalisering, NIL og TIL ble isolert fra paret nontumor og tumorvev i 35 pasienter med livmorhalskreft og preget via flowcytometri (fig. 1a). Som forventet, hyppigheten av Th17 celler i svulstvev, som representerer 11,49 ± 1,19% av CD4
+ T-celler, var betydelig høyere enn i ikke-svulstvev (3,68 ± 0,48%,
P
0,001), og perifert blod fra pasienter med cervikal cancer (4,96 ± 0,72%,
P
0,01) og friske donorer (1,67 ± 0,19%,
P
0,001; fig . 1B). I tillegg er andelen av sirkulerende Th17 celler var også høyere hos pasienter med livmorhalskreft sammenlignet med friske donorer (
P
0,001). Immunhistokjemisk farging også observert betydelige Th17 celler i svulstvev av livmorhalskreft, enda høyere enn regulatoriske T-celler (tregs) i det samme miljøet (Fig. 1C). Disse resultatene tyder på at kollektivt Th17-celler er sterkt anriket i pasienter med cervikal cancer, spesielt i tumorvev.
Th17-celler ble gated fra CD3
+ T-celler ved flow cytometri. (A) Representant IL-17 uttrykk profiler i CD4
+ T-celler fra de fire undersøkte grupper. Prosentene representerer frekvensen for Th17-celler blant CD4
+ T-celler. (B) Statistisk analyse viser at frekvensen for Th17-celler var høyere hos pasienter med cervikal cancer, særlig blant tumor-infiltrerende lymfocytter (n = 35). **
P
0.01, ***
P
0,001. (C) Representative bilder for Th17-celler (IL-17
+) og Tregs (foxp3
+) infiltrasjon i livmorhalskreft vev fra samme pasient. Immunostained celler (brune, som markeres med svart pil) og tumorceller (blå). Forstørrelse, × 100.
Videre er utbredelsen av Th17 celler var høyere i avansert stadium svulster enn at i tidlig stadium svulster (8,12 ± 1,31% i FIGO jeg vs. 14,18 ± 2,78% i FIGO II vs 15,50 ± 1,73 i FIGO III, fig. 2). Men det var ingen signifikante forskjeller i forekomsten av Th17 celler for alder, HPV status, tumorstørrelse, infiltrasjon dybde, lymfeknute status, lymfe-vaskulære rommet invasjon og tumor differensiering (fig. 2).
Sammenligning av hyppigheten av tumor-infiltrerende Th17 celler i livmorkreftpasienter på forskjellig alder, HPV status, tumor størrelse, FIGO stadium, infiltrasjon dybde, lymfeknute status, lymfe-vaskulære Space Invasion (Wire) og tumor differensiering. Statistisk analyse viste at hyppigheten av Th17 celler i tumorvev ble økt fra FIGO I til FIGO III, men ikke forbundet med de andre kliniske parametere. *
P
0,05.
fenotypiske egenskaper av tumor-infiltrerende Th17 celler
Vi deretter analysert uttrykket av markører knyttet til aktivering /effektor funksjon (CD45RO og HLA-DR) og immunsuppresjon (granzyme B og PD -1). Tumor-infiltrerende Th17 celler uttrykte høy CD45RO, HLA-DR, men lav granzyme B og PD-1 (fig. 3A). Granzyme-B-avhengig cytolyse [20] og B7-H1 /PD-1 veien [21] bidra til immun-suppresjon i svulsten mikromiljøet. Resultatene indikerte at tumor-infiltrerende Th17 celler utstilt en aktivert minne fenotype (CD45RO
+ HLA-DR
+), men kan ikke formidle effektorfunksjon gjennom granzyme B eller B7-H1 /PD-en sti (granzyme B
– /PD-1
-.)
(A) Representative uttrykk profiler av CD45RO, HLA-DR, granzyme B og PD-1 i tumor-infiltrerende Th17 celler. Prosentene representerer frekvensene av ulike markører i Th17 celler. (B) Representative uttrykk profiler av CCR4, CCR6 og CD49d for Th17-celler fra perifert blod (lang stiplet linje), ikke-tumor (prikket linje) og tumorvev (heltrukket linje). Prosentene representerer frekvensene av ulike markører på tumor infiltrere Th17 celler. (C) Statistisk analyse av overflateekspresjon av CCR4, CCR6, CD49d på Th17 celler fra perifert blod, ikke-tumor og tumor-vev (n = 25). *
P
0,05, **
P
0.01, ***
P
0,001.
lymfocyttmigrering skjer gjennom en flertrinnsprosess, der chemokine /chemokin reseptor signalisering er en viktig begivenhet, etterfulgt av integrin-mediert vedheft til karveggene [13]. Derfor vi videre analysert overflateuttrykk kjemokinreseptorer (CCR2, CCR4 og CCR6) og inte (CD49d, CD11 og CD103) på Th17 celler. Tumor-infiltrerende Th17-celler uttrykte høye nivåer av CCR4 (cPBMC: 38,83 ± 3,90%, NIL: 42,76 ± 2,84%, TIL: 57,61 ± 2,99%;
P
0,001 og mindre enn 0,01 for TIL vs. cPBMC og vs. henholdsvis NIL,), CCR6 (cPBMC: 22.17 ± 2.04%, NIL: 42.89 ± 3.23%, tIL: 72,97 ± 2,45%;
P
0,001 for tIL vs. cPBMC og vs. NIL), og CD49d (cPBMC: 63,13 ± 3,74%, NIL: 56.59 ± 3.10%, tIL: 74,24 ± 2,69%;
P
0,05 og 0,001 for tIL vs. cPBMC og vs. NIL , henholdsvis) (fig. 3B og 3C), men ikke CCR2, CD103, og CD11 a (data ikke vist). De uttrykte målsøkende molekyler kan være assosiert med Th17-celle migrasjon og oppbevaring innen svulst [22].
Sammenslutning av chemokin nivåer med intratumorale Th17 celler
Fordi Th17 celler sterkt uttrykt CCR6 og CCR4, vi hypotese at Th17 celler kan migrere som respons på CCL20, CCL22 og CCL17. Vi er fast bestemt uttrykk for CCL20, CCL22 og CCL17 ved real-time PCR. Vi fant signifikant høyere mRNA uttrykk av CCL20 i tumorvev sammenlignet med ikke-tumorvev og normale kontroll vev (
P
. 0,01, figur 4A). Videre ble det observert en sterk positiv sammenheng mellom forekomsten av Th17 celler og intra-tumoral ekspresjon av CCL20 (R = 0,795,
P
0,001, Fig. 4C). Disse data antydet at CCL20 er et viktig signal å megle handel med Th17 celler til svulster. Tvert imot, vi har ikke funnet økt uttrykk av CCL17 og CCL20, de to spesifikke ligander av CCR4, i tumorvev (fig. 4A). Videre regresjonsanalyse bare funnet svak korrelasjon av Th17 celler med CCL22 (R = 0,385,
P
0,05, Fig. 4D), men ikke med CCL17 (
P
0,05, fig. 4B), i den samme tumormikromiljøet. Resultatene kollektivt indikerer at CCR4-CCL17 /CCL22 akse kan ikke være hovedansvarlig for Th17-celle migrasjon.
(A) Real-time PCR av chemokine CCL17, CCL20 og CCL22 i tumor (T) og ikke- tumor (nT) regioner av pasienter med kreft i livmorhalsen og i normal kontroll (NC). Verdien ble normalisert til GAPDH, multiplisert med 10
5, og log transformert. *
P
0,05, **
P
0,01. (B, C, D) Korrelasjoner av chemokin-CCL17 (B), CCL20 (C) og CCL22 (D) med frekvens av tumor-infiltrerende Th17-celler. Statistisk analyse viste en sterk korrelasjon på CCL20 med Th17 celler i svulsten.
chemokin effekter på Th17 celle rekruttering
Betydelige chemotactic svarene av sirkulerende Th17 celler til rekombinant humant CCL20 ble observert i dose -avhengig måte (fig. 5A). Videre en nøytraliserende monoklonalt antistoff mot CCL20 hadde markert blokkert CCL20-indusert migrering av Th17-celler (
P
. 0,001, figur 5A). Selv CCL17 og CCL22 kan også indusere migrering av Th17 celler, var effekten betydelig svakere enn CCL20 gjorde (migrasjonsindeks i konsentrasjon på 100 ng /ml: CCL20, 45,5 ± 10,6 vs. CCL17, 19,1 ± 6,5 og vs. CCL22, 26,1 ± 7.9, både
P
0,001 fig. 5A). For ytterligere å avgjøre om tumor utskilt chemokiner hatt en effekt på Th17 celle rekruttering, chemotaxis analysen bruker kultursupernatanter fra livmorhalsen cellelinjer ble utført. De HeLa-celler er HPV-18 infiserte livmorhalsen, Siha celler er HPV-16 infiserte livmorhalsen, og C-33A-celler er HPV-negative livmorhalskreftceller. Alle de tre i livmorhalsen kan svært gjemme CCL20 med høyeste grad av CCL20 av HeLa-celler (fig. 5B og 5C), og indusert betydelig migrasjon av Th17-celler (fig. 5D). Dette kan være effektivt blokkert av antistoff mot CCL20 alene eller i kombinasjon med CCL17 og CCL22 (
P
0,001), men betydelig mindre effektivt av antistoff mot CCL17 eller CCL22 (figur 5B.). Disse resultatene tyder på at kollektivt CCL20 kan indusere effektiv migrering av Th17 celler inn i tumorvev.
migrering ble utført i et Transwell system. (A) Th17-celler vandrer i respons til rekombinant human CCL17, CCL20 og CCL22 på doseavhengig måte (n = 5). Spesifikke antistoffer mot chemokiner hemme Th17 cellemigrasjon ***
P
0,001. (B og C) Expression of CCL20 av HeLa, Siha, og C-33A celler oppdages ved hjelp av Real-time PRC (B) og ELISA (C). Alle de tre i livmorhalsen kan svært gjemme CCL20 med høyeste grad av CCL20 av HeLa-celler. (D) Th17-celler også migrere mot kultursupernatanter av HeLa, Siha, og C-33A-celler, som kan effektivt blokkert av antistoff mot CCL20 alene eller i kombinasjon med CCL17 og CCL22, men betydelig mindre effektivt av antistoff mot CCL17 eller CCL22 ( n = 3). *
P
0,05, **
P
0.01, ***
P
0,001.
Diskusjoner
Som rapportert i andre solide tumorer [8, 10, 11, 19, 23-25], denne studien viste at betydelige Th17 celler, viser en aktivert minne fenotype, er konsentrert innenfor livmorhalskreft vev. Imidlertid er rollen til Th17-celler i kreft immunitet forblir blandet. Samle bevis indikerer at selv om kreftpasienter viser en generalisert immunsuppressive status, kan inflammatorisk reaksjon på svulststedet fremme tumorvekst og progresjon. Opprettholdelse av kronisk betennelse er i stor grad oppnådd gjennom positive tilbakemeldinger looper, som inkluderer betennelsesceller som produserer cytokiner som induserer chemokin syntesen i maligne og stromale celler som fører til langvarig rekruttering av inflammatoriske celler i svulsten mikromiljøet [26]. Th17 celler er en av de mest kritiske immuncelleundergrupper i denne henseende, og således har tumor-fremmende effekt. Hos pasienter med leverkreft, tykktarmskreft eller spiserørskreft, ble høye nivåer av intratumorale Th17-celler funnet å være positivt assosiert med dårlig prognose [8, 24, 27]. På den annen side, Th17 celler noen ganger kan gi viktig hjelp for å øke cytotoksiske immunitet og således utøve tumorundertrykkende effekter [28, 29]. Vår tidligere studie har vist at høye intratumorale Th17 celler spår redusert lokalt tilbakefall hos pasienter med livmorhalskreft [12], i tråd med tidligere rapporter i eggstokkreft [25] og føflekkreft [30].
Kildene til Th17 celler i livmorhalskreft vev kan omfatte handel med sirkulerende Th17 celler til svulster og lokalt indusert Th17 celler. Migreringen av T-celler er tett regulert av chemokine /chemokine reseptorinteraksjon [31]. Tidligere studier har vist at rekruttering av Th17 celler er styrt av flere veier, inkludert CCR2-CCL2, CCR4-CCL17 /CCL22, og CCR6-CCL20 [15, 16, 19, 32]. I denne sammenheng har vi funnet smugling av sirkulerende Th17 celler inn i tumorvev livmorhalskreft var fortrinnsvis gjennom CCR6-CCL20 veien. Denne konklusjonen er basert på to funn. Først, CCL20 hadde markert forhøyet ekspresjon i tumorvevet og sterkt assosiert med forekomsten av Th17-celler i den samme mikromiljøet. For det andre, det sirkulerende Th17 fra pasienter med cervikal cancer høyt uttrykt CCR6, og selektivt å migrere som respons på CCL20 in vitro. I det siste, var CCR6 hovedsakelig involvert for å være ansvarlig for den inflammatoriske rekruttering av Th17 celler. Fox eksempel, er CCR6 avgjørende for optimal rekruttering av Th17 celler til områder av Th17-mediert inflammasjon i eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) [7]. Men samler nyere funn viser at CCR6 på Th17-celler spiller også en avgjørende rolle i tumorutvikling [8, 24]. Det er godt akseptert at effekten av immunceller på tumorutvikling bestemmes av ikke bare deres pro- eller anti-potensial, men også passende lokalisering [33]. Alle disse resultatene, sammen med våre data, viser Th17 celle-uttrykt CCR6 er funksjonell og spiller en viktig rolle i utviklingen av livmorhalskreft. Dessuten, selv om CCR4 kan også være relatert til Th17 cellemigrasjon, er effekten mye svakere enn CCR6 ifølge mindre uttrykk for CCR4, lavere intratumorale nivåer av CCL17 og CCL22, og svakere chemotacitc svar på CCL17 og CCL22.
i konklusjonen, vi viste her at CCR6-CCL20 veien er fortrinnsrett kjemotiltrekkende for smugling av sirkulerende Th17 celler inn svulstvev av livmorhalskreft. Resultatene utvide vår forståelse av mekanismen av livmorhalskreftutvikling, og gi en potensiell strategi for behandling av livmorhalskreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Pasienter Kjennetegn
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120855.s001 plakater (DOC)
