Abstract
For å undersøke den prognostiske betydningen av
TGFβR2
uttrykk og kjemoterapi i kinesisk ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter,
TGFβR2
uttrykk NSCLC ble analysert
i silico
bruker Oncomine database, og deretter analysert med kvantitativ RT-PCR i 308 NSCLC biopsier, 42 av disse var forbundet med tilstøtende ikke-neoplastiske vev. Våre resultater viser at
TGFβR2
uttrykk var også økt hos NSCLC biopsier i forhold til normale vevsprøver og korrelert med dårlig prognose.
TGFβR2
uttrykk var også signifikant korrelert med andre kliniske parametre som tumor differensiering, invasjon av lungehinnen, og kjemoterapi. Videre ble total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS) økt hos pasienter med lav
TGFβR2
uttrykke NSCLC og som hadde gjennomgått kjemoterapi. Dermed er høy uttrykk for
TGFβR2
en betydelig risikofaktor for redusert OS og DFS i NSCLC pasienter. Dermed
TGFβR2
er en potensiell prognostisk svulst biomarkør for kjemoterapi
Citation. Han Y, Jia C, Cong X, Yu F, Cai H, Fang S, et al. (2015) økt uttrykk av
TGFβR2
er knyttet til kliniske resultatet av ikke-småcellet lungekreft pasienter behandlet med kjemoterapi. PLoS ONE 10 (8): e0134682. doi: 10,1371 /journal.pone.0134682
Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, USA
mottatt: May 13, 2015; Godkjent: 24 juni 2015; Publisert: 07.08.2015
Copyright: © 2015 Han et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (81371595, 81372175, 81301993, 81472501, 81201535, 81472202 og 81302065), Science Foundation of Shanghai Nature ( 12ZR1436000), Shanghai Science and Technology Commission (14441901300, 14DZ1940606), Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (XBR2013112, 2013SY036) og Youth Innovasjon Promotion Association, Chinese Academy of Sciences (Y219J11311).
Konkurrerende interesser : forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lung karsinom er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet over hele verden, sto for 1,37 millioner dødsfall årlig [1-3].. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den vanligste typen primær lungekreft, sto for nesten 80% av lungekreft [4]. Selv om betydelige fremskritt har skjedd i vår forståelse av sykdomsprosessen i løpet av de siste tiårene [5,6], er den viktigste behandlingsstrategi fortsatt kirurgisk reseksjon, kjemoterapi og strålebehandling [7-9]. Men selv i tilfelle av komplett reseksjon, er kurativ effekt ikke tilfredsstillende og NSCLC pasienter fortsatt står overfor risikoen for tilbakefall og metastase [10,11].
Håpet for komplett molekylær analyse av kreft hos mennesker er til slutt til forbedre forvaltningen av pasientene. Fremskritt innen genomikk og proteomikk har generert mange kandidat markører med potensiell klinisk verdi [12]. Derfor, om biomarkører eksistere som ville fungere som prediktive faktorer for lungekarsinom eller benyttes i beslutningsprosessen for klinisk behandling av pasienter er for tiden under undersøkelse som alternativer for behandling forhånd. Videre forstå de molekylære egenskapene til lungekreft ville hjelpe til målrettet terapi utvikling.
Komponenter av transformerende vekstfaktor-beta (TGF-β) familie er ofte endres i utviklingen av ulike kreft hos mennesker. TGF-β er en pleiotropisk cytokin, som virker som en tumor suppressor eller svulst promoter avhengig av det cellulære mikromiljø [13]. TGF-beta-reseptor type-2 (TGFβR2) er den ligandbindende reseptor for alle medlemmer av TGF-β familie [14-16]. TGFp signaler formidles av et aktivert kompleks av TGFβR1 og TGFβR2 [17]. TGF-β ligand binder seg først og fremst for å TGFβR2 på plasmamembranen, noe som resulterer i dannelsen av et kompleks mellom TGFβR1 og TGFβR2. TGFβR2 phosphorylates TGFβR1, og aktivert TGFβR1 phosphorylates nedstrøms mål, Smad2 og Smad3. Fosforylert Smad2 og Smad3 danner et kompleks med Smad4, som translocates til kjernen og regulerer mål-gen-ekspresjon [18,19]. Derfor unormalt i ethvert medlem av TGF-β eller Smad familien ofte dypt forstyrre TGF-beta signalveien [20,21].
Enten et gen signatur kan forutsi klinisk utfall av NSCLC, inkludert prognose og respons kjemoterapi, er fortsatt uklart. Her ble Oncomine databasen brukes til å avsløre differensial uttrykk spesielt av TGFβR2 i NSCLC. Uttrykket av TGFβR2 ble senere bekreftet av real-time PCR hos NSCLC biopsier fra en kohort av kinesiske pasienter og prognostisk betydning ble vurdert.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studien ble gjennomgått og godkjent av etisk komité Jilin University (Jilin, Kina). Hver deltaker gitt sitt skriftlige samtykke til å delta i denne studien og de etiske komiteer godkjenne samtykke prosedyren.
Oppsett av server for online overlevelse beregning
TGFβR2
mRNA uttrykk ble undersøkt hos NSCLC vevsprøver (n = 187) i TCGA databasen gjennom Oncomine Platform (https://www.oncomine.org). Data ble hentet ved hjelp av søkeord «
TGFβR2
» og «NSCLC» og «mRNA».
Den prognostiske verdien av
TGFβR2
genet ble vurdert med Kaplan Meier plotter, en meta-analyse verktøy basert i silico biomarkør vurdering, som vurderer effekten av gener på overlevelse hos kreftpasienter (https://www.kmplot.com/lung) [22,23]. Hver median ble beregnet, og de beste resultater terskelen ble anvendt som slutt cutoff i en univariate og Cox regresjonsanalyse. Histologi, klasse, scene, kjønn og røyking historie ble brukt i multivariat analyse. En Kaplan-Meier overlevelse plott og hazard ratio med 95% konfidensintervall og log rank
P
verdi ble beregnet. Signifikans ble satt til
P
0,05.
Kjøp av kliniske prøver
Ferske vevsprøver fra NSCLC pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon mellom 2008 og 2012 ble hentet fra vevet bank, Jilin University (Jilin, Kina). Prøver inkludert paret tumor og tilstøtende ikke-cancerøse vev (n = 42), så vel som et stort kohort av individuelle NSCLC-biopsier (n = 266). Alle tumorer ble iscenesatt i henhold til den syvende utgaven av AJCC TNM staging system for NSCLC, og pasientdata samles opp til 30 april 2014 ble inkludert for alle pasienter. Kliniske data registrert inkludert pasientkarakteristika (f.eks, kjønn, alder), tumor egenskaper (f.eks diameter, lymfe-metastaser, histologiske subtyper, vaskulær invasjon, og tumor differensiering), total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS)
TGFβR2
uttrykk status, og kjemoterapi
for analyse ble pasientene stratifisert etter alder, ≥ 60 eller 60 år. Tumorstørrelse ble definert som gjennomsnittlig tumordiameter (MTD, definert som det geometriske gjennomsnittet av fire diameter på CT scan), og svulster ble gruppert etter størrelse, ≥ 5 cm og 5 cm. Oppfølgingen ble gjennomført på telefon eller direkte korrespondanse. Den tid til tumor tilbakefall eller død ble bekreftet av pasienten eller pårørende, ved medisinsk opptak, eller ved trygde posten. Total overlevelse (OS) ble beregnet i måneder fra datoen for diagnose til dødstidspunktet, uavhengig av årsak. Sykdomsfri overlevelse (DFS) ble definert som perioden fra den første diagnosedato til tidspunktet for tumorprogresjon ved CT scan, eller til tidspunktet for død på grunn av sykdommen.
RNA Utvinning
Total RNA ble ekstrahert fra NSCLC og normalt vev med TRIzol reagens, i henhold til produsentens instruksjoner. RNA-konsentrasjonen ble målt i et spektrofotometer, og kvaliteten på alle RNA-prøvene ble bestemt ved elektroforese på 1,5% denaturerende agarose-geler.
Kvantitativ RT-PCR
For kvantitativ real-time PCR (QRT -PCR) cDNA ble syntetisert fra total RNA (10 ng), og kvantitative PCR-reaksjoner ble utført med Taqman Universal PCR Kit. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. De 2
-δδCT metoden ble brukt til å kvantifisere uttrykket nivåer av
TGFβR2
.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført med IBM SPSS statistikk for Windows, versjon 19.0. Ekspresjonen av
TGFβR2
ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. En uavhengig t-test ble anvendt for å undersøke forskjeller mellom de to grupper, og en chi-kvadrat-test ble anvendt for å vurdere differanse mellom gruppene. Kaplan-Meier-kurver ble anvendt for å bestemme total overlevelse av de forskjellige gruppene, og resultatene ble sammenlignet med en log-rank test. Univariate og multivariate overlevelsesanalyser var basert på en Cox regresjonsmodell, og denne modellen ble brukt til å identifisere hvilke uavhengige faktorer i fellesskap hadde signifikant effekt på overlevelse.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Uttrykk for den TGFβR2 bruker online overlevelsesanalyse plattform
TGFβR2
mRNA uttrykk i kreft vs. normalt vev var undersøkt ved hjelp av Oncomine database (figur 1A). Denne analysen viste at
TGFβR2
ble over-uttrykt i tumorvev i forhold til tilsvarende normalt vev (endring = 1,99;
P
0,001).
En , Expression nivåer av
TGFβR2
i kreft vs. normalt vev avledet fra Oncomine database. B, Survival analyse utført med Kaplan-Meier plott basert på
TGFβR2
uttrykk.
Den prognostiske verdien av uttrykket av
TGFβR2
ble vurdert med Kaplan- Meier plotter plattform. Resultatene viste at prognosen var verre for pasienter med lunge adenokarsinom der
TGFβR2
uttrykk var 1,99 ganger høyere enn i normalt vev (HR = 1,28 (95% KI, 1,01 til 1,63),
P
= 0,038). Disse resultatene indikerer at høyt uttrykk for
TGFβR2 plakater ( 1,99 ganger) var assosiert med dårlig prognose i lunge adenokarsinom (fig 1B)
TGFβR2 uttrykk i NSCLC og normal lungevevet
for å validere disse funnene,
TGFβR2
mRNA nivåer ble undersøkt i tumor (n = 308) og tilstøtende ikke-kreft vev (n = 42) fra en kohort av kinesisk NSCLC pasienter ved QRT-PCR. Resultatene viste at
TGFβR2
uttrykk nivåer var signifikant høyere hos NSCLC tumor biopsier (2,46 ± 0,42) i forhold til tilstøtende ikke-neoplastiske vev (1,01 ± 0,06). Denne forskjellen mellom tumor og normalt vev var statistisk signifikant (
P
= 0,001; Tabell 1).
Forholdet mellom TGFβR2 uttrykk og kliniske kjennetegn
Sammenhenger mellom
TGFβR2
uttrykk og individuelle kliniske egenskaper ble undersøkt. Resultatene viste at i disse 308 tilfeller av NSCLC,
TGFβR2
ekspresjonsnivåer var positivt korrelert med tumor differensiering (
P
= 0,029) og invasjon av lungemembran (
P
= 0,045) samt kjemoterapi (
P
0,001; tabell 2) .Men det var ingen sammenheng mellom
TGFβR2
uttrykk og pasientens kjønn, alder, røyking historie, lymph- metastaser, histologi, vaskulær invasjon, TNM stadium, eller svulst diameter (
P
0,05).
Kaplan-Meier-overlevelseskurver ble plottet for å evaluere den prognostiske verdi av disse kliniske /biologiske egenskaper for OS. Median oppfølgingstid på 34,3 måneder (fra 14,3 til 79,3 måneder). Resultatene av univariate analyser er vist i tabell 2. Som forventet var det en signifikant sammenheng mellom kortere OS og klassiske prognostiske faktorer som lymfe-node metastasering (
P
= 0,026), invasjon av lungehinnen (
P
= 0,034), og tumorstørrelse (≥ 5 cm;
P
= 0,033). Videre pasienter behandlet med kjemoterapi vist en betydelig økt OS (
P
0,001). Dermed betydelig redusert OS var assosiert med pasienter som ikke hadde gjennomgått kjemoterapi eller hadde lymfeknutemetastase, invasjon av lungehinnen, eller økt tumorstørrelse (≥ 5 cm).
Høy uttrykk for TGFβR2 var en prognostisk markør for NSCLC pasient overlevelse
for å finne ut om andre kliniske faktorer kan påvirke prognosen av NSCLC, univariat overlevelse analyse, stratifisert etter hver av de kliniske faktorer (herunder kjønn, alder, vaskulær invasjon, tumorstørrelse, invasjon av lungehinnen, lymph-node metastaser, TNM stadium, tumor differensiering, røyking historie, og
TGFβR2
uttrykk), ble utført med Kaplan-Meier estimater. Resultatene av Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste at prognosen var verre hos pasienter med høyt uttrykk for
TGFβR2
. Uttrykk for
TGFβR2
var signifikant assosiert med redusert OS (
P
= 0,009; figur 2A) og DFS (
P
= 0,003; figur 2B) i NSCLC pasienter. For å vurdere påvirkning av lymfe-metastaser og tumorstørrelse på prognose fra NSCLC pasienter, ble Kaplan-Meier overlevelseskurver plottet og log rank analyse ble utført. Lymfe-node metastaser var signifikant assosiert med kortere OS (
P
= 0,026; figur 2C) og DFS (
P
= 0,002; figur 2D) i NSCLC. Lignende resultater ble oppnådd for tumorstørrelse (OS,
P
0,001, figur 2C og DFS,
P
0,001, figur 2D).
Univariat overlevelsesanalyse av OS og DFS i lungekarsinom som bestemmes av Kaplan-Meier plott estimater basert på
TGFβR2
uttrykk i (A) og (B); lymfeknute-metastaser i (C) og (D); og lungekarsinom tumorstørrelse i (E) og (F), henholdsvis.
Univariat analyse med en Cox regresjonsmodellen viste at invasjonen av lungehinnen (
P
= 0,04 ), tumorstørrelse (
P
0,001), og lymfeknutemetastase (
P
= 0,02) var også positivt korrelert med dårlig prognose (tabell 3). Enda viktigere, kjemoterapi ble funnet å øke OS (
P
= 0,033, HR = 1,489 [1,032, 2,418], fig 3A) og DFS tid (
P
= 0,048, HR = 1,444 [1,004, 2,078], figur 3B). I tillegg lav uttrykk for
TGFβR2
hos NSCLC svulster fra pasienter behandlet med kjemoterapi var en kritisk beskyttende faktor for OS (
P
= 0,003, HR = 2,24 [1. 32, 3,79], fig 3C) og DFS (
P
0,001, HR = 9,40 [4,92, 17,98], fig 3D). Ingen korrelasjon ble observert med kjønn, alder, vaskulær invasjon, invasjonen av lungehinnen, TNM stadium, tumor differensiering, eller røyking historie. Samlet utgjør disse funnene indikerte at uttrykk for
TGFβR2
kan spille en potensiell rolle i NSCLC progresjon og korrelerer med utfallet av NSCLC.
Univariat analyse av OS (A) og DFS (B ) med en Cox-modell i lungekarsinom basert på kjemoterapi, som bestemmes av Cox regresjon estimater. Multivariat analyse av OS (C) og DFS (D) med en Cox-modell i lungekarsinom basert på kjemoterapi og
TGFβR2
uttrykk, som bestemmes av Cox regresjon estimater.
en multivariat Cox regresjonsanalyse ble utført for å fastslå om uttrykk for
TGFβR2
var en prognostisk markør i NSCLC pasienter. Modellen opprinnelig inkluderte alle parametrene som var forutsigbare for OS i univariat analyse av hele studiegruppen som presenteres i tabell 3 (alder, kjønn, røyking historie, lymfe-metastaser, tumor differensiering, histologi, vaskulær invasjon og diameter, og invasjon av lungehinnen). En videre trinnvis prosedyre ble vedtatt for å få den endelige modellen av en signifikant prediktor for OS bestående av faktorene lymfe-node metastase, diameter, invasjon av lungehinnen, og uttrykk for
TGFβR2
. Ifølge multivariabel Cox regresjonsmodellen analyse, høy uttrykk for
TGFβR2
ble identifisert som en prediktor for kortere OS i NSCLC.
Kjemoterapi forbundet med lav uttrykk for TGFβR2 forbedrer sterkt OS og DFS NSCLC pasienter
Kjemoterapi fungerer som primærbehandling i de fleste NSCLC tilfeller. OS og DFS av pasientene ble derfor analysert basert på behandlerstatus. Kjemoterapi ble funnet signifikant å forlenge OS (33,5 ± 1,05 vs. 24,37 ± 1,22,
P
= 0,025) og DFS (32,47 ± 0,84 vs. 24,37 ± 1,22,
P
= 0,037) av pasientene i denne kohorten (tabell 4). Når dataene ble analysert basert på
TGFβR2
uttrykk samt behandling status, OS og DFS tid ble funnet å være betydelig lengre i behandlede NSCLC pasienter med lav uttrykk for
TGFβR2
i motsetning til ubehandlet pasienter med høyt uttrykk (40,70 ± 2,07 vs. 24,23 ± 1,25,
P
= 0,002 og 36,53 ± 2,97 vs. 21,33 ± 1,34,
P
0,001). (tabell 4)
resultatene viste at
TGFβR2
ble sterkt uttrykt i pasienter med dårlig prognose, selv når de behandles med cellegift. Univariat og multivariat overlevelsesanalyse ble utført med Kaplan-Meier-estimater for ytterligere å avgjøre om kjemoterapi og /eller
TGFβR2
uttrykk var assosiert med OS og DFS. Resultatene av univariat analyse viste at langvarig OS og DFS ble assosiert med behandling (figur 3A (HR = 1,489 [1,032, 2,418],
P
= 0,033) og figur 3B (HR = 1,444 [1,004, 2,078]
P
= 0,048), henholdsvis). Når pasientdata ble ytterligere stratifisert basert på
TGFβR2
uttrykk samt behandling status, multivariat Cox regresjonsanalyse viste en økt OS (HR = 2,24 [1,32, 3,79],
P
= 0.003, fig 3C) og DFS (HR = 9,40 [4,92, 17,98],
P
. 0,001, figur 3D) i behandlede pasienter med lav
TGFβR2
uttrykker svulster
diskusjon
de molekylære komponenter av TGF-β familie har vært fokus molekylære studier belyse somatiske mutasjoner i mange humane kreftformer. Her ble NSCLC biopsier og tilstøtende ikke-kreft vev undersøkt for uttrykk for
TGFβR2
. Den total overlevelse hos pasienter med høyt uttrykk ( 1,99 ganger) av
TGFβR2
ble redusert i forhold til pasienter med lav uttrykk for
TGFβR2
. I tillegg ble det kliniske parametre som lymfeknutemetastase og tumor-størrelse assosiert med en dårligere prognose i denne kohort. Til slutt, en forening mellom
TGFβR2
uttrykk og kjemoterapi dukket opp fra vår analyse, noe som tyder på en mulig rolle for denne biomarkør i respons på kjemoterapi.
Motstand mot kjemoterapi er en stor utfordring i behandlingen av kreft [24]. Kreft tilbakefall er et problem hos pasienter som ikke bare under behandling med tradisjonelle chemotherapies men også med mer moderne molekylære målrettet terapi. Inhibering av TGF-β signalveien med små-molekyl-forbindelser har imidlertid vist seg å være en måte for å reversere resistens i NSCLC til målrettet terapi [25]. Flere studier viste at anti-
TGFβR2
antistoff som en terapeutisk inhibitor i kombinasjon med kjemoterapi blokkerte bindingen av
TGFβ1
, 2, og 3. Hemming av TGF-β forstyrret aktivering av Smad2, hvilken har vist seg å kontrollere metastase, tumorvekst, og invasjonen av kreftceller [26]. Behandling med spesifikke antistoffer i andre studier også hemmet primær tumorvekst og metastase [27,28]. Behandling med det cytotoksiske middel cyklofosfamid i kombinasjon med hemming av TGF-β veien var særlig effektiv for demping av primær tumorvekst og metastase [26]. Derfor er en terapeutisk tilnærming som hemmer
TGF-β
signaltransduksjon kan vise seg å være spesielt effektiv for NSCLC pasienter med påvisbare uttrykk for
TGFβR2
. Faktisk, blokkering TGF-β signal med oppløselig TGF-β reseptor type II-proteinet inhiberte TGF-β binding til endogene
TGF-β
reseptorer og redusert tumorcelle motilitet, intravasation, og fjern metastase i en musemodell [ ,,,0],29].
Leger har undersøkt nytten av kjemoterapi og strålebehandling i både preoperative og postoperative sammenhenger for å vurdere total overlevelse og sykdomsfri overlevelse for pasienter med resectable NSCLC [30]. Men med en stadig mer detaljert molekylær forståelse av kreftutvikling, har individualiserte behandlingsstrategier blitt fokus for forbedring av kreftbehandling. Molekylære biomarkører således har begynt å spille en viktig rolle i den kliniske behandlingen av kreftpasienter, som de indikerer sannsynligheten for en respons på kjemoterapeutisk inngrep i den enkelte pasient. Biomarkører for tiden relevante for målrettet terapi i NSCLC er EGFR, HER2, og KRAS mutasjonsstatus, ALK genet omorganisering, og c-Met protein uttrykk [31]. Disse biomarkører har stimulert co-utvikling av nye legemidler med companion diagnostics [32].
Betydelig innsats for å identifisere en molekylær signatur som ville forutsi respons på kreft adjuvant behandling er pågående for å gjennomføre og forbedre dagens standard klinisk behandling [33-35]. Men det virkelige potensialet for biomarkører ligger i deres mulig utvikling som en molekylær målrettet terapi i behandlingen av spesifikke undergrupper av NSCLC pasienter [36]. Mange viktige signalveier er involvert i utviklingen av NSCLC, og kjemoterapi følsomhet eller resistens mot ulike antistoff eller hemmer agenter som er rettet mot disse banene kan være spesielt administrert basert på utseendet på spesifikke biomarkører hos enkelte pasienter [26,37,38].
i sammendraget, våre data viser at med kjemoterapeutisk behandling median OS og DFS av pasientene ble økt. I tillegg har pasienter stratifisert etter kjemoterapi sammen med lav uttrykk for
TGFβR2
utstilt den lengste OS og DFS i denne kohorten. I kontrast, ubehandlede pasienter med høyt uttrykk for
TGFβR2
utstilt kortest OS og DFS. Analysene således vist at i tilfelle av lav
TGFβR2
uttrykk, kjemoterapi forbedrer total overlevelse og sykdomsfri overlevelse i NSCLC. Derfor
TGFβR2
er en potensiell svulst biomarkør for kjemosensitivitet i NSCLC. Imidlertid er videre studier med større kohorter nødvendig for å bekrefte disse funnene.
Konklusjon
TGFβR2
uttrykk hos NSCLC vev var betydelig høyere enn i ikke-neoplastiske vev. Analyser viste at høyt uttrykk for
TGFβR2 plakater ( 1,99) var en kritisk risikofaktor for redusert OS og DFS i NSCLC pasienter. Derfor våre funn tyder på at
TGFβR2
transkripsjonsnivåer kan ha en viktig rolle i NSCLC progresjon og kunne utvikle seg som en lovende prognostisk biomarkør for pasienter med NSCLC kjemoterapi.
