Abstract
Bakgrunn
Fordi cellesignalering og celle metabolske veier utføres gjennom proteiner, protein signaturer i primærsvulster er nyttige for å identifisere viktige noder i signale nettverk hvis endring er assosiert med malignitet og /eller kliniske resultater. Denne studien forsøkte å bestemme protein signaturer i grunnskolen lungekreft vev.
metodikk /hovedfunnene
Vi analyserte 126 proteiner og /eller proteinfosforylering nettsteder case-matchet normale og tumorprøver fra 101 lunge kreftpasienter med omvendt-fase-protein array (RPPA) assay. Resultatene viste at 18 molekylene var signifikant forskjellig (
p
0,05) med minst 30% mellom normale og tumorvev. De fleste av disse molekylene spille roller i celleproliferasjon, DNA-reparasjon, signaltransduksjon og lipid metabolisme, eller fungere som celleoverflaten /matrix proteiner. Vi har også validerte RPPA resultatene etter Western blot og /eller immunhistokjemisk analyse for noen av disse molekylene. Statistiske analyser viste at Ku80 nivåene var signifikant høyere i svulster røykere enn hos dem som røyker. Cyclin B1 nivåene ble betydelig overuttrykt i dårlig differensierte svulster mens Cox2 nivåene ble betydelig overuttrykt i neuroendocrinal svulster. Et høyt nivå av Stat5 er assosiert med gunstige overlevelse utfallet for pasienter som behandles med kirurgi.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater viste at noen molekyler involvert i DNA-skade /reparasjon, signal transductions, lipidmetabolismen og celleproliferasjon var drastisk avvikende i lungekreft vev, og Stat5 kan tjene en molekylær markør for prognose av lungekrefttilfellene
Citation. Han Y, Zhou Z, Hofstetter WL, Zhou Y, Hu W, Guo C , et al. (2012) Avvikende uttrykk for proteiner involvert i signaloverføring og DNA Repair Pathways i lungekreft og deres tilknytning til kliniske parametre. PLoS ONE 7 (2): e31087. doi: 10,1371 /journal.pone.0031087
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 21 juli 2011; Godkjent: 02.01.2012; Publisert: 10 februar 2012
Copyright: © 2012 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av National Cancer Institute tilskudd: R01CA-092487 (tildelt BF), RO1CA-124951 (tildelt BF), National Institutes of Health Kjerne Grant 3P30CA-016672-32S3, The University of Texas MD Anderson Cancer Center Support Grant CA- 016672 – Lung Program og Funksjonell Proteomikk Reverse-Phase Protein Array Core-anlegget, Homer Flower Gene Therapy forskningsfond, Charles Rogers Gene Therapy Fund, Flora og Stuart Mason Lung Cancer Research Fund, Charles B. Swank minnefond for Esophageal Cancer forskning, George O. Sweeney Fund for Esophageal Cancer Research, den Phalan Thoracic Gene Therapy Fund, og MW Elkins Velsignet Fund for Thoracic Surgical Oncology, Chapman Foundation, National Natural Science Foundation of China (81172113, 81071912) og «1510-prosjektet «av Third Military Medical University of China (tildelt YH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Molecular profilering av lungekreft gjennom genet array-analyser for mRNA og mikroRNA har ført til identifisering av molekyl signaturer som er potensielt nyttig for å forutsi pasientoverlevelse og tilbakefall av sykdom og /eller som reaksjon på de enkelte kjemoterapeutiske medikamenter basert på hierarkisk og sannsynlighets clustering av mRNA [1] og mikroRNA nivåer [2]. Også studier av enkelt-nukleotid polymorfismer i genomisk DNA har ført til identifisering av potensielle genloci i kromosom 15q25 region [3] som koder for nikotiniske acetylkolin reseptor subenhetgenene som er sterkt assosiert med lungecancer følsomhet. Ikke desto mindre, for de fleste gener, er det ingen signifikant korrelasjon mellom mRNA og proteinnivåene [4]. Således nøkkelsignalveier som reflekterer de sykdomsprosesser transformere gjenstår å bli identifisert. Fordi de fleste signaltransduksjon og reaksjonsveien regulering er utført av proteiner som gjennomgår posttranskripsjonelt modifikasjon, slik som fosforylering, som ikke kan bli detektert ved DNA, mRNA, eller miRNA analyser, er karakteriseringen av proteinnivåer og protein fosforylering status som trengs for å oppnå protein signaturer som reflekterer funksjonell og /eller metabolske forandringer i lungecancer og /eller som reaksjon på terapeutiske midler, slik som kinase-inhibitorer.
forsøk har vært gjort for å bestemme protein signaturer i lungekreft ved hjelp av todimensjonal gelelektroforese og påfølgende protein identifikasjon av masse spectrometry analyse eller ved hjelp av direkte massespektrometri analyser [5]. Selv om denne teknologi er nyttig for identifisering av proteiner differensielt uttrykt i tumorvev, er det sannsynligvis ikke tilpasses til den hurtige gjennomstrømming analyser er nødvendig for klinisk anvendelse på grunn av de tidskrevende prosesser som er involvert, er muligheten for signal forurensninger på grunn av tusenvis av datapunkter involvert i analysen, og mulig korrupsjon av datasett på grunn av eksperimentelle utforming [6].
den nylige advent av protein microarray teknologi kan tillate oss å identifisere kritiske noder eller interaksjoner innenfor nettverket av cellulære signalveier . Fordelen med den RPPA fremgangsmåten er at en enkelt test sonde (antistoff) blir brukt for hver matrise, slik at testing tilstanden er konsistent for hvert antistoff, og gir dermed bedre reproduserbarhet og sensitivitet enn andre proteiner array-teknikker. Med grundig vurdert og validerte antistoffer, kan en RPPA brukes til å oppdage signal forskjeller i noen få tusen molekyler i å teste prøvene [7]. Derfor er denne teknologien nyttig for å overvåke endringer i proteinnivåer og protein fosforylering over tid, før og etter behandling, mellom tumor og normalt vev, og mellom respondere og ikke-respondere. Når differensial mål er identifisert, er det mulig å bruke konvensjonelle fremgangsmåter for å teste en liten undergruppe av molekylære markører for prognose eller prediksjon av behandlingsrespons. For å oppnå dette, samlet vi case-matchet normale og maligne lunge vevsprøver av 101 pasienter og bestemmes sine protein nivåer og protein fosforylering statuser ved hjelp RPPA metode og 126 antistoffer. Her rapporterer vi at flere molekylære noder som er kritiske i celle vedlegg, DNA-reparasjon, celleproliferasjon, og signaltransduksjon ble uttrykt forskjellig mellom normale og kreft vev, noen av dem var assosiert med kliniske parametere, inkludert overlevelse utfall.
Resultater
Pasient og Tumor Kjennetegn
Vi samlet inn case-matchet normale og maligne lunge vevsprøver fra 101 pasienter. Kjennetegn på de pasienter og svulstene er oppsummert i Tabell 1. Pasientene var i alderen 42-86 y, med en gjennomsnittsalder på 65 år, og 55% var kvinner. De fleste av pasientene (93%) var kaukasisk. Adenokarsinom og plateepitelkarsinom utgjorde 56% og 31% av histologiske typer, henholdsvis. Flertallet av pasientene (66%) hadde stadium I sykdom. Om lag 50% av svulstene var dårlig differensiert, og 40% var moderat differensiert. Nitti pasienter (89%) hadde en historie med bruk av tobakk /røyking. Tjuefire pasienter hadde neoadjuvant kjemoterapi, og man hadde neoadjuvant strålebehandling.
Differensial Expression mellom Tumor og normalt vev avslørt av RPPA
For hver prøve og hvert antistoff, signalet i RPPA analyser ble sammenlignet mellom normale og tumorvev. Signalet forskjell mellom normale og tumorvev ble beregnet som følger: [(gjennomsnitt av tumor vev-middel av normale vev) /(gjennomsnitt av normale vev x 100%)]. Fra 126 proteiner eller fosforyleringsseter analysert, 18 hadde signalforskjeller som var større enn 30%, og var statistisk signifikant (
p
0,05) i alle de normale og tumorprøver som ble analysert (tabell 2). Disse 18 molekyler kan kategoriseres som molekyler assosiert med celleproliferasjon (cyclin B1), adapter molekyler i signaloverføring (14-3-3zeta, IRS1-pS307, og IGFBP2), molekyler i lipidmetabolisme (COX2 og ACC-pS79), molekyler involvert i DNA skade respons (Ku80, CHK2 og minibank), celleoverflaten eller matrise molekyler (caveolin 1, CD31, og kollagen type VI), og molekyler i signalveier (PI3K /AKT vei: PI3K-P85, mTOR, og S6K ; Src /Stat vei: Stat5 og Src, og MAP kinase vei: p38-pT180). Signal intensiteter for cyclin B1, IGFBP2, og caveolin 1 i vevsprøver fra hvert tilfelle er vist som eksempler i fig. 1. De fleste av disse molekyler har blitt rapportert å spille viktige roller i en rekke kreftformer, eller til å ha endret ekspresjon i ulike kreftformer. For eksempel tap av caveolin 1-ekspresjon [8], [9] og overekspresjon av cyklin B1 [10], [11] i lungekreft vevet har tidligere blitt rapportert i studier med cDNA matriser og immunhistokjemisk analyse.
A) signalintensitet (Y-aksen) for hvert tilfelle (X-aksen) for molekyler av cyclin B1, IGFBP2, og caveolin 1. B) sprang ned distribusjon av signaler i normale og tumorvev.
Fordi 88 av de 101 tilfellene i denne studien var enten adenokarsinom eller plateepitelkarsinom, vi analysert hvorvidt disse 18 molekyler var signifikant forskjellig mellom normale og kreft vevsprøver for de to store undergrupper av ikke-småcellet lungekreft. Resultatene viste at 13 av de 18 molekylene var signifikant forskjellig mellom normalt og tumorvev for både adenokarsinom og squamous cell carcinoma (p≤0.05, tabell S2), en finne som ligner den som ble observert når alle prøvene ble analysert sammen. To molekyler (COX2 og S6) var ikke signifikant forskjellig når adenokarsinom og plateepitelkarsinom ble analysert separat, mens PI3K-P85, forble Src, og mTOR signifikant forskjellig mellom normale og tumorvev i adenokarsinom, men ikke i plateepitelkarsinom. Hvorvidt PI3K /mTOR /S6 og Src trasé er mer kritisk i adenokarsinom enn i plateepitelkarsinom eller om dette funnet skyldtes mindre antall plateepitelkarsinom prøvene i studien er ikke klart.
Validering av RPPA data
Vi utførte Western blotting-analyse på molekyler hvis uttrykk ble endret i forholdsvis stort antall av tumorvevet, inkludert cyklin B1, caveolin 1, kollagen VI, ACC1 /pS79, CHK2, og IGFBP2. Resultatene viste at de data som oppnås fra Western blot-analyse tilpasset de av RPPA analysen (fig. 2, fig. S1), noe som viser at de data som oppnås fra RPPA analysen var pålitelige og kan valideres ved Western blot-analyse.
Cyclin B1, caveolin 1, kollagen type VI, ble ACC-pS79, CHK2, og IGFBP2 i normale og primære lunge tumorvev analysert ved Western blot i minst fire tilfeller der RPPA viste signal forskjell i normale og tumorvev. The Western blot resultatene var konsistente med de som ga etter RPPA.
Verken RPPA analysen eller Western blot analyse gitt informasjon om hvilke typer celler, tumor eller stromal, bidro til de forskjellene som ble observert. For å bestemme celletypene som ble proteinene forskjellig uttrykt, utførte vi immunhistokjemisk analyser for fem molekyler (ACC-pS79, CHK2, IGFBP2, cyclin B1, og caveolin 1) på prøver som viste forskjellen mellom normale og tumorvev. Resultatene viste at de forskjeller i ekspresjon av alle fem molekyler ble avledet fra forandret ekspresjon i kreftcellene, men ikke i stromale celler (Fig. 3). Slående heterogenitet i protein-ekspresjon i tumorceller ble observert for cyklin B1. Bare en del av tumorceller ble farget sterkt med cyklin B1-antistoff, mens andre tumorceller i den samme tumor viste svært lav eller negativ farging for cyklin B1, muligens på grunn av forskjellig status av cellesyklus. Cyklin B1 uttrykk er kjent for å være cellesyklusavhengig og nådde en topp på G2 /M [12]. Overekspresjon eller tap av uttrykk for andre molekyler var mye mindre heterogen.
Økt uttrykk for ACC-pS79, CHK2, IGFBP2, cyclin B1, STAT5, ATM, og Ku80, og redusert uttrykk av caveolin 1 i tumorvev var sammenlignet med normalt vev fra de samme tilfeller vist withconsistent med funn som gis av RPPA og Western blot analyser. 40 × forstørrelse.
Nanjundan
et al.
Nylig rapportert en RPPA profilering analyse på 46 lunge krefttilfeller med 63 proteiner eller protein fosforyleringsseter og identifisert flere proteiner ble uttrykt forskjellig i primær lungekreft vev [13]. Vi sammenlignet derfor resultatene fra denne studien med at av Nanjundan studie. De to studiene som brukes helt separate prøvesettene. Alle prøver som brukes i Nanjundan studie ble samlet inn før 2000, mens prøvene brukt i denne studien ble samlet etter 2006. Førti-åtte proteiner /protein phosphoryaltaion steder ble testet i begge studiene. Åtte av elleve (72,7%) markører som var signifikant forskjellig mellom normale og kreftvevet i Nanjundan studie har lignende signifikante forskjeller i dagens studier. Tre molekyler (27,3%) (FAK, β-catenin og AKT) som var signifikant forskjellige (p = 0,002 til 0,003) i Nanjundan studie var ikke signifikante i denne studien. Dette resultatet indikerer at validering av RPPA resultater fra egne studier vil være viktig, selv om de fleste av ulikt uttrykt molekylene er konsekvent i de to studiene.
Tre (caveolin-en, cyclin B1 og Src-pY527) av fire markør signatur som skiller NSCLC fra normal lunge i Nanjundan studie var også signifikant forskjellig mellom normale og tumorvev av dagens studier. Vi brukte derfor Nanjundan treningssett (25 tilfeller) for å teste hvorvidt disse tre markør signaturen kan brukes til å skille det hele datasettet (101 tilfeller) av denne studien. Resultatet viste at disse tre markører, enten alene eller i kombinasjon, kan skjelne tumor fra det normale av denne studien med forskjellige nøyaktigheter, sensitivitet og spesifisitet (tabell 3). Generelt, en kombinasjon av to eller tre markører forbedret enten nøyaktighet, sensitivitet eller spesifisitet.
Association med kliniske data
Vi analyserte om uttrykket av de 18 molekyler oppført i tabell 2 i tumorvev ble assosiert med kliniske parametre. Statistisk analyse viste at nivåene av disse molekylene i tumorvev ikke var signifikant assosiert med klinisk stadium eller kjønn. Men uttrykk for Ku80 var signifikant høyere i prøver av pasienter uten røyking historie enn de med røyking historie (
p
= 0,004). Uttrykk for cyclin B1 var signifikant høyere i dårlig differensierte tumorvev enn i moderat eller godt differensierte tumorvev (
p
0,025). På den annen side, ekspresjon av ATM, Ku80, og S6 var signifikant høyere i godt differensierte tumorvev enn i svakt eller moderat differensierte tumorvev (fig. 4). Når uttrykk i ulike histologiske typer ble sammenlignet, uttrykk for ATM, Ku80, IGFBP2, IRS1-pS307, og S6 var signifikant høyere i neuroendocrinal karsinom enn i adenokarsinom eller plateepitelkarsinom (
p
0,05). Dette resultatet tyder på at ekspresjon av visse molekyler var dramatisk forskjellig i neuroendocrinal tumorer sammenlignet med de i adenokarsinom eller platecelle kreft, mens nivåene av de differensielt uttrykte proteiner som er oppført i tabell 1 var mer eller mindre tilsvarende mellom adenokarsinom og platecelle kreft. Likevel, på grunn av forholdsvis lavt antall neuroendocrinal svulster brukt i denne studien, er det ikke klart hvorvidt det eksisterer en bestemt molekylær signatur for denne type kreft.
proteinnivåer i tumorvev detektert i RPPA assay ble analysert med henblikk assosiasjoner med kliniske parametere av pasienter. Molekylet som var signifikant forskjellig i tumorer basert på kliniske parametere analysert vises på toppen av hver graf. De kliniske parametere er vist i bunnen av hver graf. De histologiske og differensierings diagnoser var basert på patologiske rapporter i kliniske database. * Viser at forskjellen var signifikant sammenlignet med andre grupper i samme diagram (
p
0,05).
Association med Survival Outcomes
For å finne ut hvorvidt nivåene av disse proteinene er forbundet med kliniske resultater, utførte vi overlevelsesanalyse på de differensielt uttrykte protein markører vist i tabell 1, ved bruk av Kaplan-Meier-metoden. Kort, skiller vi pasientene inn i to grupper basert på median uttrykk verdien av hver enkelt markør, utpekt som høy og lav uttrykk grupper, og deretter bruke Kaplan-Meier algoritme for å beregne overlevelseskurver for de to definerte grupper av hver markør. Resultatet viste at nivåene av Stat5 var signifikant assosiert med overlevelse resultater når analysert med begge stadium pasienter I-III (p = 0,032) og med trinn I pasienter kun (p = 0,014) (Fig. 5). Pasienter med et høyt nivå av Stat5 i sine tumorvev hadde gunstig overlevelse utfall sammenlignet med de med et lavere nivå av Stat5, noe som tyder på at Stat5 kan være en nyttig markør for prognose av lungekrefttilfellene.
Kaplan-Meier analyse på sammenslutning av Stat5 nivåer og overlevelse resultater for fase i-III (A) (n = 50 for hver gruppe), og Stage jeg bare (B) pasienter (n = 33 for STAT5 høy gruppe, 34 for STAT5 lav gruppe).
Diskusjoner
Vi analyserte molekylære forskjeller i protein eller protein fosforylering nivåer mellom normale og lungekreft vev i 101 prøver av RPPA analysen. Av 126 molekyler analysert, identifiserte vi 18 molekyler som var dramatisk ( 30%) og statistisk signifikant (
p
0,05) forskjellig mellom normale og tumorprøver. Western blot analyse og /eller immunohistopathologic analyser av flere molekyler validert resultatene oppnådd fra RPPA matriser, som viser at resultatene fra RPPA analyse er pålitelige. Videre, en sammenligning med en RPPA undersøkelse utført på en annen av pasientprøvene viste at resultatene av RPPA profilering var svært repeterbare og konsekvent i separate studier med separat sett av pasientprøver. Våre resultater indikerer også at uttrykket av flere molekyler i tumorvev ble assosiert med røyking historie, differensiering, og histopatologiske typer lungekreft.
En rekke biomarkører identifisert her er konsistente med de som er rapportert i litteraturen når det gjelder av deres endrede genekspresjon i tumorvev, inkludert caveolin 1 [8], [9], cyklin B1 [10], [11], 14-3-3zeta [14], Stat5 [15], aktivert p38 [16], og IGFBP2 [17]. Imidlertid, for noen molekyler, ble noen motstridende funnene rapportert av andre tidligere. For eksempel ble CHK2 uttrykk eller dets aktivering funnet å være redusert i ikke-små-celle lungekreft tumorvev av et kommersielt tilgjengelig vev matrisen [18], eller økt i 50% av kirurgisk resekterte lunge- og brysttumorprøver fra ubehandlede pasienter [ ,,,0],19]. Vi fant at CHK2 uttrykk ble økt i både adenocarcima og plateepitelkarsinom lunge vev, som består med det rapportert av DiTullio et al [19]. Økt COX2 uttrykk ble funnet i vår studie, men det var mindre hyppig enn rapportert av Hida et. al i japanske pasienter, hvor en betydelig økning i COX2-ekspresjon ble observert i 70% av tilfellene invasive adenokarsinom [20]. Vårt resultat var i samsvar med det som er rapportert ved Khuri et al, som observerte at bare noen få tilfeller hadde sterk COX2 uttrykk i tumorvev [21].
Interessant, våre resultater viste at flere molekyler involvert i DNA-skade /reparasjon (ATM, CHK2 og Ku80) ble økt i tumorvev. Økt mRNA nivåer av ATM og DNA-PKCS, men ikke fra Ku80, ble oppdaget i tumorvev sammenlignet med nærliggende normalt vev [22]. Men lite er kjent om ATM protein uttrykk i primær lungekreft vev. ATM, CHK2, og /eller Ku80 betraktes som tumorsuppressorgener som er involvert i DNA-skade reaksjon [23], [24]. Interessant nok var konstitutiv aktivering av ATM /CHK2 sti funnet i p53-mutant kreftceller [19]. Økningen av disse DNA-skade svar /reparasjon molekyler i tumorvev kan reflektere tilstedeværelse av genomet ustabilitet i kreftceller, et fellestrekk som skiller kreft fra normale vev [25]. Det er bemerkelsesverdig at overekspresjon av Ku80 ble funnet i hode- og halskreft, og i hudkreft [26], [27], og kan være forårsaket av aktivering av NFkB og COX2 [28]. Alternativt økt uttrykk av Ku80 i ikke-røyker pasienter eller nevroendokrine svulster kan reflektere en høy etterspørsel etter reparasjon av dobbelttrådbrudd ved nonhomologous slutt bli med i disse kreftvevet fordi Ku80 er avgjørende i denne DNA reparasjonsveien. Disse molekylene kan tjene som en markør for kreftbehandling rettet mot DNA reparasjon vei [29]. Fordi tjuefem pasienter inkludert i denne studien hadde ulike neoadjuvant kjemoterapi eller strålebehandling, analyserte vi om økt uttrykk av disse molekylene var assosiert med kjemoterapi og strålebehandling. Statistisk analyse viste at økt uttrykk for ATM, CHK2, og Ku80 ikke var assosiert med neoadjuvent cellegift eller strålebehandling. Dermed blir økt uttrykk av disse DNA skade /reparasjon molekyler ble usannsynlig indusert av behandling, men heller et karakteristisk trekk primære svulster.
Flere deregulerte proteiner identifisert her har blitt undersøkt som terapeutiske mål for kreftbehandling. Små molekyler eller kinase hemmere rettet mot vekstfaktor reseptorer og PI3K /AKT /mTOR, Src /Stat, p38 og minibank /CHK2 trasé ble grundig undersøkt for kreftbehandling, både preklinisk og klinisk, inkludert behandling for lungekreft [29] – [ ,,,0],31]. En fersk studie viste at hemming av minibank eller CHK2 er tilstrekkelig til å bevisstgjøre p53-mangelkreftceller, men ikke p53 villtype celler, til gentoksisk kjemoterapeutisk middel cisplatin eller doksorubicin [32], noe som tyder på at kombinasjonen av cisplatin eller doxorubin med minibank eller CHK2 hemmere kan være til nytte pasienter bærer p53 mutante svulster. Våre resultater viser også at økt uttrykk av STAT5 kan tjene som gunstig prognostisk biomarkør for lungekreftpasienter som behandles med kirurgi. Selv om de underliggende mekanismene gjenstår å bli ytterligere etterforsket, STAT5 som en svulst markør for gunstig prognose har blitt rapportert for brystkreft [33] – [35] og nasofaryngeal kreft [36]. Bevis viste at STAT5 fremmer homotypisk adhesjon og inhiberer invaderende egenskapene til humane brystcancerceller [34]. Om det samme skjer til lungekreft celler gjenstår å bli undersøkt videre. Men den betydelige sammenslutning av STAT5 med kliniske resultater, spesielt i stadium I lungekreft, antydet at STAT5 kan være en nyttig prognostisk biomarkør for lungekreft.
Materialer og metoder
Menneskelig lungevev prøvene
Normal og ondartede prøver lungevev ble samlet mellom 2006 og 2009 fra kirurgisk fjernet prøver under en forskningsprotokoll Lab-90-020 med informert samtykke fra pasientene. Studien ble godkjent av lokal etisk komité (Institutional Review Board ved The University of Texas MD Anderson Cancer Center). Den normale vev var minst 5 cm fra kanten av tilsvarende tumorer i de samme prøver. Både normale og tumorvev ble samlet inn fra operasjonssalen umiddelbart etter prøvene ble fjernet fra pasienter. I alle tilfeller ble histologi kvalitetskontroll utført av en patolog thorax på vevssnitt. Tumorprøver ble inkludert i analysen dersom prosentandelen av ondartede celler i prøven var ≥70%. Normale lungeprøver fra de samme pasientene ble anmeldt for å bekrefte at de inneholdt ingen ondartede celler. Alle prøver ble delt i to deler: en del ble umiddelbart frosset og lagret i flytende nitrogen for proteinekstraksjon; den andre delen ble fiksert i formalin og innstøpt i parafin for rutine histologiske eller immunhistokjemiske undersøkelser. Parene av matchede prøvene ble høstet, behandlet og analysert på samme tid, under de samme protokoller.
RPPA analysen
RPPA Analysen ble utført ved Funksjonell Proteomikk Reverse Phase Protein Array kjernefasilitet ved vår institusjon som vi tidligere beskrevet [37]. I korthet, ble vevsprøvene ble vasket to ganger i iskald PBS og deretter homogenisert i RPPA lyseringsbuffer [1% Triton X-100, 50 mmol /l HEPES (pH 7,4), 150 mmol /l NaCl, 1,5 mmol /l MgCl
2, 1 mmol /liter EGTA, 100 mmol /l NaF, 10 mmol /l Nappis, 10% glycerol, 1 mmol /l Na
3VO
4, 1 mmol /l fenylmetylsulfonylfluorid, og 10 ug /mL aprotinin]. Etter sentrifugering ble supernatanten oppsamlet, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av rutine (
, Bradford
f.eks.) Analyser og deretter justert til 1-1,5 mg /ml ved tilsetning lysisbuffer. Vevet Lysatene ble blandet med 1/4 volum av 4 x SDS-prøvebuffer inneholdende 40% glycerol, 8% SDS, 0,25 M Tris-HCl (pH 6,8), og 10% (v /v) 2-merkaptoetanol (ferskt tilsatt) . To-ganger serie-fortynnet vev lysatene (fra ufortynnet til 1:16 fortynning) ble trykket på nitrocellulose-belagte objektglass (Whatman, Inc.) ved anvendelse av en GeneTAC G3 arrayer (Genomiske Solutions), sammen med tilsvarende positive og negative kontroller fremstilt fra fortynningsbuffer. Totalt 126 validerte antistoffer som er spesifikke for proteiner eller deres fosforylerte områder som er involvert i en rekke signalbaner som var tilgjengelige og anvendes i RPPA (se tabell S1 for antistoffer brukt i denne studien). Hvert snitt ble undersøkt med en validert primært antistoff pluss en biotin-konjugert sekundært antistoff. Signalet ble amplifisert ved anvendelse av en DakoCytomation katalysert system (Dako) og visualisert ved 3,3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid kolorimetrisk reaksjon. Skinnene ble skannet, analysert og kvantifisert ved hjelp av tilpasset programvare, Microvigene (VigeneTech, Inc.), for å generere sted intensitet. Signaler fra hver fortynning ble utstyrt med ikke-parametrisk modell utviklet ved Institutt for Bioinformatikk og Computational Biology ved MD Anderson [38]. Proteinkonsentrasjonene i hvert sett av Glassene ble deretter normalisert og rettet på tvers av prøver med de lineære uttrykk verdier, ved hjelp av median ekspresjonsnivåene av alle antistoff-forsøk for å beregne en lastekorreksjonsfaktor for hver prøve, som tidligere beskrevet [13], [37] .
Western blot analyse
for å validere resultatene fra RPPA analyser, vi utførte Western blot analyse for en undergruppe av molekyler som viste signifikant forskjell mellom normale og kreft vev. Ca 40 mg av hver frossen vevsprøve ble vasket to ganger i kald PBS og homogenisert i 0,5 ml iskald lyseringsbuffer. Ekstrakter tilsvarende 50-60 pg av det totale protein ble separert ved 10% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese, og deretter overført til nitrocellulosemembraner. Western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet [37]. Antistoffer for IGFBP2, caveolin-en, CHK2 (1C12), og fosfor-acetyl-CoA karboksylase (ACC-pS79) ble kjøpt fra Cell Signaling, antistoff for cyclin B1 var fra Epitomics, og kollagen type VI fra Santa Cruz Biotechnology.
immunhistokjemisk farging og evaluering
De samme antistoffer som brukes for Western blot analyse ble brukt for immunhistokjemisk farging. Formalinfiksert og parafin vevssnitt (5-mikrometer tykke) ble deparaffinized, hydrert, og varmes opp i en dampbåt for antigen gjenfinning. Glassene ble deretter farget med forskjellige antistoffer som beskrevet ovenfor. Vev ikke inkubert med et kontroll-antistoff til mus IgG i stedet for et primært antistoff ble anvendt som en negativ kontroll.
Statistical Analysis
Analyse av variansen ble utført ved hjelp av STATISTICA programvare (Statsoft, Inc. ) for sammenligninger mellom grupper. Elevens
t
test ble brukt for sammenlikning mellom to grupper. Den diagonale lineær diskriminant analyse (DLDA) ble brukt for klassifisering og prediksjon av normale og tumorvev. Overlevelses data vil bli analysert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og Cox proporsjonal modell. En
p
-verdi av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
Protein nivåer oppdaget av Western blot analyse i ytterligere 6 saker for IGFBP2 og CHK2. IGFBP2 og CHK2 i normal (N) og primær lungetumor (T) vev ble analysert ved hjelp av Western blot i ytterligere 6 tilfeller hvor RPPA viste signal forskjell i normale og tumorvev. β-actin ble brukt som lasting kontroll
doi:. 10,1371 /journal.pone.0031087.s001 plakater (TIF)
Tabell S1.
Expression forskjell i adenokarsinom og plateepitel kreft *
doi:. 10,1371 /journal.pone.0031087.s002 plakater (DOC)
Tabell S2.
Proteiner og fosforyleringsseter brukes i RPPA studier.
doi:. 10,1371 /journal.pone.0031087.s003 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Markeda Wade for redaksjonell vurdering
