Abstract
Bakgrunn
Aberrant plate avledet vekstfaktor (PDGF) signale har vært assosiert med prostatakreft (PCA) progresjon. Men dens rolle i regulering av PCa cellevekst og overlevelse har ikke vært godt karakterisert.
metodikk /hovedfunnene
Ved hjelp av eksperimentelle modeller som tett etterligner klinisk patofysiologi av PCa progresjon, vi demonstrert at PDGF er en overlevelsesfaktor i PCA-celler ved oppregulering av myeloid celle leukemi-1 (Mcl-1). PDGF behandling indusert rask kjernefysisk translokasjon av β-catenin, trolig er avhengig av c-Abl og p68 signalering. Forbløffende nok PDGF fremmet dannelsen av en kjernefysisk transcriptional kompleks bestående av β-catenin og hypoksi-induserbar faktor (HIF) -1α, og dens binding til Mcl-en promoter. Sletting av en antatt hypoksi responselement (HRE) i Mcl-en promoter svekket PDGF effekter på Mcl-1 uttrykk. Blokade av PDGF-reseptor (PDGFR) signaliserte med en farmakologisk inhibitor AG-17 opphevet PDGF induksjon av Mcl-en, og indusert apoptose i metastatiske PCA celler.
Konklusjon /Betydning
Vår studie belyst en avgjørende overlevelse mekanisme i PCA celler, noe som indikerer at avbrudd av PDGF-Mcl-en overlevelsessignal kan gi en ny strategi for behandling PCa metastaser
Citation. Iqbal S, Zhang S, Driss A, Liu ZR, Kim H-RC, Wang Y, et al. (2012) PDGF oppregulerer Mcl-1 Til Aktivering av β-catenin og HIF-1α-avhengige signale i Human prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (1): e30764. doi: 10,1371 /journal.pone.0030764
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 21 juni 2011; Godkjent: 20 desember 2011; Publisert: 20 januar 2012
Copyright: © 2012 Iqbal et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Department of Defense PC060566, American Cancer Society RSG-10-140-01, Emory University Research Committee Award, Kennedy Seed Grant (DW), National Cancer Institute stipend 1R43CA141870 (AW), gir National Cancer Institute P01 CA98912, R01 CA122602 , Department of Defense PC060866 (LWKC), Georgia Cancer Coalition Distinguished Scholar Grant (OK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
plate avledet vekstfaktorer (PDGF) familie består av fem dimere isoformer: PDGF-AA, -AB, -BB, -CC og -DD [1], som utøver sine cellulære effekter gjennom to strukturelt lignende tyrosinkinase-reseptorer (PDGFR-a og -p) uttrykt av mange forskjellige celletyper [2]. Ligandbinding til PDGFRs resultater i dimerisering og autofosforylering av reseptorkinaser, deretter å rekruttere viss Src-homologi 2 (SH2) domener inneholdende adapter proteiner (f.eks Src, GRB2 og SHC) til bestemte fosforylerte tyrosinrester. Flere signaleringskaskader, inkludert Ras-mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK), fosfolipase-γ og Phos-phatidyl-inositol-3′-kinase (PI3K) /akt, er blitt karakterisert som de store nedstrøms trasé som medierer PDGF funksjoner [3] . Andre adapter molekyler (f.eks, de Fer og Fes-tyrosin-kinase-familien) og transkripsjonelle faktorer (for eksempel β-catenin) er også involvert i PDGF-signalering i visse celletyper [4], [5], [6], [7], [8].
Aberrant PDGF-ekspresjon har vært ofte forbundet med den neoplastiske komponenten av humane tumorer, mens PDGFRs finnes hovedsakelig i det fibroblastiske og vaskulære stroma tumor [9], [10], [11], [ ,,,0],12], [13]. Disse observasjoner antydet at tumor-avledet PDGF kan først og fremst virke som en parakrin signalmolekyl i faste tumorer. Støtte dette konseptet, har nyere studier vist at PDGF er et potent pro-angiogen faktor ved å fremme rekruttering og vekst av stromale fibroblaster, perivaskulær celler og endotelceller, og dermed indirekte påvirker tumorvekst, metastatisk spredning og narkotika motstand [2], [3 ], [14], [15], [16]. Interessant, dukker opp bevis indikerte at PDGF autokrin signalering kan også spille en viktig rolle i løpet av tumorprogresjon. Mutasjons aktivering eller co-uttrykk for PDGF ligander og reseptorer er i stand til å stimulere tumorcellevekst og spredning i flere nonepithelial maligniteter, inkludert glioblastomas og osteosarkom [17]. Mer nylig har autokrin PDGF signalering er forbundet med epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) i carcinoma celler fra bryst, tykktarm, prostata og leveren, noe som tyder på en forårsakende rolle av autokrin PDGF signalering i metastase [7], [8], [18], [19]. Likevel, til tross for de veletablerte sammenheng mellom deregulert parakrint PDGF signal og tumorprogresjon, funksjoner og mekanismer autokrint PDGF signal i epiteliale kreftceller forblir unnvikende [3], [17].
Kjøp av apoptoseresistens er karakteristisk for metastatiske tumorceller, noe som kan gi fordeler under overlevelse invasjon, metastase og kolonisering [20]. Vi har nylig korrelert overekspresjon av myeloid celle leukemi-1 (Mcl-1), et medlem av Bcl-2-familien, med progresjon av prostata cancer (PCA) mot beinmetastase [21]. I denne studien gir vi bevis for at PDGF-BB er en overlevelse faktor i metastatiske PCA celler ved oppregulering Mcl-en til uttrykk gjennom en signaleringsmekanisme formidlet av transkripsjonsfaktorene p-catenin og hypoksi-induserbar faktor (HIF) -1α.
Materialer og metoder
Cell Kultur
Menneskelig PCA cellelinjer ARCaP
E, ARCaP
M [22], LNCaP (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas , VA), c4-2 [23] og PC3 (ATCC) ble rutinemessig opprettholdt i T-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) med 5% føtalt bovint serum (FBS). For behandlinger med PDGF-isoformer, PCA-celler sådd ut i 96-brønners plater (3000 celle /brønn) ble serum-sultet over natten, erstattet med friskt serumfritt T-medium og inkubert i nærvær av varierende konsentrasjoner av rekombinant, humant PDGF- AA, -AB, -BB (R midtre panelet: QRT-PCR analyse av Mcl-1 mRNA uttrykk som svar på PDGF-BB behandling i ARCaP
M celler (24 h); panel høyre: Effekten av PDGF-BB-behandling (20 ng /ml, 72 t) på Mcl-1 protein uttrykk i ARCaP
M celler. ImageJ ble anvendt for å kvantifisere den relative ekspresjon av Mcl-1-proteinet. (D) Virkningene av eksogent PDGF-BB på cytotoksisitet av docetaxel i ARCaP
M celler, som bestemmes av MTS analysen.
PDGF-BB induserer Mcl-1 uttrykk og motvirker apoptose ved PCA celler
Forbløffende nok ble PDGF-BB funnet betydelig indusere Mcl-1 uttrykk i PCA celler (figur 1C, Supplemental Figur S1). Behandling med rekombinant human PDGF-BB øket Mcl-1 mRNA i en dose- og tidsavhengig måte, selv om de optimale betingelsene for maksimal akkumulering av Mcl-1 mRNA varieres på forskjellige PCA cellelinjer. Western blot-analyse bekreftet de induktive virkninger av PDGF-BB for Mcl-1-ekspresjon på proteinnivå. Disse data er identifisert PDGF-BB som en ny regulator av Mcl-1-ekspresjon, noe som kan gi en overlevelsesmekanisme for å beskytte cellene fra PCA apoptose. Faktisk, tilsetning av PDGF-BB i PCA cellekulturer effektivt motvirket cytotoksisiteten av docetaxel over et bredt område av doser (figur 1D).
Ekspresjon av PDGF-profil autokrin aliserte komponenter i PCA-celler
Vi undersøkte uttrykk mønster av PDGFs og deres reseptorer i PCA celler (Figur 2A). RT-PCR-analyser viser at PDGF-isoformene ble uttrykt forskjellig på mRNA-nivået, og blant dem, økt PDGF-B og PDGF-D ble observert i c4-2 og ARCaP
M-celler når sammenlignet med foreldre LNCaP og ARCaP
E celler, henholdsvis. I samsvar med tidligere undersøkelser [19], ble PC3-celler funnet å uttrykke høye nivåer av PDGF-D, PDGFR-α og -β. Interessant, PDGFR-a mRNA syntes å være i hovedsaken uttrykkes i PCA-celler, som ble bekreftet ved proteinnivå ved Western blot-analyse. I motsetning, skjønt PDGFR-p-mRNA ble påvist ved RT-PCR i de fleste PCA cellelinjer, immunblotting-analyse bare kunne bekrefte protein ekspresjon i ARCaP
E og ARCaP
M-celler (figur 2A, høyre panel). Samlet utgjør disse dataene foreslo en funksjonell PDGF autokrint signalering i visse PCA celler.
(A) Expression profil PDGFR signale komponenter i PCA celler, som analyseres ved RT-PCR og Western blotting. (B) Effekten av PDGF-BB (20 ng /ml) på fosforyleringen av PDGFR-α og -β i ARCaP
M celler. (C) Virkningen av reduserende PDGFR-α eller /og -p i Mcl-1-protein ekspresjon i ARCaP
M celler. Cellene ble transfektert med enten isotype-spesifikk sirnas målrettet mot PDGFR-α (venstre panel, 30 nM) eller PDGFR- β (midtfeltet, 100 nM), eller en blanding av PDGFR-α og -p sirnas (høyre panel) i 48 h, serum-sultet natten over, og inkubert i nærvær eller fravær av PDGF-BB (20 ng /ml) i 72 timer. (D) Øvre panel: Den tidsavhengige effekter av AG-17 (100 nM) på Mcl-1 mRNA uttrykk i ARCaP
M celler; Bunnpanelet: Effekten av AG-17-behandling på ekspresjon av Mcl-1 og spaltet PARP i nærvær (20 ng /ml) eller fravær av PDGF-BB (20 ng /ml) i ARCaP
M celler. (E) Virkningene av AG-17 behandling (100 nm, 72 t) på levedyktigheten til ARCaP
E og ARCaP
M celler.
en autokrin PDGFR signale medierer PDGF- BB regulering av Mcl-1 i PCA-celler
Både PDGFR-α og -β ble sterkt uttrykt i beinmetastatisk ARCaP
M-celler, og hurtig fosforylert på en tidsavhengig måte i respons til stimulering av eksogene PDGF-BB (figur 2B). Interessant, uttømming av enten PDGFR-α eller -β av isoform spesifikke siRNA ikke blokkere den induktive effekten av PDGF-BB på Mcl-1 uttrykk (Figur 2C, venstre og sentrale paneler), noe som tyder på at aktivering av enten reseptorer kan være tilstrekkelig for oppregulering av Mcl-1. Støtte denne hypotesen, transient transfeksjon med en blanding av siRNAs rettet mot både PDGFR-α og -β hemmet basal uttrykk for Mcl-en, og opphevet PDGF-BB induksjon av Mcl-en ARCaP
M celler (Figur 2C, høyre panel ). Alternativt kan behandling med AG-17 (Tyrphostin), en selektiv farmakologisk inhibitor av PDGFRs [28], redusert Mcl-1-ekspresjonen ved både mRNA og proteinnivåene og markably øket spaltning av poly-ADP-ribose polymerase (PARP), en indikator på apoptose . Disse effektene ble svekket ved nærvær av PDGF-BB i kulturer (figur 2D). Konsekvent, AG-17 behandling ved lave doser (for eksempel 100 nM) effektivt indusert apoptose i ARCaP
E og ARCaP
M celler (figur 2E), noe som indikerer en sentral rolle PDGFR signalering i overlevelse av PCA celler.
β-catenin medierer PDGF regulering av Mcl-1-ekspresjon i PCA-celler
Aktivering av β-catenin veien er en nedstrøms tilfelle av PDGF signalering i visse epiteliale kreftceller [7], [ ,,,0],8], [29]. Western blot-analyse funnet at β-catenin og TCF4, en større β-catenin-vekseltranskripsjonsfaktor [30], ble uttrykt forskjellig i PCa-celler (figur 3A), noe som tyder på en funksjonell β-catenin-TCF4 signalering i disse cellene. Faktisk ble en kunstig TCF promoter aktivert både i LNCaP-c4-2 og ARCaP
E-ARCaP
M celleslektsnavn, og reporteren aktiviteter ut til å være forbundet med økt
in vivo
metastatisk potensial i c4-2 og ARCaP
M celler (Figur 3B). Det er verdt å merke seg at både β-catenin og TCF4 ble vesentlig presentert i kjernen av ARCaP
E og ARCaP
M celler (figur 3A, lav panel), som viste markert høyere basal TCF aktiviteter enn både LNCaP eller C4 -2 celler (ved ~ 100 ganger) (figur 3b).
(A) Expression profilen til β-catenin-TCF signalkomponenter i PCA celler. (B) TCF reporter aktivitet i LNCaP-c4-2 og ARCaP
E-ARCaP
M celler. (C) Øvre panel: Effekten av PDGF-BB (20 ng /ml) på kjernefysisk translokasjon av β-catenin i ARCaP
M celler; Nedre panel: Effekten av PDGF-BB (20 ng /ml) for TCF rapportøraktivitet i nærvær (100 nM) eller fravær av AG-17. (D) Virkningene av ektopisk ekspresjon av β-catenin (72 h) på Mcl-1-ekspresjonen ved både mRNA og proteinnivåer. (E) Virkningen av β-catenin uttømming for PDGF-BB regulering av Mcl-1-ekspresjon i ARCaP
M celler. Cellene ble transfektert med β-catenin siRNA eller tak siRNA (30 nM) i 48 timer, serum-sultet natten over, og inkubert i nærvær eller fravær av PDGF-BB (20 ng /ml) i 72 timer. (F) Virkningene av β-catenin uttømming på Mcl-en reporter aktivitet i ARCaP
M celler. Cellene ble transfektert med β-catenin eller tak siRNA (30 nM) i 48 timer, og ytterligere transfektert med en human Mcl-1 reporter i 24 timer. Etter serum sult over natten, ble cellene inkubert i nærvær eller fravær av PDGF-BB (20 ng /ml) i 48 timer.
Ved PDGF-BB-behandling, atom nærvær av β-catenin ble raskt økt i ARCaP
M celler (figur 3C, øvre panel). Konsekvent, TCF rapportøraktivitet, ble også signifikant økt etter PDGF-BB stimulering, som ble dempet ved forbehandling med AG-17 (figur 3C, nedre panel). Disse data indikerte at PDGF-BB aktivert β-catenin signalisering i en PDGFR avhengig måte.
For å undersøke hvilken rolle β-catenin i reguleringen av Mcl-1 uttrykk, ARCaP
M celler ble midlertidig transfektert med en konstruksjon som uttrykker villtype β-catenin. RT-PCR og Western blot analyser viste at ektopisk epression av β-catenin increseased Mcl-en på både mRNA og proteinnivå (Figur 3D). I motsetning, β-catenin uttømming ved hjelp av et siRNA basseng effektivt inhiberte både basal ekspresjon av Mcl-1 og dets induksjon av PDGF-BB (figur 3E). Konsekvent, mens PDGF-BB betydelig indusert luciferase aktiviteten til en full-lengde human Mcl-en promoter i ARCaP
M celler transfektert med ikke-målretting kontroll sirnas Dette ble opphevet ved forbigående utarming av endogen β-catenin (Figur 3F). Disse resultatene antydet at aktivering av β-catenin signal kan være tilstrekkelig og nødvendig for Mcl-1 uttrykk i PCA celler.
PDGF aktiverer p68-β-catenin signal ved PCA celler
Vi har undersøkt hvorvidt en c-Abl-p68-avhengig reaksjonsvei er involvert i aktivering av PDGF β-catenin signalisering i PCA-celler [7]. Western blot analyser funnet at c-Abl og p68 ble forskjellig uttrykt ved PCA celler (figur 4A). Ved PDGF-BB behandling, tyrosin fosforylering av c-Abl og p68 ble raskt aktivert, noe som gjenspeiles av immunoutfellingsstudier-immunoblotting analyser (figur 4B, venstre og midtre paneler). Viktigere, tilstedeværelse av β-catenin i p68 immunutfellinger ble også øket på en tidsavhengig måte, noe som tyder på en forbedret fysisk assosiasjon mellom β-catenin og p68-proteiner (figur 4B, midtre panel), som ble ytterligere bekreftet ved en gjensidig immunpresipitering eksperiment (figur 4B, panel til høyre). Faktisk, PDGF-BB-indusert hurtig nukleær translokasjon av p68 i løpet av 30 minutter (figur 4C), som var assosiert med øket ko-lokalisering av p68 og β-catenin i kjernen (figur 4D). Disse data indikerte at PDGF-BB kan aktivere c-Abl-p68 kaskade og påfølgende β-catenin signal i PCA celler.
(A) Uttrykk for c-Abl og p68 i PCA celler. (B) Venstre panel: Effekten av PDGF-BB (20 ng /ml) på fosforylering av c-Abl; midtre panel: Effekten av PDGF-BB (20 ng /ml) på fosforylering av p68 og ekspresjonen av β-catenin i p68 immunopresipitatene i ARCaP
M celler. Fosforylering av p68 på tyrosin nettstedene ble oppdaget ved hjelp av en pan-fosforylert-Tyr antistoff; panel høyre: Effekten av PDGF-BB (20 ng /ml) på uttrykket av p68 i β-catenin immunpresipitatene i ARCaP
M celler. (C) Virkningen av PDGF-BB (20 ng /ml) på den nukleære translokasjonen av p68 i ARCaP
M celler. (D) Konfokalmikroskopi analyse av virkningene av PDGF-BB i ko-lokalisering av β-catenin og p68 i kjernen i et tidsforløp eksperiment i ARCaP
M celler. (E) Virkningen av p68 uttømming på PDGF regulering av Mcl-1 i ARCaP
M celler. Cellene ble transfektert med p68 eller tak siRNA (30 nM) i 48 timer, serum-sultet natten over, og inkubert i nærvær eller fravær av PDGF-BB (20 ng /ml) i 24 timer (øvre panel) eller 72 timer ( bunn panel). Øvre panel: RT-PCR-analyse av mRNA-ekspresjon av p68 og Mcl-1; Bunnpanelet: Western blot-analyse av protein ekspresjon av p68, β-catenin og Mcl-1. (F) Effektene av p68 uttømming på Mcl-en reporter aktivitet i ARCaP
M celler. Cellene ble transfektert med p68 eller tak siRNA (30 nM) i 48 timer, og ytterligere transfektert med human Mcl-1 reporter i 24 timer. Etter serum sult over natten, ble cellene inkubert i nærvær eller fravær av PDGF-BB (20 ng /ml) i 48 timer.
For å undersøke hvorvidt p68 er nødvendig for regulering av Mcl-1 uttrykk, ARCaP
M-celler ble transfektert med p68 siRNA eller kontrollere siRNA, og analysert for ekspresjon av Mcl-1 på mRNA og proteinnivå. Som vist i figur 4E, nedbrytning av p68 inhiberte endogene β-catenin og effektivt svekkes PDGF-BB induksjon av Mcl-1-ekspresjon. Konsekvent, Mcl-1 promoter-aktivitet ble betydelig inhibert ved behandling med p68 siRNA i ARCaP
M celler, enten med eller uten tilstedeværelse av PDGF-BB i kulturer (figur 4F). Disse data indikerte en uunnværlig funksjon av p68 i reguleringen av Mcl-en i PCA celler.
PDGF-BB fremmer protein interaksjon mellom β-catenin og HIF-1α ved PCA celler
Vår forrige studier vist en viktig rolle HIF-1α i beinmetastatisk PCA celler [25]. Interessant, transfeksjon av en HIF-1α-spesifikk siRNA betydelig redusert Mcl-1-protein-ekspresjon i ARCaP
M-celler (figur 5A), noe som tyder på at HIF-1α kan være nødvendig for Mcl-en regulering i PCA-celler. For å undersøke om PDGF-BB kan indusere fysisk interaksjon mellom HIF-1α og β-catenin, ble kjerneproteiner fremstilt fra ARCaP
M celler behandlet med PDGF-BB for varierende tider. Western blot-analyse fant at både HIF-1α og β-catenin ble hurtig øket i kjernen (figur 5B). En co-immunutfelling analyse viste at i respons til PDGF-BB stimulering, nukleær nærvær av β-catenin raskt økt i HIF-1a immunpresipitater (figur 5C, øvre panel). Gjensidig samarbeid immunoprecipitation med en anti-β-catenin antistoff bekreftet en økt sammenslutning av atom HIF-1α med β-catenin følgende PDGF-BB behandling (figur 5C, nedre panel). Den forbedrede ko-lokalisering av β-catenin og HIF-1α proteiner ble videre demonstrert ved konfokal mikroskopi, som syntes å oppnå maksimal intensitet på 30 min ved PDGF-BB stimulering (figur 5D). Disse resultatene indikerte at i repsonse til PDGF-BB stimulering, β-catenin fysisk interagerer med HIF-1α i kjernen, noe som kan føre til aktivering av Mcl-1 transkripsjon i PCA-celler.
(A) effekter av HIF-1α uttømming på Mcl-1 uttrykk i ARCaP
M celler. Cellene ble transfektert med HIF-1α eller tak siRNA (30 nM) i 72 timer og analysert for Mcl-1-ekspresjonen ved immunblotting. (B) Western blot-analyse av virkningene av PDGF-BB (20 ng /ml) på den nukleære translokasjonen av β-catenin og HIF-1α i ARCaP
M celler. (C) Co-immunoutfellingsstudier analyser av effektene av PDGF-BB (20 ng /ml) på samspillet mellom β-catenin og HIF-1α i kjernen i ARCaP
M celler. (D) Konfokalmikroskopi av effektene av PDGF-BB (20 ng /ml) på samlokalisering av β-catenin og HIF-1α i kjernen i ARCaP
M celler.
En antatt HRE motiv er nødvendig for PDGF-BB aktivering av Mcl-en promoter
HIF-1α binder seg til HRE
cis
-elements innen arrangører av hypoksi-responsive gener og regulerer deres uttrykk [31]. Vi undersøkte om PDGF-BB-indusert atom opphopning av HIF-1α ble forbundet med aktivering av HRE-avhengig transkripsjon. I ARCaP
M celler, PDGF-BB-behandling signifikant øket luciferase ekspresjon drevet av en kunstig HRE promoter (pHIF-luc) (figur 6A). Interessant nok var en antatt HRE motiv identifisert innen human Mcl-1 promoter-regionen, som ligger mellom -900 og -884 nukleotider ved 5′-oppstrøms for transkripsjonsstartsetet [24]. For å undersøke den potensielle rolle i dette
cis
-elementer i PDGF regulering av Mcl-en transkripsjon, karakterisert vi en sletting mutant av den antatte HRE motivet ved hjelp av menneskelig Mcl-en promoter region som mal (figur 6B). Den resulterende reporter konstruksjon (p-Mcl-1-Luc: ΔHRE) eller luciferase reporter drevet av full-lengde Mcl-1-promoteren (p-Mcl-1-Luc), ble transient uttrykt i ARCaP
M celler henholdsvis, og ble behandlet med PDGF-BB eller PBS. IL-6, som er blitt vist å aktivere Mcl-1 transkripsjon i PCA og kolangiokarsinom cellene gjennom et signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (Stat3) -avhengig mekanisme [32], [33], ble inkludert som en positiv kontroll. Luciferase aktivitetsanalyse viste at PDGF-BB indusert aktivering av p-Mcl-1-Luc-promoteren i en større grad enn IL-6 i ARCaP
M celler. Betydelig, sletting av HRE motivet reduseres ikke bare den basale aktivitet av Mcl-1-promoteren, men også oppheves de induktive virkninger av PDGF-BB for rapportøraktivitet. I motsetning, p-Mcl-1-Luc: ΔHRE, inneholdende en Stat3-bindende sekvens ved stilling mellom -92 og -83 [32], forble aktivert ved IL-6-behandling (figur 6C). En tilsvarende effekt av HRE delesjon på differensial responsen av Mcl-1 promoter til PDGF-BB og IL-6 ble også observert i c4-2 celler (Opplysning Figur S2). Disse data indikerte at den antatte HRE
cis
-elementer er nødvendig for PDGF-BB aktivering av Mcl-1-ekspresjon i PCA-celler.
(A) Virkningen av PDGF-BB på HIF -1 reporter aktivitet i ARCaP
M celler. Cellene ble transient transfektert med HIF-1 reporter eller pGL3 i 24 timer i serum-sultet og inkubert i nærvær eller fravær av PDGF-BB (20 ng /ml) i 48 timer. (B) Skjematisk fremstilling av menneske Mcl-en promoter og dens sletting mutasjon på den antatte HRE nettstedet. (C) Virkningene av å slette den antatte HRE nettstedet på PDGF regulering av Mcl-en promoter aktivitet i ARCaP
M celler. IL-6 (200 ng /ml) ble inkludert som en positiv kontroll. (D) -brikke-Re-Chip-analyse av virkningene av PDGF-BB-behandling (20 ng /ml) på bindingen av β-catenin og HIF-1α til human Mcl-1-promoter-regionen i ARCaP
M celler.
PDGF-BB fremmer bindingen av både β-catenin og HIF-1α til Mcl-en promoter omegn
Vi har undersøkt hvorvidt PDGF-BB fremmet spesifikk binding av både β-catenin og HIF-1α til Mcl-en promoter ved en sekvensiell ChIP analysen. Fraksjonert kromatin fra kontroller og PDGF-BB-behandlede ARCaP
M-celler ble først immunopresipitert med et β-catenin antistoff, og bunnfallet ble utsatt for en re-Chip-analyse med en HIF-1α antistoff.
