Abstract
Ved hjelp av celle basert screeningsanalyse, vi identifisert en ny anti-tubulin middel (Z) -5 – ((5- (4-brom-3-klorfenyl) furan-2-yl) metylen ) -2-thioxothiazolidin-4-on (BCFMT) som inhiberte proliferasjon av human cervical carcinoma (HeLa) (IC
50, 7,2 ± 1,8 uM), human bryst adenocarcinoma (MCF-7) (IC
50, 10,0 ± 0,5 mm), svært metastatisk brystkreft adenokarsinom (MDA-MB-231) (IC
50, 6,0 ± 1 mm), cisplatin-resistente human ovarialcancer (A2780-cis) (IC
50, 5,8 ± 0,3 mm) og multiresistent mus brysttumor (EMT6 /AR1) (IC
50, 6,5 ± 1 mm) celler. Ved bruk av flere frie strategier, ble BCFMT funnet å hemme kreftcellevekst i G2 /M-fasen av cellesyklusen tilsynelatende ved å målrette mikrotubuli. I tillegg BCFMT sterkt undertrykkes dynamikken i enkelte mikrotubuli i levende MCF-7-celler. På sitt halvparten av maksimal spredning hemmende konsentrasjon (10 mm), BCFMT reduserte satsene for vekst og forkorte faser av mikrotubuli i MCF-7 celler med 37 og 40%, henholdsvis. Videre økte den tids mikrotubuli tilbrakt i pause (verken vokser eller forkorte påviselig) tilstand ved 135% og redusert dynamicity (dimer utveksling per tidsenhet) av mikrotubuli med 70%.
In vitro
, BCFMT bundet til tubulin med en dissosiasjonskonstant på 8,3 ± 1,8 mikrometer, hemmet tubulin montering og undertrykte GTPase aktivitet av mikrotubuli. BCFMT kompetitivt hemmet bindingen av BODIPY FL-vinblastin til tubulin med en hemmende konsentrasjon (K
i) på 5,2 ± 1,5 mikrometer som tyder på at det binder seg til tubulin på vinblastin nettstedet. I dyrkede celler, BCFMT-behandling depolymerisert interfase mikrotubuli, opprørt spindel organisasjon og akkumulerte sjekkpunkt proteiner (BubR1 og Mad2) på kinetochores. BCFMT-behandlede MCF-7-celler viste forbedret kjerne opphopning av p53 og dets nedstrøms p21, som følgelig aktivert apoptose i disse celler. Resultatene antydet at BCFMT hemmer formeringen av en rekke typer av kreftceller, inkludert medikament resistens celler ved å undertrykke mikrotubul-dynamikk og indikerte at forbindelsen kan ha kjemoterapeutisk potensial
relasjon:. Rai A, Surolia A, D Panda (2012) en Antitubulin Agent BCFMT hemmer spredning av kreft celler og induserer celledød ved å hemme mikrotubulidynamikk. PLoS ONE 7 (8): e44311. doi: 10,1371 /journal.pone.0044311
Redaktør: Miklos S. Kellermayer, Semmelweis University, Ungarn
mottatt: 27 april 2012; Godkjent: 01.08.2012; Publisert: 31 august 2012
Copyright: © Rai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. D.P. støttes av en DAE-SRC fellesskap, Institutt for atomenergi. SOM. støttes av en J.C. Bose fellesskap, Government of India. A.R. er en CSIR (Council of Scientific Industrial Research) fyr. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Medforfatter Avadhesha Surolia er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Utviklingen av resistens mot eksisterende kreft narkotika og metastase er blant de største hindringene i kreftkjemoterapi [1], [2]. Cellebaserte cytotoksisitetsanalyser er blitt funnet å være et attraktivt screening-metoden for å oppdage anticancermidler. Flere av de klinisk effektive anticancermidler ble først identifisert ved high throughput screening [3] – [6]. For eksempel ble taxol først oppdaget ved en høy gjennomstrømning celle basert screeningsanalyse [6].
mikrotubuli er strukturelle komponenter av den mitotiske spindel, og de dynamiske mikrotubuli spiller en viktig rolle i en rekke cellulære prosesser, inkludert intracellulær handel, celle migrering og celledelingen [7]. Flere av de mitotiske inhibitorer er kjent for å hemme mikrotubul montering [8] – [12] og inhibering av mikrotubul monterings dynamikk har vist seg å være virkningsmåte for flere klinisk vellykkede anticancer legemidler inkludert vinblastin, vinkristin, estramustin og paclitaxel [11 ], [12]. I tillegg til de kliniske anvendelser i forskjellige typer av sykdommer, inkludert kreft, sopp og parasittsykdommer [13], mikrotubul-inhibitorer er også meget nyttig for å forstå rollen av mikrotubuli i de cellulære prosesser [14], [15]. Mikrotubul-inhibitorer vanligvis blokkere cellesyklusprogresjon i mitose, og en forlenget mitotisk-rest utløser forskjellige apoptotiske reaksjonsveier [12], [16], [17].
Rhodanine avledet forbindelser er å skaffe oppmerksomhet i kjemoterapi på grunn av tilstedeværelsen av heterocyklisk ring (2-thioxothiazolidin-4-on) i de overordnede stillaser [18]. Erstatninger på den heterosykliske ringen gir en utmerket mulighet til å formulere nye derivater med bredt spekter av biologiske aktiviteter [18]. Biologiske aktiviteter av rhodaninderivater avledet forbindelser har blitt undersøkt i flere studier [18] og disse agentene utstilt antibakterielt [19], [20], antimalaria [21], antiviral [22] og kreft potensial [23]. I det foreliggende arbeid, forsøkte vi å finne en ny kjemisk enhet som har antiproliferative og antimitotiske aktivitet fra et stort subsett (et bibliotek av 156 forbindelser) av rhodaninderivater avledet stillas med en idé at forbindelsen kan ha anticancer-potensial.
Vi har funnet at tre forbindelser, nemlig (E) -5 – ((5- (2-metyl-5-nitrofenyl) furan-2-yl) metylen) -2-thioxothiazolidin-4-on (MNFMT), (E) -5 – (3,5-diklor-4-hydroksybenzyliden) -3-fenyl-2-thioxothiazolidin-4-on (DHBPT) og (Z) -5 – ((5- (4-brom-3-klorfenyl) furan-2- -yl) metylen) -2-thioxothiazolidin-4-on (BCFMT) hemmet proliferasjonen av HeLa og MCF-7-celler i kultur. Blant disse forbindelser, ble BCFMT funnet å øke den mitotiske cellepopulasjon av HeLa og MCF-7-celler mer potente enn de to andre forbindelser. BCFMT hemmet montering av renset tubulin
in vitro Hotell og i dyrkede celler mens MNFMT og DHBPT ikke viste noen signifikant effekt på tubulin montering. Vi fikk flere linjer med bevis som tyder på at BCFMT utøver sin antiproliferative og antimitotiske aktiviteter ved å dempe dynamisk ustabilitet i enkelte mikrotubuli i dyrkede celler gjennom binding på vinblastin området i tubulin. I tillegg BCFMT potent hemmet spredning av stoffet resistente nemlig cisplatin motstandsdyktig menneskelig ovarialcancer A2780-cis og multiresistent mus brystsvulst EMT6 /AR1 celler og høyt metastatiske MDA-MB-231 celler som tyder på at det kan ha kjemoterapeutisk potensial.
Materialer og metoder
Material
Sulforhodamin B, bovint serumalbumin, mus anti-α-tubulin IgG, anti-mus β-aktin-IgG, FITC-konjugert anti-kanin-IgG ble oppnådd fra Sigma, St. Louis, MO, USA. Alexa Fluor 568 geit anti-mus IgG ble kjøpt fra Molecular Probes, Invitrogen, CA, USA. Mouse anti-cyclin B1, kanin anti-p-Histone H3 (Ser 10), mus anti-p53 IgG, mus anti-p21 IgG antistoffer og apoptose deteksjon Kit (Annexin V-Propidium jodid) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, CA, USA. Mouse anti-BubR1 IgG ble hentet fra BD Biosciences, CA, USA. Kanin anti-Mad2 IgG ble kjøpt fra Bethyl laboratorier, Montgomery, USA. Mouse anti-Hec1 IgG ble kjøpt fra Abcam, Cambridge, MA, USA. Føtalt bovint serum ble hentet fra BioWest, Nuaille, Frankrike. Alle andre reagenser var av analytisk kvalitet og hentet fra Sigma, MO, USA og Himedia, Mumbai, India. Alle forbindelser ble testet ble innhentet fra Chembridge Corporation, San Diego, CA, USA.
Cell Culture
Menneskelivmorhalskreft (HeLa), menneskelig bryst adenokarsinom (MCF-7) og metastatisk brystkreft adenokarsinom ( MDA-MB-231) celler ble oppnådd fra celle omplasserer av Nasjonalt senter for Cell Science, (NCCer) Pune, India. NCCer preget cellene ved mt-rDNA sekvens for å bekrefte arten. Disse cellelinjer ble funnet å være fri for mykoplasma. Cisplatin-resistente humane ovarie carcinoma (A2780-cis) celler og multimedikamentresistent musebrysttumor (EMT6 /AR1-celler) ble innkjøpt fra Sigma, St. Louis, MO, USA. Cellelinje autentisering ble gjort av kort tandem repeat profilering og isoenzymet analyse av leverandøren og ble også rapportert negativ for tilstedeværelsen av mycoplasma.
HeLa og MCF-7 celler ble dyrket i Eagles Minimal Essential Medium (MEM). MDA-MB-231-celler ble dyrket i Leibovitz L-15 medium. A2780-cis-celler ble holdt i RPMI-1640 medium inneholdende 1 pM cisplatin. EMT6 /AR1-celler ble dyrket i MEM medium inneholdende 1 pg /ml doksorubicin. Media ble supplert med 10% føtalt bovint serum, 2,2 g /l natriumbikarbonat og 1% antibiotisk-antimykotisk oppløsning inneholdende streptomycin, amfotericin B og penicillin. Celler ble dyrket og opprettholdt ved 37 ° C inkubator i fuktig atmosfære med 5% CO
2 og 95% luft.
Screening for antiproliferative aktivitet av Rhodanine serie forbindelser
antiproliferative potensial av 156 rhodaninderivater avledet forbindelser mot HeLa-celler ble bestemt ved sulforhodamin B-analyse [24], [25]. HeLa-celler (1 x 10
5-celler /ml) ble sådd ut i 96-brønners cellekulturplater. Beholdning av forbindelsene ble fremstilt i DMSO. Etter 24 timer med såing, ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende enten bærer (0,1% DMSO) eller 2 uM av hver av de rhodaninderivater forbindelser. Etter 24 timer inkubasjon med ulike forbindelser, ble cellene fiksert med 10% TCA og behandlet for sulforhodamin B analyse [24], [25].
For å bestemme halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) av MNFMT, DHBPT og BCFMT, 1 x 10
5 celler /ml HeLa og MCF-7-celler ble sådd ut i 96-brønners cellekulturplater. Ulike konsentrasjoner av forbindelsene ble fortynnet i medium og tilsatt i brønnene etter 24 timer for celle seeding. HeLa og MCF-7 celler ble dyrket i fravær og nærvær av forbindelser for henholdsvis 24 timer og 48 timer,. Inhibering av celleproliferasjon i nærvær av forbindelsene ble bestemt ved hjelp av standard sulforhodamin B assay. Data var et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter.
lysspredning Experiment
Effektene av MNFMT, DHBPT eller BCFMT på montering av renset tubulin ble overvåket av lysspredning ved 400 nm. Tubulin ble renset som tidligere beskrevet [26], [27]. Tubulin (10 uM) i PEM-buffer (25 mM PIPES pH 6,8, 3 mM MgCl
2, 1 mM EGTA) og 1 M glutamat ble inkubert uten og med forskjellige konsentrasjoner av MNFMT, DHBPT eller BCFMT på is i 10 min. Deretter ble 1 mM GTP tilsatt til reaksjonsblandingen og monteringskinetikk ble overvåket ved 37 ° C ved hjelp av et FP-6500 spektrofluorometer JASCO, Tokyo, Japan.
Elektronmikroskopi
Tubulin (10 uM) ble polymerisert uten eller med 25 og 50 uM BCFMT ved 37 ° C i 15 minutter som beskrevet ovenfor. Prøvene ble fiksert med 0,5% glutaraldehyd, overføres til karbon-formvar belagte nett (elektronmikroskopi Sciences, USA) og negativt farget med 2% uranyl acetat. Prøvene ble visualisert under elektronmikroskop (Tecnai G
212, FEI, Eindhoven, Nederland).
Effekter av BCFMT på GTPase aktivitet av mikrotubuli in vitro
Tubulin (25 mm) i 4 M glyserol, 5 mM MgCl
2 og 1 mM GTP ble polymerisert ved 37 ° C i 30 minutter. Mikrotubulidynamikk frø ble generert ved klipping polymerer gjennom en 23 gauge nål av en 5 ml sprøyte. Tubulin (15 uM) i PEM-buffer og 1 mM GTP ble polymerisert ved å tilsette 20% (v /v) mikrotubul frø ved 37 ° C i 10 min. Etter 10 min polymerisering ble forskjellige konsentrasjoner av BCFMT tilsatt til reaksjonsblandingen og ytterligere polymerisert i 30 min. Hydrolysereaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 10% (v /v) av 7 M perklorsyre og mengden av uorganisk fosfat frigjort ble bestemt ved malakittgrønt-analyse [28].
Måling av dissosiasjonskonstanten av den Binding av BCFMT til Tubulin ved hjelp av tryptofanfluorescens av Tubulin
Tubulin (2 uM) i 25 mM PIPES-buffer pH 6,8 ble inkubert uten og med forskjellige konsentrasjoner av BCFMT ved 25 ° C i 20 min. Fluorescensintensiteten ble målt ved å eksitere reaksjonsblandingen ved 295 nm og emisjonsspektrumet ble registrert i området fra 310 nm til 370 nm. En fluorescens celle på 0,3 cm banelengde ble brukt og fluorescensstyrkene ble korrigert for indre filtereffekt ved bruk av formelen
Fluorescens-data ble montert i den følgende ligning, hvor, er AF endringen i fluorescens-intensiteten av tubulin i nærvær av BCFMT, AF
max er den maksimale endring i fluorescens-intensiteten av tubulin når den er mettet med BCFMT og C er konsentrasjonen av BCFMT. Dissosiasjonskonstant (K
d) for BCFMT binding til tubulin ble estimert ved hjelp av Graph Pad Prism 5-programvaren (Graph Pad Software, CA, USA).
Effekt av BCFMT på BODIPY FL-vinblastin Binding til tubulin
tubulin (2 uM) i 25 mM PIPES-buffer pH 6,8 ble inkubert uten og med 10, 25 og 50 uM BCFMT i 20 minutter ved 25 ° C. BODIPY FL-vinblastin (2 uM) ble tilsatt i reaksjonsblandingen og inkubert ved 25 ° C i ytterligere 20 min i mørket. Tubulin-BODIPY FL-vinblastin komplekset ble eksitert ved 490 nm og emisjonsspektrumet ble tatt i området 500-550 nm [29]. Spekteret av BODIPY FL-vinblastin i fravær av tubulin ble også overvåket.
Immunofluorescence Mikros
MCF-7 eller HeLa-celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /ml på polylysin-belagt dekkglass i 24-brønners cellekultur plate. Etter 24 timer med såing, ble forskjellige konsentrasjoner av BCFMT tilsatt i brønnene. Kontrollceller ble behandlet med bærer (0,1% DMSO). Etter 24 eller 48 timer inkubasjon med BCFMT, ble farging utført ved hjelp av antistoff mot α-tubulin, p53, p21, BubR1, cyclin B1, β-aktin (1 ° 1:300, 2 ° 1:300 Alexa-568-merket), phosphohistone-H3 (Ser 10) (1 ° 1:300, 2 ° 1:300 FITC-merket), Hec 1 (1 ° 1:800, 2 ° 1:800 alexa-568-merket) og Mad2 (1 ° 1:500 , 2 ° 1:500 FITC-merket), som beskrevet tidligere [29] – [32]. DNA ble farget med Hoechst 33258 (1 pg /ml). Bilder ble tatt ved hjelp av Eclipse TE 2000U mikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) på 40 x forstørrelse og behandlet ved hjelp av Image-Pro Plus-programvare (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Målinger av mikrotubulidynamikk i MCF- 7 Cells
Transfeksjon av EGFP-α tubulin konstruere i MCF-7 celler ble gjort ved hjelp lipofektamin-2000 [29]. De kinetiske parametere for dynamisk ustabilitet av mikrotubuli ble bestemt som beskrevet tidligere [8], [31] -. [34]
Western blot-analyse
MCF-7-celler ble inkubert i fravær og nærvær av 20 og 40 uM av BCFMT i 36 timer. Virkningen på det polymeriserte mengde av mikrotubuli i cellene ble bestemt ved Western-blotting ved anvendelse av monoklonalt antistoff for α-tubulin som tidligere beskrevet [31]. Intensitet av proteinbåndene ble beregnet ved hjelp av Image J programvareversjon 1.43u.
Effekter av BCFMT på Kinetics av utgivelsen av nocodazol-indusert Mitotisk Block i MCF-7 celler
MCF-7 cellene ble blokkert i M-fasen av cellesyklusen etter 24 timers behandling med 1 pM nocodazol. For å fjerne nocodazol ble cellene cytospinned og vaskes forsiktig tre ganger med frisk media. Etter fjerning nocodazol, ble celler inkubert i fravær og nærvær av 40 uM BCFMT ved 37 ° C. Celler ble fiksert på 0, 1, 2 og 4 timers inkubering med BCFMT ved 37 ° C inkubator. Faste celler ble farget med Hoechst 33258 og mitotiske celler ble scoret (n = 3, i hvert sett 1000 celler ble talt).
Annexin V /PI Farging
MCF-7 celler (5 x 10
4 celler /ml) ble sådd ut på polylysin-belagte dekkglass i en 24-brønners cellekulturplate. Etter 24 timers såing, ble celler inkubert uten og med forskjellige konsentrasjoner av BCFMT i 48 timer. Celler ble oppsamlet ved cytospinning ved 2400 rpm ved 30 ° C i 10 min. Annexin V /PI farging ble utført som beskrevet tidligere [30].
Resultater
Effekter av rhodaninderivater på spredning av HeLa og MCF-7 celler
Vi undersøkte antiproliferative potensialet av 156 rhodaninderivater forbindelser ved hjelp av HeLa-celler. Blant 156 forbindelser, tre forbindelser, nemlig MNFMT, DHBPT og BCFMT (Fig. 1A), ble funnet å hemme HeLa celleproliferasjon 30% ved 2 mikrometer. MNFMT, DHBPT og BCFMT ble valgt for videre studier. MNFMT, DHBPT og BCFMT inhiberte proliferasjonen av HeLa (fig. 1B) og MCF-7 (fig. 1C) celler med en halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) på 16,8 ± 1, 7.3 ± 0.4, 7.2 ± 1.8 um, og 12,2 ± 0,3, 4,9 ± 0,3 og 10,0 ± 0,5 mikrometer, henholdsvis.
(A) Komposisjoner av MNFMT, DHBPT og BCFMT. (B derfor vi utforsket ytterligere antimitosemekanisme aktivitet BCFMT.
BCFMT økt mitotisk indeks av MCF-7 og HeLa celler
I mitotiske celler Histone H3 blir fosforylert på serin 10 [36 ], og den brukes som en markør for mitotiske celler. BCFMT behandling økt antall phosphohistone-H3 positive celler (figur S1 i saksdokumenter). For eksempel ble 2 ± 0,5%, 7 ± 1%, og 11,5 ± 1,5% cellene funnet å være phosphohistone-H3 positiv i fravær og nærvær av 20 uM og 40 BCFMT, respektivt. Videre BCFMT-behandling økte metafase /anafase-forholdet i MCF-7-celler. I de vehikkelbehandlede MCF-7-celler, ble det metafase /anafase-forholdet bestemt til å være 2,7 ± 1,2, mens i nærvær av 20, 30 og 40 uM BCFMT ble det metafase /anafase-forhold bestemt til å være 5 ± 1, 10 ± 2 (p 0,001) og 15 ± 1 (p 0,001) (n = 3, og i hvert sett 1000 celler ble telt), respektivt. Den økte mitotisk indeks og metafase /anafase-forholdet antydet at BCFMT hemmet cellesyklusprogresjon av MCF-7-celler i mitose. BCFMT også funnet å undertrykke mitotisk progresjon av HeLa-celler som bestemmes av mitotisk indeks, phosphohistone-H3 flekker og meta /anaphase forhold (Figur S2 i Hjelpemiddel Information).
Videre BCFMT behandling ble funnet å forsinke kinetikk av utgivelsen av nocodazole- indusert mitotisk blokk i MCF-7 celler. For eksempel ble 60% av cellene funnet å være i mitose ved nocodazol utvasking, mens 30%, 15% og 5% celler som var i den mitotiske fase etter en, to og fire timer frigjøring av nocodazol blokken. I nærvær av 40 uM BCFMT, 46%, 38% og 30% cellene ble funnet å være i den mitotiske fase etter en, kan to og fire timer av blokk frigivelse som tyder på at BCFMT undertrykke mitotisk progresjon.
BCFMT hemmet in vitro tubulinpolymerisering
Siden BCFMT hemmet cellecyklusprogresjonen på M fasen av cellesyklus; vi undersøkt om BCFMT kan forurolige microtubule montering
in vitro Hotell og i dyrkede celler. BCFMT hemmet sammenstillingen av renset tubulin i en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 2A). For eksempel, i nærvær av 25, 50 og 100 uM BCFMT, ble graden av tubulin polymerisering inhibert ved 27 ± 3%, ± 38 4,5% og 64 ± 3%, respektivt. Den første økningen av lysspredning intensiteten av mikrotubuli sammenstillingen reaksjonen ble bestemt til å være 0,97 ± 0,03, 0,54 ± 0,07 og 0,28 ± 0,06 (Au /sek) i fravær og nærvær av 50 uM og 100 BCFMT, noe som tyder at BCFMT sterkt redusert utgangshastighet på tubulin montering. Elektronmikroskopibilder av styre viste typiske mikrotubul-polymerer (Fig. 2B). I nærvær av 25 uM BCFMT, ble færre mikrotubuli funnet i hvert felt av observasjons enn kontrollen. Det er også indusert aggregering av tubulindimerer. I nærvær av 50 uM BCFMT, mikrotubuli-dannelsen var sterkt hemmet og bare tubulin aggregater ble funnet (Fig. 2B). Under like forhold, DHBPT og MNFMT hadde ingen signifikant effekt på microtubule montering. For eksempel, 50 uM DHBPT hadde ingen påvisbar effekt på lysspredningen av mikrotubuli-sammenstillingen og 50 uM MNFMT redusert lysspredning signal av mikrotubuli enheten bare med 10%.
(A) Tubulin (10 uM) ble polymerisert i fravær (▪) og nærvær av 10 (◊), 25 (▴), 50 (x), 75 (○) og 100 (□) uM BCFMT. (B) elektronmikroskopibilder av tubulin polymerer i fravær og nærvær av 25 uM og 50 BCFMT. Målestokken er 2000 nm. (C) BCFMT undertrykte GTPase aktivitet av mikrotubuli. Effekter av vinblastin på GTPase aktivitet av mikrotubuli under lignende forsøksbetingelser er vist i den innfelte. Data var et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. Barer representerer ± SD.
Videre fant vi ut effekten av BCFMT på GTPase aktivitet av mikrotubuli. BCFMT redusert frigjøring av uorganisk fosfat i en konsentrasjonsavhengig måte. For eksempel, 20, 30 og 50 uM BCFMT redusert mengden av uorganisk fosfat frigjort med 17%, 25% og 32%, respektivt (figur 2C.). Under lignende eksperimentelle betingelser, 1, 2, 4 og 10 uM vinblastin redusert mengden av uorganisk fosfat frigjort med 12%, 20%, 25% og 35%, henholdsvis, noe som indikerer at BCFMT hemmer GTPase aktivitet av mikrotubuli som vinblastin (fig. 2C innfelt).
Karakterisering av det binding av BCFMT til tubulin
den indre tryptofanfluorescens av tubulin har blitt mye brukt for å bestemme bindingskonstanten av en ligand til tubulin [37]. BCFMT redusert den indre tryptofanfluorescens intensiteten av tubulin i en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 3A). For eksempel, i nærvær av 10 pM BCFMT tryptofanfluorescens av tubulin ble redusert med 21 ± 2,5%. Montering av fluorescensen forandrer seg i en bindings isotermen, ga K
d på 8,3 ± 1,8 uM (fig. 3B).
(A) Virkningen av BCFMT på tryptofanfluorescens spektra av tubulin er vist. Spektrene ble overvåket i fravær (♦) og nærvær av 0,25 (▪), 0,5 (▴), 1 (x) 2 (-), 5 (○), 7 (l) og 10 (•) uM BCFMT. (B) Endringen i fluorescens-intensiteten av tubulin (AF) ble plottet mot konsentrasjonen av BCFMT. Dissosiasjonskonstant (K
d) for BCFMT binding til tubulin ble beregnet ved hjelp av en ligning som er beskrevet i fremgangsmåtene. Data var gjennomsnittet av fire uavhengige eksperimenter. (C) Reduksjon i fluorescensintensiteten av tubulin- BODIPY FL-vinblastin kompleks i fravær (♦) og nærvær av 10 (▪), 25 (▴) og 50 (•) uM BCFMT. (D) Tubulin (2 uM) i 25 mM PIPES-buffer (pH 6,8) ble inkubert uten og med forskjellige konsentrasjoner (5, 10, 15, 20, 25 um) av BCFMT ved 25 ° C i 20 min. Tre slike forskjellige sett var forberedt. Etter 20 min inkubasjon, i ett sett 2 mikrometer (♦), i det andre settet 4 mikrometer (▴) og i det tredje settet 6 mikrometer (▪) BODIPY FL-vinblastin ble lagt. Fluorescens av tubulin-BODIPY FL-vinblastin komplekset ble målt, og den inhiberende konsentrasjon (Ki) ble beregnet fra den modifiserte Dixon plot.
Inhibitorer av tubulin sammenstilling generelt enten bindes til det vinblastin eller kolchicin bindingssetene i tubulin [11], [12]. Derfor undersøkte vi om BCFMT binder seg til tubulin på kolkisin området ved hjelp av kolkisin-tubulin fluorescens [38]. BCFMT (10 og 20 mm) ikke hemme utviklingen av kolkisin-tubulin fluorescens indikerer at det ikke hemmer binding av kolkisin til tubulin (figur S3 i saksdokumenter). BODIPY FL-vinblastin er blitt brukt for å undersøke bindingssetet av vinblastin i tubulin [29]. Fluorescensintensiteten av BODIPY FL-vinblastin øket ved binding til tubulin (Fig. 3C). Vinblastine redusert fluorescens forbedring av BODIPY FL-vinblastin som tyder på at det binder seg til vinblastin nettstedet i tubulin. BCFMT også redusert fluorescens BODIPY FL-vinblastin-tubulin kompleks i en konsentrasjonsavhengig måte som indikerer at BCFMT hemmet bindingen av BODIPY FL-vinblastin til tubulin (Fig. 3C). For eksempel, 10, 25 og 50 uM BCFMT redusert fluorescens BODIPY FL-vinblastin-tubulin-komplekset med 40 ± 2,5%, 51 ± 3% og 64 ± 4%, respektivt.
Videre BODIPY FL- vinblastin viste en signifikant økning i fluorescens-polarisasjonsverdi når den ble bundet til tubulin (figur S4 i den bærende Information). Inkludering av BCFMT i reaksjonsmiljøet redusert polarisasjonen av BODIPY FL-vinblastin indikerer at det reduserte bindingen av BODIPY FL-vinblastin til tubulin. I forhold til kontroll ble 20 ± 3%, 31 ± 4% og 49 ± 2% reduksjon i fluorescens-polariserings verdier av tubulin-BODIPY FL-vinblastin observert i nærvær av 10, 25 og 50 uM av BCFMT, respektivt.
Siden BCFMT hemmet BODIPY FL-vinblastin binding til tubulin, vi undersøkte modus hemming ved hjelp av modifisert Dixon tomten [39]. En analyse av den modifiserte Dixon plott antydet at BCFMT inhiberte bindingen av BODIPY FL-vinblastin til tubulin konkurrerende med en inhiberende konsentrasjon (K
i) på 5,2 ± 1,5 uM (fig. 3D).
A kort eksponering av BCFMT depolymerisert mikrotubuli i MCF-7 celler
for å undersøke effekten av BCFMT på cellulære mikrotubuli, ble MCF-7 celler inkubert uten og med 40 mikrometer BCFMT i 3 timer. Bærer-behandlede celler viste typisk nettverk av mikrotubuli mens BCFMT (40 uM) behandlede celler viste en signifikant depolymerisering av mikrotubuli (Fig. 4A). Mikrotubul-polymerer var ikke synlig i 40 uM BCFMT-behandlede celler; ble det observert diffus farging for oppløselig tubulin i de behandlede MCF-7-celler.
(A) Celler ble behandlet uten og med 40 uM BCFMT i 3 timer og mikrotubuli ble farget ved bruk av antistoff mot α-tubulin (rød) . (B) BCFMT opprørt inter microtubuli organisering av MCF-7 celler. MCF-7-celler ble inkubert i fravær og nærvær av forskjellige konsentrasjoner av BCFMT i 48 timer. Cellene ble fiksert og farget ved hjelp av antistoff mot α-tubulin (rød). (C) BCFMT redusert forholdet av polymer /oppløselig tubulin i MCF-7-celler bestemt ved western blot. MCF-7-celler ble behandlet uten (kolonne 1) eller med 20 uM (kolonne 4) og 40 uM (kolonne 5) av BCFMT i 36 timer. 20 nM taxol (kolonne 2) og 200 nM nocodazol (kolonne 3) ble også anvendt under lignende forsøksbetingelser. Polymere og løselige fraksjoner ble isolert tubulin og like mengder av protein ble applisert på SDS-PAGE. Immunoblotting ble utført med α-tubulin-antistoff. Eksperimentet ble gjennomført uavhengig av hverandre tre ganger. Vist er representant blot. (D) BCFMT depolymerisert spindel mikrotubuli i MCF-7-celler. DNA farget i blått. Målestokken er 10 mikrometer.
BCFMT depolymerisert mikrotubuli av MCF-7 og HeLa-celler
MCF-7 eller HeLa-celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av BCFMT for en cellesyklusen. BCFMT depolymeriserte interfase mikrotubuli i MCF-7-celler på en konsentrasjonsavhengig måte. For eksempel, mikrotubul nettverk var ikke synlig opprørt i nærvær av 10 pM BCFMT mens 20 uM BCFMT induserte en signifikant depolymerisering av interfase mikrotubuli og en sterk depolymerisering av mikrotubuli ble observert i nærvær av 30 uM BCFMT (Fig. 4B). Western blot-analyse indikerte at i vehikkelbehandlede MCF-7-celler, forholdet mellom polymer til løselig tubulin var 2,2 ± 0,3, mens det var 1,2 ± 0,1 og 0,8 ± 0,1 i nærvær av 20 og 40 uM BCFMT, henholdsvis som tyder på at BCFMT behandlingen depolymeriserte cellulære mikrotubuli (fig. 4C). At polymeren oppløselig tubulin-forholdet i MCF-7-celler ble funnet å være 3,1 ± 0,2 i nærvær av 20 nM taxol og 1,1 ± 0,1 i nærvær av 200 nM nocodazol (fig. 4C). BCFMT-behandling depolymerisert spindel mikrotubuli i MCF-7-celler og også indusert dannelse av monopolare eller multipolar spindler med feiljustert kromosomene ved metafase platen (fig. 4D). På samme måte som dens virkning på MCF-7 celler, BCFMT depolymerisert mikrotubuli i HeLa-celler i sin effektiv spredning inhiberende konsentrasjonsområde (fig S5 i den bærende Information). Men BCFMT (15 og 30 mm) behandling ikke forurolige organiseringen av aktin fibre i MCF-7 celler (figur S6 i saksdokumenter).
BCFMT Trykt microtubule remontering i MCF-7 celler
mikrotubuli ble depolymerisert ved inkubering av MCF-7-celler på is i 1 time og deretter ble de vekstkinetikken av interfase mikrotubuli overvåket ved å inkubere cellene ved 37 ° C. Mikrotubuli i de bæremiddelbehandlede celler vokste raskt og oppnådde normal interfase nettverk i løpet av 30 minutter mens BCFMT (40 uM) behandling sterkt undertrykt veksten av mikrotubuli (fig S7A i støtte Information).
Videre er effekten av BCFMT på samlekinetikken av spindelen i mitotiske MCF-7-celler ble analysert. Celler ble først blokkert i mitose ved å inkubere dem med 1 uM nocodazol i 20 timer. Celler ble omhyggelig vasket med friskt medium og videre inkubert på is i 30 min uten og med 40 uM BCFMT. Deretter ble cellene plassert ved 37 ° C og monteringen kinetikken til spinde mikrotubuli ble overvåket ved å farge mikrotubuli ved forskjellige tidsintervaller.
