Abstract
Anti-HER2 monoklonalt antistoff 1E11 har sterk og synergistisk anti-tumor aktivitet i HER2-overuttrykk mage kreftceller når de brukes i kombinasjon med trastuzumab. Vi i dag optimalisert dette antistoffet for human-terapi. Først ble de komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) av murint antistoff podet på humane kimlinje immunoglobulin variable gener. Det ble ikke observert forskjell i affinitet og biologisk aktivitet mellom kimære 1E11 (ch1E11) og humanisert 1E11 (hz1E11). Deretter ble affinitet modningen av hz1E11 utført av randomisering av CDR-L3 og H3 rester etterfulgt av selektiv utvelgelse biopanning. Mildere seleksjonstrykk begunstiget valg av flere forskjellige kloner, mens høyere stringens utvalg resulterte i konvergens av panorering utgang til et mindre antall kloner med forbedret affinitet. Clone 1A12 hadde fire aminosyresubstitusjoner i CDR-L3, og viste en 10 ganger høyere affinitet i forhold til foreldre klone og økt potens i en
in vitro
anti-proliferativ aktivitet analysen med HER2-overepxressing magekreft celler. Clone 1A12 hemmet tumorvekst av NCI-N87 xenograft modell med tilsvarende effekt på trastuzumab alene, og kombinasjonen behandling av 1A12 og trastuzumab helt fjernet de etablerte svulster. Disse resultatene tyder på at humanisert og affinitetsmodnede monoklonalt antistoff 1A12 er en svært optimalisert molekyl for fremtidig terapeutisk utvikling mot HER2-positive tumorer
Citation. Ko BK, Choi S, Cui LG, Lee YH, Hwang IS, Kim KT, et al. (2015) Affinity Modning av monoklonalt antistoff 1E11 av målrettet randomisering CDR3 Regioner Optimaliserer Terapeutisk antistoff målretting av HER2-positiv Gastric Cancer. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10,1371 /journal.pone.0134600
Redaktør: Mitchell Ho, National Cancer Institute, NIH, UNITED STATES
mottatt: 14. april 2015. Godkjent: 12 juli 2015; Publisert: 30.07.2015
Copyright: © 2015 Ko et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av AbClon Inc., og ved National Research Foundation of Korea (NRF) tilskudd til HS for Medicinal Bioconvergence Research Center (NRF-2013M3A6A4044991) . Den kommersielle Funder (AbClon Inc.) gitt støtte i form av lønn for forfattere (BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, og JSL), men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutningen om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, og JSL er alle ansatt ved AbClon Inc. og kan eie sin lager. HS er på betalt rådgivning til AbClon Inc. og eier også sitt lager. Abclon arbeider patenter og produktutvikling på forbindelser som er nevnt i denne artikkelen. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, og JSL er alle ansatt i den kommersielle Funder av denne forskningen AbClon Inc. og kan eie sitt lager. HS er for tiden på betalt rådgivning til AbClon Inc. og eier også sitt lager. AbClon har registrert patent i Korea (KR10-1453462, antistoffer som kan binde spesifikt til HER2) og arkivert en PCT-søknad (PCT /KR2014 /004317, antistoff spesifikt bindes til HER2) der BKK, YHL, ISH, KTK, og JSL er oppført som oppfinnere. AbClon forfølger også produktutvikling på humanisert, affinitet-modnet antistoffer som er nevnt i denne artikkelen. Disse endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Monoklonale antistoffer er mainstream behandlinger i onkologi og autoimmune sykdommer, og forventes å spille viktige roller i fremtiden sykdomsbehandling [1, 2]. Mer enn 30 rekombinante antistoffer er i dag godkjent av USAs Food and Drug Administration, hvorav ca halvparten er anti-kreft antistoffer. Magekreft er en av de mest vanlige kreftformer og i det tredje ledende årsak til kreft død på verdensbasis [3]. I magekreft, overekspresjon av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 (HER2), og HER3 er korrelert med dårlig prognose [4, 5]. Nylig ble HER2 rettet mot monoklonalt antistoff trastuzumab godkjent for behandling av HER2-positiv metastatisk adenokarsinom og gastroøsofageal krysset kreft basert på resultatene av Trastuzumab med kjemoterapi i HER2-positiv avansert Gastric Cancer (toga) klinisk studie [6].
Spesielle kombinasjoner av gjensidig noncompetitive antistoffer rettet mot samme reseptor økning anti-tumor aktivitet
in vitro Hotell og
in vivo
. Kombinasjonen av HER2 rettet mot antistoffer, trastuzumab og pertuzumab, viser økt effekt hos HER2-overuttrykk brystkreft [7]. Fordelene med pertuzumab og trastuzumab har blitt ytterligere demonstrert i prekliniske og kliniske studier [8, 9]. Andre HER2-rettet mot antistoffer som viser bedre effekt i kombinasjon enn som enkle midler, og har vist jevn nedregulering av HER2 nivåer og gunstige kombinasjonseffekter i musemodeller [10]. Den økte effekten av antistoffkombinasjoner har også blitt demonstrert med EGFR-targeting antistoffer [11, 12] og vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 3 (VEGFR3) for målretting for antistoffer [13].
Terapeutiske antistoffer vanligvis er mye konstruert for å ha ønskelige biologiske og fysikalsk-kjemiske egenskaper, slik som lav immunogenisitet, høy affinitet og spesifisitet, optimale effektorfunksjoner, og god løselighet og stabilitet [14]. Spesielt antistoff menneskeliggjøring og tilhørighet modning er to av de mest anvendte tekniske prosesser under utviklingen av terapeutiske antistoffkandidater. Immunogenisitet av terapeutisk antistoff begrenser den kliniske anvendelsen og effektiviteten ved produksjon av anti-stoff-antistoffer [15], og den humanisering av antistoffer fra mus eller andre arter er nå en standardprosedyre for utvikling av terapeutiske antistoffer. Noen menneskeliggjøring metoder har blitt utviklet som benytter enten rasjonelle eller empiriske tilnærminger [16]. De komplementaritetsbestemmende område (CDR) poding metode som metode for å overvinne den humane anti-kimært antistoff (HACA) reaksjon [17] er en veletablert metode humanisering. Imidlertid, direkte poding av murine CDR’er på et humant rammeverk akseptor-sekvens ofte resulterer i et tap av affinitet, slik at tilbake-mutasjoner av rammeverksregionrester (Vernier sone rester) som støtter strukturen til CDR sløyfene er ofte nødvendig for [18]. For
in vitro
affinitet modning, tre diversifiserings tilnærminger brukes vanligvis: tilfeldig mutagenese av f.eks utsatt for feil PCR, randomisering av målrettede rester ved hjelp degenererte oligonukleotider, og kjeden shuffling. I den målrettede randomisering tilnærming, CDR er den logiske mål for randomisering i de fleste tilfeller fordi somatisk hypermutasjon har utviklet seg til å favorisere mutasjoner i CDR av antistoffer [19], og CDR-H3 og CDR-L3 har en tendens til å dominere antistoff-antigen-interaksjon [ ,,,0],20]. Ett av hovedproblemene i forbindelse med den målrettede randomisering velge de stillinger som ikke er essensielle for den antigen bindende, men som kan forbedre affiniteten når optimal substitusjon av aminosyren er gjort. Alaninskanning kan hjelpe avgjøre restene å random, spesielt når CDR er lange. Noen ganger, alaninmutasjon seg selv øker affinitet antistoffer [21].
Vi har tidligere utviklet en museantistoff rettet mot HER2 (klone 1E11) som viser synergistisk antitumor aktivitet i kombinasjon med trastuzumab ved HER2 overekspresjon mage kreft cellelinjer [22 ]. I denne rapporten beskriver vi hvordan vi optimalisert 1E11 for en terapeutisk antistoff ved CDR poding til menneskelig kimcellelinje immunoglobulinvariable gener og tilhørighet modning gjennom målrettet randomisering av CDR-H3 og CDR-L3. Den optimaliserte 1E11 antistoff (klone 1A12) viser synergistisk antitumor aktivitet i HER2-positiv magekreft xenograft modeller i kombinasjon med trastuzumab. Det ble observert at for klon 1E11, humane kimlinje variable gener er egnede akseptorer for humanisering uten affinitet reduksjon og substitusjon av CDR-L3-rester som ikke er essensielle for antigenbinding var nok til å forbedre affiniteten av mer enn 10 ganger.
materialer og metoder
cellelinjer og materialer
NCI-N87 celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og OE-19 celler ble hentet fra European Collection of Cell Culture (ECACC, Porton Down, UK). Cellekulturmediet var RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika og cellene ble dyrket ved 37 ° C under 5% CO
2. Trastuzumab og palivizumab ble produsert av Genentech (South San Francisco, CA, USA) og MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, USA), henholdsvis. ChromPure humant IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) ble anvendt som kontroll humant IgG-antistoff for
in vitro
analyser. IgG antistoffer ble produsert ved hjelp av Freestyle 293 system (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og renset ved hjelp av protein-A affinitetskromatografi (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Endotoksin ble fjernet med en endotoksin Removal Kit (GenScript, Piscataway, NJ, USA), og endotoksin nivåer ble bestemt ved hjelp av et endotoksin Detection Kit (GenScript). Rekombinante proteiner ble produsert som utskilte proteiner ved hjelp av Freestyle 293 systemet og renset ved hjelp av protein-A eller Ni-NTA kromatografi (Qiagen, Valencia, CA, USA) for Fc-merket eller Hans-merket proteiner, henholdsvis.
alanin-skanning mutagenese og Fab rensing
Seterettet rettet~~POS=HEADCOMP mutagenese for alaninskanning ble utført ved PCR-mutagenese hjelp Quickchange seterettet mutagenese Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Mutante Fab-proteiner ble uttrykt og renset for å vurdere betydningen av hver rest av antigen bindingsaktivitet. I korte trekk,
Escherichia coli
DH5a-celler transformert med vektoren som rommer pComb3X mutante Fab-gener ble dyrket ved 28 ° C i SB kjøttkraft. Ekspresjon ble indusert med 1 mM isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid når den optiske densitet (600 nm) av kulturen nådde 0,8. Cellepelletene ble resuspendert i kald ekstraksjon buffer (120 mM Tris, pH 8,0, 0,3 mM EDTA og 300 mM sukrose) og inkubert på is i 30 minutter for periplasmiske ekstraksjon. Magnesiumklorid (2,5 mM) ble tilsatt til den klarede ekstrakt etter sentrifugering for å absorbere fri EDTA før immobilisert metallion-affinitetskromatografi (IMAC) rensing. Purified Fab proteiner ble brukt for ELISA bindingsanalysen og
k
off analyse ved hjelp av overflaten plasmon resonans (SPR).
Affinity modning Anmeldelser
humanisert 1E11 klonet i pComb3X vektor som Fab format ble anvendt som templat for overlappende ekstensjon polymerase kjedereaksjon (PCR) mutagenese, som beskrevet tidligere [23]. De degenererte oligonukleotider (Integrated DNA Technologies, Coral, IA, USA) 5′-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 «(bakover) og 5′-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Fremover) ble brukt for L-NNK og H-XXS bibliotek, henholdsvis. N betegner A, C, G eller T; M er C eller A; og S er G eller C nummebasisposisjoner indikere håndblandet nukleotider som består av 70% av en base og 10% hver av de tre andre baser: 70% hyppighet base er G, A, T, og C i 1, 2, 3 og 4, henholdsvis. For H-2AA bibliotek, ble en ekvimolar blanding av de følgende fremover mutagene oligonukleotider brukt: 5»-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 «, 5′-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3′, 5»-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 «, 5′-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3′ , 5»-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 «, og 5′-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3». K betegner G eller T. Etter to runder med overlapping utvidelse PCR, Fab bibliotek DNA med en randomisert CDR ble kuttet med SfiI, ligert inn i SfiI-fordøyd phagemidvektor pComb3X, og electroporated inn
E
.
coli
belastning ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).
høy affinitet bindemidler ble valgt ved hjelp løselig biotinylated HER2-ECD protein. Bead bindemidler ble pre-utarmet ved å inkubere antistoffet fagbibliotek med 100 pl av pre-blokkerte Dynabeads M-280 streptavidin (Invitrogen) i 1 time under langsom rotasjon ved romtemperatur. Biotinylert HER2-ECD-protein (100 nM- 12:01) ble tilsatt til pre-utarmet antistoffbibliotek og inkubert i en time med rotasjon ved romtemperatur. Deretter ble 50 ul av blokkerte streptavidin-magnetiske kuler ble tilsatt og inkubert på rotatoren i 15 minutter. Perlene ble vasket 10 ganger med 1 ml Tris-bufret saltvann-Tween 20 (TBST) og to ganger med 1 ml PBS. Bundet fag ble eluert ved inkubering av perlene med 1 ml 100 mM trietylamin i 8 minutter og deretter nøytralisert med 0,5 ml 1 M Tris, pH 7,4.
ELISA-bindingsaktivitet test
Antistoffer ble tilsatt til Costar 96-brønners halv område plater (Corning, Corning, NY, USA Produkt No. 3690) belagt med 1 ug /ml antigenet. Etter inkubasjon ved romtemperatur i en time ble platene vasket tre ganger med TBST og inkubert med kanin anti-humant antistoff-pepperrot peroksydase (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) for IgG-antistoffer og rotte-anti-HA-HRP (Clone F10, Roche Life Science, Basel, Sveits) for Fab antistoffer, henholdsvis. Platene ble vasket tre ganger, tetrametylbenzidin (TMB) peroksydasesubstrat (SurModics, Eden Prairie, MN, USA) ble tilsatt, og reaksjonene ble stanset ved tilsetning av 1 N svovelsyre (DukSan, Ansan, Korea). Absorbans ved 450 nm ble målt ved hjelp av en Victor X3 instrument (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).
Surface plasmonresonans analyse
For
k
off analyse av Fab-proteiner, HER2-ECD-His-protein ble immobilisert på overflaten av en CM5 sensorbrikke (GE Healthcare) ved å benytte aminet koblingsmetode ved omtrent 2000 responsheter (RU). Renset Fab-proteiner ble injisert ved 2 ug /ml konsentrasjon og en strømningshastighet på 50 mL /minutt. For
k
av analyse av IgG-antistoffer, geit anti-humant IgG (γ) (Invitrogen, katalog nr. H10500) ble immobilisert på den CM5 sensorbrikken ved hjelp av amin-kobling, og antistoffene ble tatt ved 1 ug /ml i 4 minutter og stabilisert i 5 minutter ved en strømningshastighet på 50 mL /minutt. HER2-ECD-His protein ble injisert ved en konsentrasjon på 160 nM. For affinitet målinger, ble antistoffer fanget ved omtrent 50 RU med geit anti-humant IgG (γ) immobilisert på en CM5 chip. HER2-ECD-His proteinet ble injisert ved konsentrasjoner i området 0-640 nM. Sensorgrams ble oppnådd ved hver konsentrasjon og evaluert ved å bruke BIAevaluation programvare. For epitop binning, ble IgG form av hz1E11 immobilisert på separate CM5 sensor chip flater på ca 1000 respons enheter. HER2-ECD-His (320 nM) og antistoff (1 ug /mL) ble sekvensielt tilsatt i 4 minutter og stabilisert i 5 minutter ved en strømningshastighet på 50 mL /minutt.
Celleviabilitet assay
Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater (Corning) i 10% FBS inneholdende medium og pre-dyrket i 24 timer. Cellene ble behandlet med antistoffer ved de angitte konsentrasjoner og kultur i 4 dager. WST-en reagens (Dogen EZ-Cytox, Daeil Lab Service, Seoul, Korea) ble brukt til å måle cellenes levedyktighet. Relativ cellenes levedyktighet ble beregnet ved å dividere absorbansen av hver brønn ved bety absorbansen PBS-behandlede brønner på hver plate.
Xenotransplantat studie
atymiske nakne hunnmus (Daehan Biolink, Chungbuk, Korea ) ble injisert subkutant i venstre flanke med 5 × 10
6 av NCI-N87 celler i Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Tumorene fikk vokse til ca. 200 mm
3 i størrelse, og musene ble deretter randomisert i grupper. Dyr fikk intraperitoneal administrering av antistoff ved de angitte doser to ganger ukentlig. Tumorvolumene ble beregnet ved anvendelse av formelen (L x W x w) /2, hvor L representerer den største tumordiameter og W representerer den minste tumordiameter. To-veis gjentatte tiltak ANOVA etterfulgt av Bonferroni post testen ble utført for statistisk analyse av tumor growth.All dyrestudier ble gjennomført i samsvar med retningslinjene fra NIH er «Guide for omsorg og bruk av dyr», og godkjent protokoll mottatt av selskapets Institution Animal Care og bruk komité.
Resultater
human 1E11 utført av CDR-poding til menneske germline gener
for å utvikle humanisert antistoff, VH og VL sekvenser av den murine 1E11 ble sammenlignet med human kimlinje V og J-genet repertories ved hjelp IMGT /V-QUEST-analyseverktøy [24]. For den tunge kjeden, IGHV3-48 * 03 og IGHJ4 * 01 utstilt høyeste homologi til 1E11 kolleger, deling 85% og 87% identitet, henholdsvis. For den lette kjede, humane IGKV1-39 * 01 og IGKJ1 * 01 gener viste identitet på 80% og 81%, respektivt. Disse humane gener ble valgt som akseptor sekvenser for poding av de murine CDR’ene. Blant de Vernier sone, som består av rester i rammeverkregion som er involvert i fremstillingen av CDR-strukturer ved å støtte den CDR-løkker [18, 25], bare en rest ved stilling 49
H av tungkjede varierte mellom murine og menneskelige sekvenser. Følgelig humanisert 1E11, hz1E11, har bare en murine residuet i rammeverkregionene (figur 1).
Heavy chain (A) og lettkjede (B) aminosyresekvens innretting av murin, human kimlinje, og humanisert 1E11. CDR-rester, definert i henhold til Kabat definisjonen, er vist i fet skrift. Aminosyrer er nummerert i henhold til Kabat-nummerering. Kolon representerer vanlige rester mellom murine og humane germline sekvenser.
Binding aktivitet hz1E11 til ekstracellulære region (ECD) av HER2 var som tilsvarer ch1E11 (2A), og affinitet trastuzumab, ch1E11 og hz1E11 var 3 nM, 23 nM og 23 nM, respektivt. Vi bekreftet også at hz1E11 bundet til sub-domenet IV som foreldre ch1E11. Trastuzumab binder også til sub-domenet IV [26].
in vitro
anti-proliferative aktiviteter hz1E11 som monoterapi og i kombinasjon med trastuzumab var også lik de av ch1E11 (Fig 2C). I den foregående studie [22] ble det rapportert at ch1E11 hadde
in vivo
antitumoraktivitet kan sammenlignes med trastuzumab som et enkelt middel, og kombinasjonen av ch1E11 og trastuzumab resulterte i tumorregresjon indeks (TGI) av 95,1%. På samme måte, hz1E11 som monoterapi hadde lignende
in vivo
antitumoraktivitet overfor trastuzumab (S1 figur) og kombinasjonen av hz1E11 med trastuzumab viste også doseavhengig antitumoraktivitet i NCI-N87 xenograft musemodell ( fig 2D). Antistoff kombinasjons-behandling ved 1 mg /kg hver av hz1E11 og trastuzumab resulterte i lignende antitumoraktivitet med trastuzumab enkelt behandling med 10 mg /kg, og ved 2,5 mg /kg kombinert og over den etablerte tumor stabiliserte eller startet tilbakegang (Ingen statistisk ble observert blant 2,5, 5 og 10 mg /kg kombinasjoner), signifikant forskjell [0,05
P
0,01; ns, ikke signifikant som bestemmes av to-veis gjentatte tiltak ANOVA etterfulgt av Bonferroni post-test.
alaninskanning av CDR-H3 og CDR-L3
For å identifisere de kritiske rester etter antigen-antistoff-interaksjonen, ble alanin-scanning mutagenese gjennomført i CDR3-områder av tunge og lette kjeder (CDR-H3 og CDR-L3). Virkningene av mutasjonene ble vurdert ved å analysere bindingsaktiviteten til renset Fab-proteiner ved indirekte ELISA. I CDR-H3, alanin substitusjon i posisjon Gly98
H avskaffet binding av Fab til HER2, og G97
HA og T99
HA-mutanter viste redusert bindingsaktivitet (figur 3A). I CDR-L3, er alanin-substitusjoner hadde mye mindre virkninger (figur 3B).
k
off verdier av alaninskanning mutanter ble analysert ved bruk av SPR mot immbolized HER2-ECD protein. Vi bekreftet at den tunge kjeden G98A mutant helt tapt bindende aktiviteter, og nabo T99
HA og G97
HA mutanter resulterte i 32-fold og 17 ganger økt
k
av verdier henholdsvis (figur 3C). Disse resultatene indikerer at tung kjede Gly98
H er funksjonelt kritisk og tilstøtende rester er også funksjonelt viktig for antigen-antistoff samhandling.
De bindende aktiviteter alaninskanning mutanter av CDR-H3 (A) og CDR -L3 (B) ble analysert ved hjelp av ELISA. C, Kvantitative dissosiasjons-kinetikk av angitte mutanter ble analysert ved hjelp av overflate-plasmonresonans. HER2-ECD-protein ble immobilisert på en sensorbrikke CM5 etterfulgt av eksponering for angitte mutante Fab-antistoffer. Den 100% foreningen ble definert som den svarenhet (RU) på 200 sekunder fra begynnelsen av Fab injeksjon.
k
av verdier ble beregnet ved hjelp av BIAevaluation programvare.
Affinity modning av hz1E11
Affinity modning av hz1E11 ble utført av bygging av tunge eller lett kjede CDR3 variant biblioteker, etterfulgt av likevekt valg av fag-antistoffbiblioteker. For den lette kjeden, glutamin rester i posisjonene 89
L og 90
L ble ikke diversifisert fordi glutamin er ofte funnet på disse stillingene av ni aminosyre-longCDR-L3 sekvenser på 59% og 73% frekvenser, henholdsvis [ ,,,0],27]. Posisjonerer 91
L-94
L randomisert bruker en NNK degenerert kodon (L-NNK). For den tunge kjede, posisjonerer 95
H -100a
H ble randomisert ved hjelp av en XXS kodon (H-XXS), utformet slik at ved den første og andre nukleotid posisjoner av den avledede kodon villtype basen oppsto med 70 % sannsynlighet, hver av de tre andre baser forekom ved 10% hyppighet og den tredje bokstav i de kodoner ble syntetisert ved anvendelse av en ekvimolar blanding av G og C (figur 4A). Høy affinitet bindemidler ble valgt ut fra høy stringens eller lav stringens panorering (tabell 1).
A, Design av CDR-L3 og CDR-H3 biblioteker for affinitet modning. Se teksten for detaljert forklaring. B, Sequence logo ble generert ved hjelp WebLogo program om unike CDR-L3 sekvenser fra 4
th runde panning-2 (lav stringens panorering) produksjonen av CDR-L3 bibliotek (
n
= 39). C, The hz1E11 ble immobilisert på en CM5 sensor chip etterfulgt av sekvensiell eksponering for HER2-ECD-Hans og indikerte antistoffer ved hjelp BIAcore2000. D, trastuzumab ble immobilisert på en CM5 sensor chip etterfulgt av sekvensiell exposeure til HER2-ECD-Hans og indikerte antistoffer ved hjelp av BIAcore 3000. E, De bindende aktiviteter av antistoffer ble analysert ved ELISA med rekombinante HER2 sub-domene proteiner.
i forhold til lav stringens panorering av L-NNK bibliotek der 100% av andre, tredje og fjerde runde utgangs kloner screenet var ELISA positiv, for høy stringens panorering den fjerde runden utgang ga ingen bindemiddel i det hele tatt, og bare en tredjedel av de tredje runde utgangs kloner var ELISA positive (tabell 1). De utvalgte kloner fra CDR-L3 bibliotek inkluderte mange sekvenser som hadde alle fire randomiserte CDR-L3 stillinger mutert, i motsetning til CDR-H3-biblioteker som de fleste av de utvalgte kloner beholdt villtypesekvensen i stillinger 97
H -100
H (se nedenfor). Ulike panorering strategier gitt ulike sekvens berikelse mønstre. For eksempel, den lette kjeden variant klone 1A12 (Q
89LQNAYAPWT
97L) ble isolert fra høy stringens panorering, men ikke fra lav stringens panorering, og den tunge kjeden variant klone 1B12 (N
95HYGGTASFDY
102H) ble også valgt bare fra høy stringens panorering. Interessant, 59% unike antistoffer i 4
th utgang med lav-stringens panorering av L-NNK bibliotek hadde en alanin i posisjon 92
L, i tråd med alaninskanning analyse (figur 4B).
Nesten alle kloner som ble isolert fra H-XXS bibliotek hadde samme sekvens på 97
H -100
H som foreldre klone, og viste en klar berikelse av Asn-Tyr sekvens på 95-96. For å vurdere ytterligere bidrag av CDR-H3-rester til antigen-antistoff-binding, ble en ytterligere CDR-H3-bibliotek konstruert med doble NNK-kodon tilfeldig skanning av CDR-H3 (H-2AA, figur 4A). I lav stringens panorering, mutanter i posisjonene 95
H, 96
H, 99
H, 100
H, og 100a
H ble valgt i første runde panorering, men bare mutanter i posisjonene 95
H og 96
H ble anriket i den fjerde runden utgang (tabell 1). Vi kunne ikke finne mutantene i posisjonene Gly97
H og Gly98
H i noen panorering strategier og utganger.
Affinity og bindingsaktivitet av utvalgte kloner
For å vurdere kombinasjonen effekt av affinitet-modnet tung og lett kjede-varianter, ble IgG-antistoffer med kombinasjoner av affinitets-modnet tunge og lette kjeder fremstilt og deres
k
off-verdier var bestemme ved hjelp av SPR-analyse (tabell 2). Blant to lette kjedevarianter og to tunge kjede varianter, 1A12 stammer fra L-NNK viste størst forbedring (16 ganger). Kombinasjonen av den lette kjeden av 1A12 med optimalisert tung kjede av klone 1B12 resulterte i en 24-fold forbedring i
k
off over foreldre hz1E11, mens for de andre kombinasjonene
k
off-verdier var lik eller større enn 1A12. Fordi 1,5 ganger ytterligere forbedring av L-1A12 + H-1B12 kombinasjonen var ikke signifikant stor, ble kloner 1A12 og 1F11 (lett kjede varianter) valgt for ytterligere karakterisering for å minimere sekvensen forskjellen på affinitet-modnet antistoffer fra foreldre klone. Dissosiasjonskonstantene for affinitetsmodnede kloner, også bestemmes av SPR analyse, var mer enn 10 ganger lavere enn for foreldre klone hz1E11 og sammenlignes med trastuzumab (tabell 3).
for å finne ut om affinitet-modnet hz1E11 kloner binder seg til den samme epitop som foreldre hz1E11, binding av 1A12 og 1F11 til HER2-ECD som var forhånds bundet til hz1E11 ble analysert ved SPR. Begge kloner ikke var i stand til å binde til det monomere HER2-ECD-His protein fanget av immobilisert 1E11 mens trastuzumab kunne (figur 4C). I tillegg ble det bekreftet at 1A12 epitopen ikke overlapper med den av trastuzumab (figur 4D). Kloner 1A12 og 1F11 også binde seg til sub-domenet IV som foreldre klone hz1E11 (Fig 4E). Disse dataene indikerer at epitoper av 1A12 og 1F11 ikke ble endret av affinitet modningsprosess.
Effekt av affinitetsmodnede hz1E11 kloner
Både 1A12 og 1F11 antistoffer viste svakt økende anti-proliferative aktiviteter som monoterapi sammenlignet med hz1E11 på NCI-N87 og OE-19 mage kreft cellelinjer som overuttrykker HER2 (fig 5A og 5B), mens det i kombinasjon med trastuzumab, deres anti-proliferative aktiviteter var bedre enn trastuzumab alene og tilsvarer hz1E11 pluss trastuzumab . Den anti-proliferativ aktivitet av 1A12 og 1F11 ble bekreftet
in vivo
i NCI-N87 xenograft modell. Overlegen antitumoraktivitet var tydelig i kombinasjon med trastuzumab til den av hvert middel alene i begge xenograft-modeller (figur 5C).
NCI-N87-celler (A) og OE-19-celler (B) ble behandlet med antistoffer for 4 dager i fullstendig vekstmedium. Cellelevedyktigheten ble målt i duplikat (gjennomsnitt ± SD) ved hjelp av WST-1 reagens. Den 100% levedyktighet ble definert som levedyktigheten til de antistoff ubehandlet brønner. C, NCI-N87 (
n
= 5 mus /gruppe) celler ble inokulert i mus og antistoff behandlinger startet da tumorvolum nådd ca 200 mm
3. Mus mottok en dose på 20 mg /kg for enkelt middel behandling og 10 mg /kg av hvert antistoff for kombinasjonsbehandling. Administrasjon dager er angitt med piler. Tumor volum (mm
3) ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. For klarhet, er bare positive feilfelt vist.
Diskusjoner
Til tross for oppmuntrende kliniske resultater oppnådd med HER2 rettet mot antistoffet trastuzumab i behandling av magekreft, er det fortsatt er behov for mer potente HER2 målrettet terapi [6]. Kombinasjonen av ikke-konkurrerende antistoffer målrettet mot-reseptorer, slik som HER2, EGFR, og VEGFR3, kan øke antitumoraktivitet i prekliniske modeller [11-13, 28]. Pertuzumab, en annen HER2-antistoff rettet mot, er godkjent for bruk i kombinasjon med trastuzumab ved behandling av metastatisk brystkreft [29]. I en tidligere studie, har vi utviklet en ny HER2 rettet mot antistoff, 1E11, som ble vist å ha betydelige anti-tumor aktivitet som monoterapi og synergistisk effekt i kombinasjon med trastuzumab
in vitro Hotell og
in vivo product: [22]. Antitumoraktiviteten av de 1E11 trastuzumab kombinasjonen er overlegen, ikke bare for å trastuzumab enkelt behandling, men også av kombinasjonen av pertuzumab og trastuzumab. I denne rapporten er det menneskeliggjøring og påfølgende affinitet modning av mus hybridom-avledet 1E11 monoklonalt antistoff beskrevet.
Innledende tilnærminger for å redusere potensiell immunogenisitet av humane variable områder av CDR-pode inn i en menneskelig ramme betydelig redusere immuniteten av terapeutiske antistoffer [15, 17].
