Abstract
Utskilte microRNAs (mirnas) omsluttet ekstracellulære vesikler (elbiler) spiller en sentral rolle i interkommunikasjon ved å regulere mottakercellen genekspresjon og påvirker målet celle funksjon. Her rapporterer vi isolering av tre forskjellige EV undertyper fra menneskets tykktarm kreft cellelinje LIM1863 – skur mikrovesikler (sMVs) og to exosome populasjoner (immunoaffinitetskolonnerensing isolerte A33-exosomes og EpCAM-exosomes). Deep sekvensering av miRNA biblioteker preparert fra foreldre LIM1863 celler /avledet EV subtype RNA ga 254 miRNA identifikasjoner, hvorav 63 er selektivt anriket i elbiler – MIR-19a /b-3p, MIR-378a /c /d, og MIR-577 og medlemmer av la-7 og MIR-8 familier som den mest fremtredende. La-7a-3p *, la-7F-1-3p *, MIR-451A, MIR-574-5p *, MIR-4454 og MIR-7641 er felles for alle EV undergrupper, og 6 mirnas (MIR-320a /b /c /d, MIR-221-3p, og MIR-200c-3p) skjelne LIM1863 exosomes fra sMVs; MIR-98-5p ble selektivt representert kun i sMVs. Spesielt, A33-Exos inneholdt flest (32) av utelukkende-beriket mirnas; 14 av disse miRNAs har ikke blitt rapportert i sammenheng med CRC vev /biofluid analyser og garanterer videre undersøkelse som potensielle diagnostiske markører for CRC. Overraskende, miRNA passasjer tråder (stjerne mirnas) for Mir-3613-3p *, -362-3p *, -625-3p *, -6842-3p * ble den dominerende strand i A33-Exos, det motsatte som er observert i foreldre celler. Dette funnet antyder miRNA biogenesis kan sammenvevd med endosomal /exosomal behandling
Citation. Ji H, Chen M, Greening DW, han W, Rai A, Zhang W, et al. (2014) Deep Sekvensering av RNA fra tre forskjellige ekstracellulær Vesikkel (EV) Subtyper utgitt fra Human LIM1863 tykktarmskreft cellelinje avdekker Klare Mirna-berikelse signaturer. PLoS ONE 9 (10): e110314. doi: 10,1371 /journal.pone.0110314
Redaktør: Clark Chen, University of California, San Diego, USA
mottatt: 29. mai 2014; Godkjent: 11 september 2014; Publisert: 17 oktober 2014
Copyright: © 2014 Ji et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. FASTQ filer for alle de fire små RNA bibliotek (LIM1863 celler, og avledet sMVs, A33-Exos og EpCAM-Exos) har blitt sendt til Sequence Les Archive (SRA) av NCBI under sjonsnummer SRA106214
Finansiering.: dette arbeidet ble støttet av National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) program tilskuddet # 487922. MC og AR er støttet av en La Trobe University forskningsstipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ekstracellulære vesikler (EVS) er nano-membran partikler som strekker seg fra 30-2,000 nm i diameter som er gitt ut fra de fleste celletyper i det ekstracellulære miljøet [1]. Elbiler er tenkt å bestå av tre hovedklasser avhengig av deres opprinnelse – exosomes (Exos, 50-150 nm), bod mikrovesikler (sMVs, 400-1,500 nm) og apoptotiske legemer (400-2,500 nm). Selv om det er en pågående polemikk blant forskere om nomenklatur, biogenesis, biokjemiske og funksjonelle egenskaper til EV subtyper, tilgjengelig dokumentasjon tyder på at exosomes stammer fra indre spirende endosomal avdelinger kalt muitivesikulære organer (MVBs) og er gitt ut fra cellen inn i mikromiljøet etter fusjon av MVBs med plasmamembranen, sMVs (ectosomes, mikrovesikler, mikropartikler, oncosomes) ved ytre spirende /blebbing fra plasmamembranen, og apoptotiske legemer gjennom prosessen med apoptose /celle svinn /atom fragmentering [2]. At både funksjonelle og biokjemiske nivåer, har exosomes vært den mest studerte av elbiler. Exosomes har vist seg å inneholde forskjellige proteiner (inkludert oncoproteiner, tumorsupres proteiner, transkripsjonelle regulatorer, skjøte faktorer [1], [3], [4], [5], [6], lipider [7], og RNA (mRNA , microRNAs (mirnas) og andre ikke-kodende RNA) [8] – exosomal molekylær last informasjonen kan nås av offentlig-tilgjengelige databaser som ExoCarta [9] og EVPedia [10] Selv lenge ansett som cellerester, nyere exosome studier. vise at de har viktige biologiske roller i immunsystemet, det kardiovaskulære og nervesystemet og i patogenesen av sykdommer så som kreft [11], [12], [13]. i det siste tiåret har det vært fastslått at el-biler spiller en sentral rolle i progresjon av kreft og pre-metastatisk svulst nisje påfyllingen i innpoding [14], [15], [16], [17].
det er vel anerkjent at svulsten mikromiljøet spiller en kritisk rolle i kreft initiering , progresjon og metastase [18]. intercellulær kommunikasjon mellom tumor-stroma kan medieres av oppløselige faktorer, inkludert cytokiner, kjemokiner, og vekstfaktorer [19]. En begynnende konseptet er at tumor-stroma interaksjoner kan også innebære direkte utveksling av genetisk informasjon, hovedsakelig i form av mirnas, en klasse av ikke-kodende RNA (18-25 nukleotider i lengde) som regulerer ekspresjonen av multiple målgener ved å bindes til deres kodede mRNA [13], [20], [21]. Denne overføring av genetisk materiale kan skje når EV innehold miRNA lasten frigjøres av et donorcelle til det ekstracellulære miljø og er funksjonelt overføres til mottakercellene. Overførte mirnas kan være funksjonell både
in vitro product: [8], [22], [23], [24], [25], og
in vivo product: [26], [27] , [28]. Studier har begynt å undersøke sammenslutningen av mikroRNA-relaterte polymorfismer og deres tilknytning til kreftforekomst og prognose, samt potensialet for sirkulerende microRNAs eller fekal mikroRNA uttrykk som ikke-invasive tidlig deteksjon biomarkører for tykktarmskreft [29], og nytten av miRNAs i tilbakefall, metastaser og terapeutiske utfall [30]. Et stort fremskritt i vår forståelse av exosomal miRNA biologi var det funn at sumoylated hnRNPA2B1 styrer lasting av visse mirnas inn exosomes gjennom anerkjennelse av spesifikke korte motiver stede i mirnas [31].
Nylig, vi beskrev isolering av to populasjoner av exosomes samt sMVs fra samme human colon carcinoma cellelinje LIM1863 [4]. De sMVs ble fremstilt ved differensialsentrifugering og exosomes renset ved sekvensiell immunocapture ved anvendelse av anti-A33- og anti-EpCAM koplede magnetiske kuler. Mens exosome populasjoner (A33-Exos og EpCAM-Exos) ikke kan skilles ved hjelp av elektronmikroskopi, spenstig tetthet eller stereotype exosomes markører (TSG101, Alix og HSP70), protein typing ved hjelp GeLC-MS /MS [3], [6] avslørte at deres proteinsammensetninger var ganske tydelig – EpCAM-Exos inneholder klassiske apikale komponenter menneskehandel og A33-Exos, beriket med basolaterale menneskehandel molekyler. Proteomet profiler av begge exosome populasjoner i sin tur var ganske forskjellig fra den første rapporten fra sMVs slippes ut i samme dyrkingsmedium. For ytterligere å definere disse EV subtyper, undersøkte vi deres molekylære sammensetningen ved hjelp av en annen
omics
tilnærming, RNA skrive.
I denne studien viser vi ved hjelp av dyp sekvense at det er totalt 254 mirnas identifisert i de fire miRNA bibliotekene forberedt (A33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs og foreldre LIM1863 celler), hvorav 63 er sterkt anriket i elbiler. De tre LIM1863-avledet EV subtyper er beriket med spesifikke mirnas signaturer, sammenlignet med foreldrenes cellelinje LIM1863. Spesielt rapporterer vi at 32, 2 og 4 mirnas som er eksklusivt beriket i A33-Exos, EpCAM-Exos, og sMVs, henholdsvis – noen som gjør exosomes skal skilles fra sMVs. Av de 32 mirnas selektivt anriket på A33-Exos, 13 har ikke tidligere vært innblandet med tykk- og endetarmskreft (CRC), og vi diskutere hvordan denne informasjonen kan bli brukt mot potensialet for CRC diagnostikk. Et bemerkelsesverdig funn i vår studie var funn av «passasjer tråd «miRNA (miRNA stjerne) sekvenser anriket på elbiler i forhold til overordnede LIM1863 celler.
Materialer og metoder
Cell kultur og isolering av ekstracellulære vesikler
LIM1863 celler [32] ble først dyrket til ~80% konfluens i en 175-cm
2-kolbe i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplert med 5% føtalt kalveserum ( FCS), 0,1% insulin-transferrin-selen (ITS, Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO
2. LIM1863 celler (~3 × 10
7 celler) ble høstet (140
g
, 3 min), suspendert i 15 ml fenol rød fri RPMI-1640 medium (som inneholder 0,5% ITS, 100 U /ml penicillin og 100 mikrogram /ml streptomycin) og overført til dyrking kammer av en CELLine CL-1000 bioreaktor klassisk kolbe (Integra Biosciences); næringsstofftilførselen kammer inneholdt 500 ml RPMI-1640 supplert med 5% FCS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 atmosfære. Kulturmedium i næringstilførsel kammeret ble erstattet to ganger i uken, og cellesuspensjonen fra kammeret Dyrking ble høstet hver 48 timer. Etter hver innsamling, ble cellesuspensjonen sentrifugert ved 140
g
i 3 minutter for å sedimentere LIM1863 celle organoids, som ble resuspendert i 15 ml dyrkningsmediet og re-seeded tilbake i Dyrking kammeret. Supernatanten ble sentrifugert ved 2000
g
i 10 minutter for å fjerne flytende celler /cellerester, og deretter sentrifugert ytterligere ved 10.000
g
i 30 minutter ved 4 ° C for å samle felle mikrovesikler (sMVs) . Den resulterende supernatant ble ytterligere sentrifugert (100000
g
, 1 h) å samle råolje exosomes. Crude exosomes ble fraksjonert i to adskilte exosome subpopulasjoner (A33-Exos og EpCAM-Exos) ved sekvensiell immunocapture hjelp av Dynabeads (Invitrogen) lastet med anti-human-A33 monoklonale antistoffer [33] i tandem med anti-EpCAM (CD326) -antibody bundet magnetiske mikroperler (Miltenyi Biotec), som beskrevet [4].
protein kvantifisering
protein~~POS=TRUNC innhold~~POS=HEADCOMP ble bestemt ved 1D-SDS-PAGE /SYPRO Ruby proteinfarging densitometri, som tidligere beskrevet [5] .
Transmission elektronmikroskopi (TEM)
A33-Exos og EpCAM-Exos ble eluert fra sine respektive magnetiske kuler med 0,2 M glysin, pH 2,5 og høstet ved sentrifugering (100000
g
, 1 time). For TEM, ble prøver (sMVs, A33- og EpCAM-Exos, 1 pg /10 pl PBS) påføres i 2 min til 400 mesh kobbernett belagt med et tynt lag av karbon. Overskytende materiale ble fjernet ved blotting med filterpapir, og prøvene negativt farget to ganger med 10 ul av en 2% uranylacetat-løsning i 10 min (ProSciTech, Queensland, Australia). Rister ble lufttørket og avbildes ved hjelp av et JEOL JEM-2010 transmisjonselektronmikroskop operert ved 80 kV.
Western Blot analyse
Prøveproteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av én-dimensjonal SDS-PAGE /SYPRO Ruby proteinfarging /densitometri som beskrevet [5], [6]. Kort beskrevet ble prøver ble lysert i SDS prøvebuffer i 20 minutter ved romtemperatur, og proteiner (10 ug /prøve) løses ved hjelp av SDS-PAGE, elektrooverført til nitrocellulosemembraner ved hjelp av iBlot tørr Blotting System (Life Technologies), og membranene blokkert med 5 % (vekt /volum) skummet melk pulver i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,05% (v /v) Tween-20 (TTBS) i 30 min. Membraner ble undersøkt over natten i TTBS med muse anti-CD9 (på 1:1000) og mus anti-TSG101 (på 1:1,000) fra BD Biosciences, mus anti-Alix (på 1:1,000) fra Cell Signale eller mus anti -A33 (1 mikrogram /ml) (gave fra Dr A Scott, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne). Etter vasking med TTBS (3 x 10 min) membraner ble inkubert med pepperrotperoksidase (HRP) konjugert anti-mus IgG (Sigma) eller IRDye 800 anti-mus IgG (Li-COR Biosciences). Proteiner ble synliggjort ved inkubering av membraner med Western HRP-substrat (Merck-Millipore) etterfulgt av avbildning med ChemiDocMP system (Bio-Rad) eller ved avbildning direkte med Odyssey infrarød Imaging System (v3).
Total RNA isolasjon
Total RNA fra LIM1863 celler, sMVs, A33- og EpCAM-Exos ble isolert med TRIzol (Livet Technology), i henhold til produsentens instruksjoner. Kort beskrevet ble prøver ble lysert i 1 ml TRIzol Reagent ved gjentatt pipettering i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Kloroform (0,2 ml /ml TRIzol Reagens) ble tilsatt til oppløseliggjorte prøver og blandinger virvlet kraftig i 15 sekunder, inkubert ved RT i 2-3 min og deretter sentrifugert (12 000
g
, 15 min, 4 ° C) . Vandige fase ble oppsamlet, blandet med 5 ug glykogen (20 mg /ml vandig glykogen, Invitrogen) og isopropylalkohol (0,5 ml isopropylalkohol /1 ml vandig fase) og inkubert i 10 minutter ved RT. Totalt RNA ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 12.000 g i 10 min ved 4 ° C. Resulterende RNA-pelletene ble vasket en gang med 75% vandig etanol, lufttørket i 5 minutter og på nytt oppløst i RNase-fritt vann. Kvantitet, kvalitet og sammensetning av RNA prøver ble evaluert ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA).
Små RNA bibliotek konstruksjon og sekvense
Fire små RNA-biblioteker (fra foreldre LIM1863 celler og avledet sMVs, A33- og EpCAM-Exos) ble konstruert og sekvensert med Illumina TruSeq dypt sekvenseringsteknologi (Prøve forberedelse guide, Par # 15004197 Rev.A, Illumina, San Diego, California). Kort sagt ble totalt RNA prøver fraksjonert på en 15% Tris-borat-EDTA (TBE) polyakrylamid gel (Invitrogen) og et bånd tilsvarende små RNA (18~30 nt) ble skåret ut og små RNA ekstrahert ved sentrifugering. Etter ligering av 5 «(5′-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3») og 3 «(5′-UGGAAUUCUCGGGUGCCAAGG-3») adaptere, små RNA molekyler ble revers transkribert til cDNA, så forsterket ved hjelp av adapterprimerne for 14 sykluser og fragmentene ( ~150 bps) ble isolert fra en 6% TBE PAGE-gel. Det rensede cDNA ble brukt direkte for klyngedannelse og sekvensert ved hjelp av en Illumina HiSeq 2000 plattform. Bildefiler generert av sequencer ble behandlet for å produsere digital kvalitet data (rå FASTQ filer). FASTQ filer for alle de fire små RNA bibliotek (LIM1863 celler, og avledet sMVs, A33-Exos og EpCAM-Exos) har blitt sendt til Sequence Les Archive (SRA) av NCBI under sjonsnummer SRA106214.
Kvantitativ real -time PCR
Total RNA (3 pl inneholder 12 ng RNA /mikroliter) fremstilt fra LIM1863 celler og avledet elbiler var omvendt transkribert ved hjelp av en TaqMan miRNA Reverse Transcription (RT) Kit fra Applied Biosystems /Life Technologies med Megaplex RT primere (menneskelig Pool A og gruppe B, Applied Biosystems). RT reaksjonsbetingelser, basert på instruksjonene fra produsenten, var: 40 sykluser med 16 ° C i 2 min, 42 ° C i 1 minutt og 50 ° C i 1 s. Resulterende Megaplex RT produkter (2,5 mL) ble deretter blandet med 22,5 mL av Megaplex PreAmp Reaction Mix inneholder 2,5 ul megaplex preamp Grunning Pool A og B (Applied Biosystems). Pre-forsterkningssykkelBetingelsene var: 95 ° C i 10 min, 55 ° C i 2 minutter, 75 ° C i 2 minutter etterfulgt av 12 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 4 min. Etter fortynning pre-amplifisert cDNA (25 ul) med 75 ul Tris-EDTA-buffer (1 mM Tris-buffer inneholdende 0,1 mM EDTA, pH 8,0), 15 ul fortynnet cDNA-produktet ble blandet med 450 ul av TaqMan Universal PCR masterblanding (Applied Biosystems) og 435 mL nukleasefritt vann. For å validere de dype sekvense data blandingen ble utsatt for kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyser ved hjelp av TaqMan low-density array (TLDA) kort (sett v3.0) som representerer totalt 754 analyser spesifikke menneskelige mirnas (tilstede i Sanger miRBase v14). QRT-PCR ble utført på en 7900 HT thermocycler (Applied Biosystems) under anvendelse av produsentens anbefalte sykkel betingelser: 50 ° C i 2 min, 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 minutt. QRT-PCR-data ble oppsamlet ved slutten av hver syklus. Syklus terskel (CT) verdier ble beregnet ved hjelp av SDS-programvare v2.4; automatiske baseline-innstillinger ble tilordnet et minimum Ct terskelverdi på 0,2. Ct-verdiene 35 ble vurdert til å være under analysen deteksjonsnivået og ekskludert fra dataanalyse. Data ble analysert ved hjelp av ΔΔCt metoden med LIM1863 celle RNA som referanse og global normalisering med U6 snRNA og MaMMU6 som kandidat kontroller ved hjelp av Expression Suit programvare v1.0.3 (Applied Biosystems).
bioinformatiske analyser
En bioinformatikk rørledning utviklet i BGI-Shenzhen ble ansatt for å identifisere mirnas og andre små RNA kategorier. Kort fortalt, leser lav kvalitet (små RNA som inneholder databasen «N» (undefined av sequencer), eller mer enn 6 baser med kvalitet lavere enn 13 eller mer enn 4 baser med kvalitet lavere enn 10), adaptere og leser mindre enn 18 nt ble ekskludert fra rådata for å generere ren lyder (18-30 nt). Clean leser ble justert til miRBase (v20, https://www.mirbase.org) ved hjelp av BLAST programvare fra NCBI å identifisere kjente mirnas og generere uttrykk profiler. Brett endringer i uttrykk nivåer (sample gruppe versus kontrollgruppe) ble beregnet for hver miRNA som log
2 prosenter ved hjelp normalisert TPM (vitnemål per million leser) verdier i henhold til formelen: Brett endring = log
2 (sample gruppe /kontroll). P-verdi for hver miRNA i en parvise sammenligningen ble utført basert på Poisson test [34]. Clean leser ble justert til Human Reference Genome (hg19, https://hgdownload.soe.ucsc.edu/) ved hjelp av SOAP 2 [35] for å klassifisere gjenta knytte små RNA og mRNA degradert fragmenter. rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, srpRNA ble identifisert ved å kartlegge ren leser til GenBank (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) og Rfam (https://rfam.sanger.ac.uk/) databaser.
Gene ontologi og KEGG Pathway Analysis
TargetScan 6.0 (https://www.targetscan.org) ble ansatt for å forutsi målgener for miRNA kandidater. De potensielle funksjoner av miRNA målgener ble kommentert av Gene ontologi og KEGG sti database. WEGO metode [36] ble brukt til å presentere betydelige GO vilkår. To statistiske verdiene
P-verdi plakater (Fishers eksakte test) og
q-verdi product: [37], ble beregnet å få veier som var betydelig beriket og kontrollere den falske funnraten.
Resultater
tilstedeværelse av RNA i elbiler løslatt fra menneskets tykktarm kreft cellelinje LIM1863
vi har tidligere rapportert at LIM1863 cellene slipper to EV undergrupper – exosomes og kaste mikrovesikler [4] , og at innenfor exosome subtype det er to forskjellige exosome populasjoner, en beriket for apikale overflaten sortering proteiner (EpCAM-Exos), den andre, basolateral overflaten sortering protein (A33-Exos); alle tre EV populasjoner har forskjellige proteomet profiler [4]. For å vurdere om RNA er spesielt sortert i elbiler, og om repertoar av mirnas (Mirs) i de tre populasjonene vi isolert forskjellig, vi la ut på en storstilt rensing av elbiler fra LIM1863 kultur medium (CM). For å generere nok elbiler for total RNA analyse vi ansatt en kontinuerlig cellekultur tilnærming ved hjelp CELLine CL-1000 bioreaktor kolber å generere ~1200 ml LIM1863 CM. sMVs ble renset ved hjelp av differensialsentrifugering og A33-Exos og EpCAM-Exos ved sekvensiell immunoaffinitetskolonnerensing fangst, se figur. 1A. De exosome populasjoner (A33-Exos og EpCAM-Exos) kunne ikke være preget av elektronmikroskopi (50-150 nm diameter) mens sMVs var mer heterogene i størrelse (100-1,500 nm diameter) og i samsvar med den kjente morfologi (Figur 1 AD); alle tre EV subpopulasjoner inneholdt stereotype exosome markører (TSG101, Alix, CD9) (figur 1E). Denne tilnærmingen ga -20 mg sMVs og ~3 mg A33- og EpCAM-Exos. For å avgjøre om LIM1863 celle elbiler inneholder RNA, ble rene elbiler hentet for total RNA inkludert små RNA brøk med standard RNA ekstraksjon metodikk. Kvaliteten og kvantiteten av det isolerte RNA ble bestemt ved anvendelse av et Agilent 2100 Bioanalyzer (figur 1F). RNA utbytte: A33-Exos 8,8 ug RNA /~3 mg protein, EpCAM-Exos 9,2 ug RNA /~3 mg protein, og SMV: 72 ug RNA /~ 20 mg protein. Totalt RNA Bioanalyzer profiler indikerte at LIM1863 celle-stammer sMVs inneholdt 18S og 28S ribosomalt RNA (rRNA), mens A33- og EpCAM-Exos mangler detekterbare mengder av disse artene av RNA i avtalen med exosomes avledet fra andre cellelinjer [22], [38 ], [39], [40].
(A) LIM1863 celler ble dyrket i RPMI-1640 medium supplementert med 5% FCS (exosome-utarmet), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i CELLine bioreaktor klassiske kolber og dyrkingsmediet (CM) samlet. sMVs ble først isolert fra CM (utbytte: ~ 20 mg protein, 72 ug RNA). Deretter ble A33-Exos isolert fra SMV-free CM via anti-A33 antistoff fangst (utbytte: ~3 mg protein, 8,8 mikrogram RNA) og EpCAM-Exos ble isolert fra A33-Exos fattig CM bruker EpCAM-koblet magnetisk kuler (utbytte: ~3 mg protein, 9,2 ug RNA). (BD) elektronmikroskopi bilder av sMVs (B), A33-Exos (C) og EpCAM-Exos (D) viser en størrelse på 150-300 nm og diameter 40-100 nm diameter for sMVs og A33- /EpCAM-Exos, henholdsvis. Skala: 100 nm (n = 3). (E) Western blot av elbiler (10 mikrogram protein) for A33, Alix (PDCD6IP), TSG101, og CD9. (F) Total RNA elektroferogrammet analyse (Agilent Bioanalyzer) fra LIM1863 celler og avledet elbiler. Y-aksen av elektroferogrammet er vilkårlig fluorescens enhet intensitet (FU) og x-aksen er migrasjon i sekunder (s) og nukleotider (nt).
Et øyeblikksbilde av små RNA sekvense data
for å karakterisere små RNA i LIM1863-avledet elbiler, ble Illumina HiSeq 2000 high-throughput teknologi brukes til å sekvensere fire små RNA bibliotek (LIM1863 celler (CL), sMVs, A33-Exos og EpCAM-Exos). Utgangspunktet, 20330356, 25388242, 22512338, og 24096270 rå leser ble produsert. Etter trimming lav kvalitet leser, adaptere sekvenser og leser hvor langt var mindre enn 18 nt (BGI intern programvare), tilsvarende 18.850.584, 22.762.038, 16.407.260 og 18.195.289 totalt ren leser ble oppnådd. Vi neste kartlagt alle rene leser til miRBase (V.20) for å kommentere kjente mirnas i hvert bibliotek. Resultatene viste 15367876, 152815949, 12771308, og 13611284 kommenterte ren leser tilsvarende CL, sMVs, A33-Exos, og EpCAM-Exos, henholdsvis; ren leser identifisert for andre små RNA kategorier (rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, srpRNA, gjentar-assosiert RNA, mRNA degradering) og Umerket RNA er vist i tabell 1. Prosentandelen av mirnas i total-RNA isolert fra hver prøve tilsvarte 77,84, 74,81, 67,14 og 81,52 for A33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs, og CL, henholdsvis.
Vi neste undersøkte fire LIM1863 celle-stammer miRNA biblioteker for å finne ut hvor mange av de 2578 kjente mirnas i miRBase v20 var synlig. Uten en cut-off 891, 863, 770, og 759 mirnas var representert i CL, sMVs, A33-Exos og EpCAM-Exos, henholdsvis. Men for denne studien, besluttet vi å bruke en strengere terskel ( 5 TPM cut-off) for å tillate oss å fokusere på høyt representert miRNAs. Dette resulterte i totalt 254 mirnas for videre analyse (tabell S1), inkludert hierarkisk clustering av uttrykk nivåer (Figur S1).
LIM1863-avledet elbiler inneholde 254 forskjellige mirnas
En inspeksjon av Tabell S1 viser at 254 mirnas er representert i alle fire biblioteker, om enn med varierende grad av berikelse. Betydelig, er mer enn 75% av disse 254 mirnas sterkt representert i hvert bibliotek ( 10 TPM) (figur 2A), og de 20 beste mirnas i A33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs og CL bibliotekene representerer 91,02%, 90,72%, 91,02% og 91,42% av den tilsvarende total leser av miRNAs. Interessant, de tre mest høyt representert mirnas identifisert i LIM1863-avledet elbiler – MIR-192-5p, MIR-10a-5p, og MIR-191-5p – er blitt rapportert tidligere i vev og serum fra CRC pasienter som diagnostisk biomarkører. For eksempel har MIR-192 blitt observert i vev [41] og serum /plasma [42] fra CRC pasienter, MIR-191 i vev [41], [43] og serum /plasma [44], og MIR-10a vev [45] og serum /plasma [42] fra CRC pasienter. Videre er MIR-192 rapportert å undertrykke metastase av CRC [46] og dens syntese, sammen med den av MIR-215 (også sterkt representert i vårt 254 miRNA datasettet), er indusert av p53 og vist å spille en viktig regulatorisk rolle gener som er involvert i TGF-β signalveien [47], [48].
(A) Fordeling av kjente miRNA sekvenser i CL, sMVs, A33- og EpCAM-Exos basert på normaliserte uttrykk verdier (transkripsjoner per millioner leser, TPM). (B) Top 10 miRNA klynger basert på analyse av 254 mirnas identifisert med hensyn til deres plassering på menneske referansen genom (hg19). (C) Fordeling av grupperte mirnas på ulike menneskelige kromosomer. Gruppert mirnas (inkludert miRNA tall) var identifisert i henhold til deres kromosom steder, som bør være innen 10 k bp på kromosomet; mirnas fra samme forløper (-5p, -3p) ble kun vurdert en gang. (D) Tre-veis Venn-diagram som viser de 63 mirnas beriket i sMVs, A33- og EpCAM-Exos, i forhold til CL. 6 mirnas er felles for alle elbiler, mens 22 mirnas er felles for begge exosomal datasett. mirnas selektivt anriket i hvert EV miRNA datasett. A33-Exos 32/56, EpCAM-Exos 2/25, og sMVs 4/13
neste utførte en detaljert miRNA klyngeanalyse (dvs. identifisering grupper av mirnas kodet av polycistronic transkripsjoner, antas å være co-uttrykk [49]) av de 254 miRNA datasett. Av de 153 kjente miRNA klynger som ligger innenfor 10 K bp avstand på det menneskelige genom 34 ble identifisert. Flere av disse klyngene er statistisk beriket (figur 2B, Tabell S2). Ifølge
p
-verdier beregnes ved Fishers eksakte test de fem miRNA klynger identifisert er
klynge 6 product: (6/6 medlemmer identifisert, MIR-17, -18a, -19a, -19b -1, ^ 20, og -92a-1),
klynge 4 product: (6/8 medlemmer identifisert, MIR-532, -188, -500a, -362, -501, -500b, -660, og -502),
cluster 16 plakater (4/4, MIR-941-1, -941-2, -941-3, og 941-4),
cluster 21 plakater (3 /3 medlemmer identifisert, MIR-200a /200b /429), og
cluster 28 product: (3/3 medlemmer identifisert, MIR-23a, -27a, og 24-2). Av disse
klase 6
mirnas (MIR-17~92a familie) har blitt rapportert å være sterkt representert i en rekke faste tumorer inkludert bryst, lunge, kolon, prostata og mage [50]. Uttrykk for
klynge 4
mirnas er regulert av E2F1 [50], kan direkte rettet mot BCL2 /11 /Bim å undertrykke Myc-indusert B-celle lymfom Genesis [51] og regulere flere gener i TGF-β veien [ ,,,0],52]. Det kromosomale fordeling av disse klyngene (figur 2C) viste kromosomer-X (8 klynger) -1 (5 klynger), og -9 (3 klynger) for å være den mest fremtredende.
neste undersøkt representasjon av ulike miRNA familiemedlemmer i 254 miRNA datasettet (Tabell S3). Denne analysen avslørte fremtredende i alle tre elbiler av medlemmer fra følgende familier: la-7 (12/12 medlemmer observert, la-7a /b /c /d /e /f /g /i, MIR-98-5p) , MIR-181 (6/6, MIR-181a-1 /a-2 /b-en /b-2 /c /d), MIR-30 (6/6, MIR-30a /b /c-1 /c-2 /d /e), MIR-320 (7/8, MIR-320a /b-1 /b-2 /c-1 /c-2 /d-1 /d-2), MIR-8 ( 5/5, MIR-141, MIR-200a /b /c og MIR-429), MIR-17 (6/8, MIR-106a /b, MIR-17, MIR-18a, MIR-20a og MIR-93 ), MIR-192 (2/2, MIR-192 og MIR-215) og Mir-25 (3/4, mir-25 og mir-92a /b).
63 mirnas er fortrinnsvis beriket i LIM1863-avledet elbiler
for å vurdere om noen mirnas er spesielt sortert i elbiler vi gjennomførte en miRNA-berikelse analyse for A33-Exos, EpCAM-Exos og sMVs. Mirnas med to ganger endringer i forhold til CL mirnas ble filtrert ut, noe som gir 63 mirnas for sammenligning (tabell 2). Mirna representasjon var mest fremtredende i renset A33-Exos (56 mirnas representert, hvorav 32 er selektivt beriket sammenlignet med andre elbiler), etterfulgt av EpCAM-Exos (25 mirnas, to selektivt beriket) og sMVs (13 mirnas, 4 selektivt beriket) (tabell 2, figur 2D). Det er bare 6 miRNA sekvenser som er felles for alle tre EV undertyper, inkludert tre «passasjer Strands mirnas (miRNA * sekvenser) (MIR-451A, MIR-4454, MIR-7641, la-7a-3p *, la-7F-1 -3p * og MIR-574-5p *). Til dags dato har bare miRNA-451A tidligere blitt observert i elbiler (embryonale stamcelle-avledet elbiler, [53]). Betydningen av tre miRNA * sekvenser som er felles for alle tre EV undertyper er ikke klar på dette stadiet og må avvente analyse av et statistisk signifikant antall prøver EV avledet fra andre CRC-cellelinje kilder. Totalt sett i beriket 63 miRNA datasett ser vi 12 visse miRNA * sekvenser, tre av dem (la-7a-3p *, la-7F-1-3p *, MIR-574-5p *), er sterkt representert i alle EV subpopulasjoner (tabell 2).
Vi neste undersøkte 63 miRNA datasettet (Tabell 2) for å undersøke om det var noen mirnas som gjorde at skillet mellom exosomes (A33-Exos og EpCAM-Exos) og sMVs. Denne analysen avslørte 7 mirnas betydelig beriket i exosomes (HSA-MIR-320a 320b, -320c, -320d 221-3p, -374-5p, og -200c-3p), sammenlignet med sMVs. Påfallende, Mirs-320a /b, -221-3p og -200c-3pc hadde mer enn 1000 TPM i hvert exosome bibliotek med 1.18 til 2.28 log
2 ratio fold endringer sammenlignet med tilsvarende verdier i området 500-800 TPM ( -0.33-1.88 log
2 fold endringer) i sMVs og CL biblioteker. MiR-320a er implisert i CRC grunn av sin evne til å undertrykke celleformering ved å målrette β-catenin [54]. Ekspresjonen av MIR-320a kan benyttes for å vurdere risikoen for CRC metastaser på grunn av sin evne til å binde direkte til det 3′-UTR av neurophilin (NRP-1), et ko-reseptor av vaskulær epitelial vekstfaktor [55]. Tilstedeværelsen av MIR-320a i plasma har blitt rapportert som en potensiell biomarkør for tidlig deteksjon av CRC [44]. MIR-221-3p, sammen med MIR-222 som vi også ser i høyt uttrykt 254 miRNA datasett (tabell S1), har blitt validert eksperimentelt å regulere celleproliferasjon ved å målrette p27 /Kip1, en cellesyklus hemmer og tumor suppressor, for å fremme tumorgenesen [56], [57]. Interessant, har forhøyede nivåer av MIR-222, sammen med MIR-17-3p, -135b, -92 og -95, er rapportert i CRC pasient plasma og svulstvev [58]. MIR-200c, som sammen med MIR-141 er et medlem av MIR-141~200c klynge (cluster 59, Tabell S2) samt MIR-8 familien (Tabell S3) rettet transkripsjonen repressor sink-finger E-box bindende homeobox 1/2 (ZEB1 /2) [59] og SIP1 [60] er en kritisk induserer EMT i flere krefttyper, inkludert tykktarms [61]. Sirkulasjons MIR-141 er en potensiell biomarkør for CRC metastaser [62]
Et særtrekk ved de 63 mirnas (TPM 5). Beriket i LIM1863-avledet elbiler (tabell 2) var den observasjon at 38 var utelukkende representert i
en
eller
andre
av de tre EV bibliotekene, i forhold til CL-biblioteket. Fremst, var det funn at 32/38 identifiserte mirnas var eksklusivt til A33-Exos. Av disse Mirs-19a-3p, -19b-3p, Mir-378 familien (Mirs-378a-3p, -378c og -378d), -107 og MIR-320a /b dominerer.
