Abstract
ekstracellulære matriks (ECM) ombygging er en nøkkelkomponent i cellevandring og metastase, og har vært assosiert med kreft progresjon. Til tross for viktigheten av matrisen ombygging, har systematiske og kvantitative studier på prosessen i stor grad vært mangelfull. Videre er det fortsatt uklart om den forstyrres strekk homeostase karakteristisk for malignitet skyldes i første omgang endret ECM og vev egenskaper, eller til endring av vevet ved tumorceller. For å utforske disse spørsmålene, studerte vi matrise remodellering av to forskjellige prostatakreft-cellelinjer i et tredimensjonalt system kollagen. Over en uke, overvåket vi strukturelle endringer i geleer med varierende kollagen innhold ved hjelp av konfokal refleksjon mikroskopi og kvantitativ bildeanalyse, sporing beregninger av fibril brøkdel, pore størrelse og fiber lengde og diameter. Gels som ble sådd med ingen celler (kontroll), LNCaP celler, og DU-145 celler ble kvantitativt forhold. Geler med høyere kollageninnhold innledningsvis hadde mindre porestørrelser og høyere fibril fraksjoner, som forventet. Imidlertid, over tid, LNCaP- og DU-145-befolkede matriser viste forskjellige strukturelle egenskaper sammenlignet både med hverandre og med kontroll geler, med LNCaP-celler synes å favorisere microenvironments med lavere kollagen fiberfraksjoner og større porer enn DU-145-celler. Vi posit at DU-145 celler preferanse for tettere matriser er på grunn av deres høyere invasivitet og proteolytiske evner. Inhibering av matrise proteaser gir reduserte fibril fraksjoner for høye konsentrasjon geler podet med enten celletype, som støtter vår hypotese. Våre nye kvantitative resultater sondere dynamikken i gel ombygging i tre dimensjoner, og foreslår at prostatakreftceller fornye sin ECM i en synergistisk måte som er avhengig av både innledende matrise egenskaper samt deres invasivitet
Citation. Harjanto D , Maffei JS, Zaman MH (2011) Kvantitativ analyse av effekten av kreft Invasivitet og Collagen Konsentrasjon om 3D Matrix ombygging. PLoS ONE 6 (9): e24891. doi: 10,1371 /journal.pone.0024891
Redaktør: Mário A. Barbosa, Instituto de Engenharia BIOMEDICA, Universitetet i Porto, Portugal
mottatt: 28 april 2011; Godkjent: 23 august 2011; Publisert: 27.09.2011
Copyright: © 2011 Harjanto et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne erkjenner støtte fra National Institutes of Health (1R01CA132633). DH er støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De fleste kreftformer, blant annet prostatakreft, bare bli fatalt når kreftcellene har spredning til fjerne områder [1]. Cancer metastase involverer migrering av celler fra det opprinnelige tumormassen gjennom basalmembranen og løst bindevev inn i blodet eller lymfesystemet. Tumorceller deretter ekstravasere fra sirkulasjonssystemet til å finne veien til nye vev. I løpet av metastase,-celler reagerer med den ekstracellulære matriks (ECM), et komplekst nettverk av glykosaminoglykaner, adhesjonsproteiner, og strukturelle fibre, såsom kollagen. Mange av egenskapene til ECM, inkludert matrise struktur [2], mekanikk [3], og dimensjonalitet [4], har vist seg å påvirke celle-adferd. Celler in vivo er vanligvis omgitt på alle sider av ECM, og viser vevs-spesifikke mekaniske og strukturelle egenskaper. Derfor er det viktig å undersøke celler i avstembare tre-dimensjonale (3D) systemer, som bedre etterligne fysiologiske betingelser enn flate, stive substrater.
Et kritisk trinn under in vivo-cellemigrering, er invasjon og metastase matrise ombygging. Matrix proteolyse er spesielt viktig for celler utsådd i 3D siden de er mer sannsynlig å være sterisk hindret fra å bevege seg enn celler på plane substrater. Følgelig har det blitt vist at inhibering av matriks-metalloproteaser (MMP) reduserer celle hastighet og utholdenhet i 3D-matriser, men kan ikke vesentlig endre tumorcellebevegelse på 2D-substrater [5], [6]. MMP uttrykk øker også ofte i løpet av kreft progresjon [7], noe som tyder på at avanserte kreftceller mer aktivt bygge den om ECM å lette metastaser. MMP-2 og MMP-9 har blitt identifisert som viktige MMP involvert i metastatisk prostatakreft [8]. Celler kan også bruke sin actomyosin maskiner til å trekke på matrisen til rette fibre [9] – [11]
Mens matrise remodeling er en viktig prosess, er det få studier som har forsøkt å studere den direkte.. Av spesiell interesse er å forstå hvordan ombygging dynamisk endrer ECM struktur. Et verktøy som har blitt brukt til å studere ECM struktur er konfokal mikros refleksjon (CRM). CRM samler lyset som reflekteres av ECM-fibre, slik at for 3D strukturell rekonstruksjon av matrisen. Mens nyere arbeider viser at CRM er blind for fibre som er orientert i retning av det innfallende lys, noe som resulterer i en overvurdere nettverk maskevidde [12], er CRM fortsatt en mye brukt teknikk, som gir informative data som kan danne grunnlag for komparative studier. CRM har blitt brukt tidligere for å studere kollagen struktur [13] – [16], fibrillogenese [17], og hvor cellene kommuniserer med ECM [18], [19]. Dessverre er mange av studiene på celle-matriks interaksjoner har vært ganske kvalitativ, og de har ennå til å gi en direkte sammenligning mellom cellens invasivitet, innledende kollagen konsentrasjon, og /eller endringer i struktur over tid.
i denne artikkelen tar vi sikte på å svare på alle disse spørsmålene kvantitativt. Vi undersøke hvordan matrise strukturelle egenskaper, som kvantifiseres ved bildeanalyse av CRM-data, endres over tid for å evaluere ECM remodellering av prostata kreftceller i et 3D-kollagen gel system, å variere konsentrasjonen av kollagen for å bestemme effekten av den opprinnelige ECM struktur og mekanikk . Ombygging oppførsel for to prostata kreft cellelinjer, LNCaP og DU-145, sammenlignes. LNCaP-celler er en forholdsvis langsomt voksende androgen-sensitive cellelinje avledet fra et metastatisk lesjon til benet [20]. DU-145-celler blir raskere voksende androgen-ufølsom, og er avledet fra et metastatisk lesjon til hjernen [21]. En rekke studier har vist at DU-145-celler er mer aktivt enn invasive LNCaP-celler [22] – [25]. Fra dette arbeidet, er vi i stand til å få kvantitative innsikt i hvordan to forskjellige tumorcellelinjer av ulik invasivitet fornye matrisen i 3D-miljøer. Våre resultater gir en ny innsikt i dynamikken i celle-matrise interaksjoner fra matrisen perspektiv.
Resultater
Gel mot varierende kollagen konsentrasjon viser ulike mekaniske og strukturelle egenskaper
Å skaffe en grunnlinje for sammenligning, ble 3D-geler av varierende konsentrasjon kollagen (2, 3, eller 4 mg /ml) som ikke er podet med celler (identifisert som «ingen celle» -tilstand) studert. Rheometri ble utført for å evaluere den initielle stivheten av gelene. Som ventet økte skjærmodulen med kollagen konsentrasjon, som strekker seg fra rundt 200 til 550 Pa i 2 til 4 mg /ml geler (figur 1A), og ga resultater sammenlignes med de som er rapportert av andre grupper ved hjelp av en lignende teknikk gelering [26].
(
A
) Skjærmodul modul~~POS=HEADCOMP som en funksjon av kollagen konsentrasjon for gels uten celler. Feilfelt: standardavvik. CRM bilder for gels uten celler for (
B
) 2 mg /ml; (
C
) 3 mg /ml; og (
D
) 4 mg /ml. (
E
) CFM og CRM overlegg av DU-145 celler (grønn) i 3 mg /ml kollagen (hvit) 5 dager etter såing. Scale bar for CRM-bilder: 30 mikrometer
For strukturell analyse, ble CRM bildestakker anskaffes til varierende kollagen gels 1, 3, 5 og 7 dager etter såing.. Representative CRM bilder av tre typer geler er vist i figur 1B-D. I denne studien ble de strukturelle parametere av interesse er den fraksjon av områdets kollagenfibre opptar (referert til som «fibrill fraksjon»), porestørrelse, og fiberdiameter og lengde. Disse parameterne ble valgt som sporbar, fysiologisk relevante beregninger av matrise ombygging. Kvalitativt, er det åpenbart at høyere konsentrasjons kollagen resulterer i geler som er mer tett befolkede med fibre, noe som resulterer i mindre porestørrelser. Kvantitativ bildeanalyse bekrefter disse observasjonene, som høyere fibrillforskningen fraksjon (figur 2A) og mindre porestørrelse (figur 2B) er sett ved høyere kollagen konsentrasjoner. Samlet sett er det ingen signifikant endring over tid for størrelsen fibrilen tetthet og pore (figur S1) for de geler av hver enkelt kollagen konsentrasjon, som ville være forventet i fravær av matrisen ombygging.
(
A
) fibrillforskningen fraksjon; og (
B
) pore størrelse, en uke etter såing. For celle-seeded gels, er data fra mobilnettet regioner presenteres.
LNCaP celler og DU-145 celler fornye matrisen i forskjellige måter avhengig av den opprinnelige kollagen konsentrasjon
Gel mot varierende collagen-konsentrasjon (2, 3, 4 mg /ml) ble deretter sådd med fluorescently farget prostatakreftceller. For å visualisere de fargede celler, ble konfokal fluorescens mikroskopi (CFM) utføres i forbindelse med CRM. En representant bilde er vist i figur 1E, viser at kreftcellene er klart man følger en 3D-nettverk av kollagenfibre.
Som med kontroll gels, ble celle-seeded gels avbildes 1, 3, 5, og 7 dager etter plating å gi innsikt i dynamikken i matrise ombygging. For å forstå den grad at matriksen remodellering oppstår globalt versus umiddelbart lokale for celler, regioner av den gel som på et gitt tidspunkt inneholdt celler (identifisert som «cellulære regioner»), samt områder som ikke var opptatt av cellene (identifisert som «acellulær regioner «) ble fotografert. Forskjellige regioner ble prøvetatt mellom tidspunktene slik at det ikke kan konkluderes med at en gitt region var (eller ikke) som opptas av cellene i løpet av forsøket som celler er motile. Ikke desto mindre, er det interessant å se at mens kontroll geler viser forskjellige strukturelle egenskaper i forhold til de kimsatte geler, er det ingen signifikant forskjell i fibril fraksjon og porestørrelse fra acellulære og cellulære regioner i geler podet med LNCaP-celler i 2 mg /ml kollagen konsentrasjonen over tid (figur 3). Dette er tilfelle for begge cellelinjer, og for alle gel konsentrasjoner ved et gitt tidspunkt (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at matriseremodeling skjer på en global skala, spesielt når matriksen er podet med en forholdsvis høy tetthet av celler, som tilfellet er her
(
A
) fibrilen fraksjon.; og (
B
) pore størrelse over tid. Cellular regioner av seeded gels inneholder celler; acellulære regioner ikke.
Når LNCaP-celler og DU-145-celler sådd i kollagen, er det en klar endring i fibril fraksjon og pore-størrelse i forhold til det ingen celle-tilstanden (figur 2). En uke etter såing, sammenlignet med kontroll geler, begge cellelinjene viser høyere kollagen fibril-innhold i 2 mg /ml gel og mindre porer. (Sammenlignende data for endringen i matrisens egenskaper for seeded geler over tid kan sees i figur S2.) DU-145-celler ser ut til å avsette betydelig mer kollagen enn LNCaP-celler i 2 mg /ml geler. Ved høyere konsentrasjon av kollagen geler, oppførselen til de to cellelinjer divergerer mer. Sammenlignet med kontroll geler, gjør DU-145-celler ikke ut til å forandre sine omgivelser betydelig, mens de LNCaP-seeded 3 mg /ml og 4 mg /ml geler viser betydelig lavere fibril fraksjoner og tilsvarende større porer. Fiberlengde og diameter profiler for begge cellelinjer er meget sammenlignbare med hva som er observert i den ingen celle-tilstanden (figur 4). Det bør bemerkes at skjønt de 2 mg /ml geler, mer av en forskjell i disse fiberegenskaper ble observert enn ved høyere tettheter kollagen, med LNCaP-seeded geler som viser noe smalere og kortere fibriller. LNCaP celler synes å favorisere miljøer med ca -20% kollagen belegg, mens DU-145 celler favorisere tettere microenvironments med fibril belegg på ~25-30% som fibrilen fraksjoner for alle tre kollagen konsentrasjoner testet ut til å konvergere til rundt disse verdier over i løpet av eksperimenter
Fiber diametre for (
A
) 2 mg /ml.; (
C
) 3 mg /ml; og (
E
) 4 mg /ml. Fiber lengder for (
B
) 2 mg /ml; (
D
) 3 mg /ml; og (
F
) 4 mg /ml. Y-aksen angir desimalbrøk av fibre med en gitt diameter eller lengde, slik tilfellet er i de andre fiber profil grafer (se også figur S1C-F).
LNCaP celler og DU- 145 celler demonstrerer ulike nivåer av proteolytisk aktivitet, og inhibering av denne aktivitet endrer matrisen ombygging oppførsel observert
for å bedømme den proteolytiske aktivitet og invasivitet av de to forskjellige cellelinjer direkte mer direkte, gel-zymografi ble utført. Som forventet fra tidligere studier [22] – [25], DU-145-celler synes å være mye mer invasive, som viser høyere nivåer av proteolyse av aktiv MMP-2 og MMP-9 aktiv enn LNCaP-celler (Figur 5). Den økte invasivitet av DU-145 celler kan forklare deres toleranse for tettere fiber kollagen microenvironments
(
A
) Gelatin zymogram.; og (
B
) kvantifisert data, med antall piksler av arealet av proteolytisk aktivitet på gelen normalisert med celletetthet anvendt i forsøket. Feilfelt representerer standard feil.
For å teste denne hypotesen, et bredspektret MMP inhibitor, marimastat, som blokkerer aktiviteten av MMP-1, 2, 3, 7, 9 og 12 [27 ], ble brukt til å behandle celler utsådd i kollagen geler med varierende konsentrasjon. Når MMP-aktivitet ble inhibert i begge cellelinjer, ble fibrilen fraksjoner på 4 mg /ml geler mye redusert fra det som ble sett i gelene sådd med ubehandlede celler (figur 6), og med falle under det som ble sett i kontroll geler. Dette resultatet støtter vår hypotese om at økt MMP aktivitet kan tillate celler til å fortsette å vokse og trives i høyt fiber microenvironments. I fravær av slik aktivitet, celler fornye matrisen til bedre imøtekomme deres endrede behov.
fibrillforskningen fraksjoner fra celle regioner av gels målt 3 dager etter såing for gels seeded med (
A
) LNCaP celler; og (
B
) DU-145 celler.
Diskusjoner
Matrix ombygging er et viktig steg i celle migrasjon, invasjon og metastasering. En kvantitativ forståelse av hvordan kreftceller på ulike stadier av sykdomsprogresjon endre sine microenvironments er avgjørende for en helhetlig forståelse av sykdomsutvikling og terapeutisk intervensjon. Her har vi undersøkt hvordan matrisestruktur utvikler seg over tid ved hjelp av kvantitativ CRM, studerer 3D kollagen matriser av varierende konsentrasjon seeded med to prostata kreft cellelinjer av ulik invasivitet.
Vi fant at kollagen gels uten celler viste en høyere skjærmodul og oppviste mindre porestørrelse og høyere fibril fraksjon med økende konsentrasjon kollagen som forventet. Fibrilen fraksjon og porestørrelsen av disse kontroll geler ikke endres vesentlig med tiden. Vi var i stand til å vise at LNCaP celler og DU-145 celler er aktivt remodeling deres miljø. Etter en uke, begge celletyper økes fibrilen fraksjon og redusert porestørrelse på 2 mg /ml geler sammenlignet med kontrollen. I mellomtiden, i 4 mg /ml geler, celler modifisert matrisene for å redusere fibril fraksjon og øke porestørrelse. De strukturelle endringene som er observert var påvisbare over en tidsskala på flere dager og ble funnet å forekomme relativt jevnt gjennom matriser, så det var ingen forskjell mellom acellulær og cellulære regioner i LNCaP- eller DU-145-seeded gels.
det ble også vist at LNCaP-celler og DU-145-celler fornye matrisen på forskjellige måter, noe som tyder på at ulike celletyper favorisere forskjellige typer mikromiljøer og vil fornye dem deretter for å samsvare med deres behov. I gjennomsnitt, LNCaP celler ut til å favorisere lavere kollagen innhold og høyere porestørrelser enn DU-145 celler. 2 mg /ml kollagen gels seeded med LNCaP celler vise kortere, smalere fiber i gjennomsnitt enn deres kontroll og DU-145 kolleger. Ved høyere konsentrasjoner, fiber profiler for hver collagen-konsentrasjon for de tre tilstander (kontroll, LNCaP og DU-145) var mindre skilles, noe som tyder på at det er organiseringen av matrisen snarere enn strukturen av de enkelte kollagen fibriller seg selv som befinner forskjellig mellom de ulike gel forhold.
oppregulert matrise remodeling er en viktig funksjon i svulster. Ombygging inkluderer avsetning av nye ECM, degradering av eksisterende matrisekomponenter, og fiber justering. Avsetning av nye ECM kan ikke forventes i tumor microenvironments som man kunne anta at cellene i 3D-matriser foretrekker å forholde seg til færre steriske hindringer for invasjonen. Imidlertid har mellomliggende snarere enn meget lave ECM ligandkonsentrasjoner vist seg å være optimal for celle bevegelse på grunn av behovet for å balansere trekkraft og adhesjonskreftene [28]. Histologiske studier har indikert at ondartet vev viser også økt kollagenavsetning [29]. Nylig er det blitt demonstrert at invasive kreftcellelinjer, inkludert LNCaP-celler, produserer en type I kollagen som er motstandsdyktig overfor MMP-nedbrytning og muliggjør proliferasjon og migrasjon [30]. I den 2 mg /ml kollagen geler spesielt da kan ECM avsetning være viktig for celleadhesjon og bevegelse, forklarer den økte kollageninnholdet observert i nærvær av celler.
omvendt, når kreftceller støter tett nettverk av ECM slik som basalmembranen, blir øket matriks proteolyse og fiberinnrettings kritisk for cellebevegelse. Prostata kreft biopsier utviser høyere MMP nivåer enn normalt vev [29]. Det er mulig at DU-145 celler ikke fornye den relativt tette 3 og 4 mg /ml kollagen matriser i så stor grad som de LNCaP cellene siden du-145 celler er mer invasive [22] – [24] og uttrykker høyere nivåer av MMP, inkludert MT1-MMP [23], og er dermed mer i stand til å bevege seg gjennom slike tette miljøer. LNCaP cellene trenger for å organisere matrisen ved selektivt nedverdigende eller samkjøre fiber ved hjelp av sine actomyosin maskiner for å oppnå større porestørrelser. Siden kollagen kan i tillegg til å være et hinder for migrasjon, lette invasjon og spredning [30], DU-145, som de mer invasive cellelinjen, er bedre egnet til en mer tungt fiber gel.
Når MMP var inhibert i begge cellelinjer, finner vi at cellenes preferanse for tettere matriser ble samtidig redusert, som fibrilen fraksjonene i 4 mg /ml geler sådd med marimastat-behandlede celler var mye lavere enn i geler sådd med ubehandlede celler. Nedgangen var spesielt dramatisk for gels seeded med DU-145 celler, jo mer invasiv cellelinje. Dette tyder på at aktive MMP er en stor aktør i å bestemme hvordan cellene fornye matrisen, og at økt MMP aktivitet kan ikke føre bare til redusert ECM innhold som kan være forventer. Snarere våre data indikerer at MMP faktisk kan resultere i flere fiber microenvironments. Dette tyder på at MMP kan påvirke matrise ombygging via alternative veier dessuten bare nedverdigende matrisen. Faktisk MMP’er har vært implisert i gelen sammentrekning [31], med MMP hemning som resulterer i reduksjon av kollagen-gel sammentrekning [32]. Videre har det vist seg at MMP-inhiberende resulterer i redusert kollagensyntese [33], [34], som også kan forklare den generelle reduksjon i fibril fraksjoner sett i våre marimastat behandlingsforsøk.
preferanse for den ubehandlede DU-145-celler for flere kollagenrike miljøer er også i overensstemmelse med den observasjon at vev stivne i løpet av progresjon av kreft [35], [36]. I denne studien viste vi at kollageninnhold korrelerer godt med skjærmodul. Vi har derfor oppmerksom på at DU-145-modifiserte miljøer, som viste høyere gjennomsnitts fibril fraksjoner, er stivere i gjennomsnitt enn de LNCaP-modifisert matriser. Imidlertid er det fortsatt uklart om den økte stivheten er en årsak til kreftutvikling eller er i stedet en effekt av kreft progresjon. Våre data her peker mot sistnevnte. Dette arbeidet støtter den rådende teori om avbrudd av strekk homeostase som en viktig karakteristisk for den maligne fenotype [35], [37]. Det bør påpekes skjønt at i vår studie, vi sammenlignet ombygging effekten av kun to ulike cellelinjer. Langt mer arbeid å sammenligne ombygging virkningene av et bredt spekter av kreftcellelinjer er nødvendig for å kunne gjøre den generelle utsagn om at flere høyt invasiv kreft foretrekker høyere tetthet microenvironments. Det vil også være interessant å se om og hvordan ikke-kreft celler (dvs. stamceller eller fibroblaster for tissue engineering applikasjoner) viser forskjellig ombygging aktivitet.
Totalt våre resultater gir en ny kvantitativ bilde av matrise ombygging evolusjon og dynamikk og gir en direkte sammenligning av matrise ombygging for to distinkt prostata kreft cellelinjer. Vi håper at våre resultater vil føre til nye linjer av etterforskningen på dynamikken i matrise ombygging og fremtidige eksperimenter vil fortsette å sammenligne både hvordan de strukturelle og mekaniske egenskaper av celle-seeded kollagen gels utvikle seg med tiden ved hjelp av kreft og ikke-kreftcelletyper. En slik undersøkelse vil gi ytterligere og desperat behov for informasjon om forståelse, håndtering, og bekjempelse av metastaser.
Materialer og Metoder
Cell kultur
To prostata kreft cellelinjer, LNCaP og DU-145 (begge fra ATCC, Manassas, VA), ble undersøkt. LNCaP-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium og DU-145-celler ble dyrket i F12K media. Begge typer media ble supplert med 10% volum /volum føtalt bovint serum (FBS) og 1% volum /volum penicillin-streptomycin (10 000 IU /ml penicillin, 10 000 pg /ml streptomycin) (alle cellekultur reagenser fra ATCC). Cellene ble holdt ved 37 ° C, 5% CO
2 i en inkubator. Cellene ble farget med fem mikrometer CellTracker ™ Orange CMRA (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner for celler i suspensjon før kollagen seeding. Når seedet i kollagen ble cellene opprettholdt i antibiotika-frie medier supplert med 10% FBS.
Utarbeidelse av kollagen gels
Celler ble suspendert i 3D type I kollagen (BD Biosciences, San Jose, CA) ved en endelig tetthet på 200.000 celler /ml. For geler med celler, kollagenmatriksen oppløsning bestod av LNCaP eller DU-145-celler suspendert i egnede media supplert med 10% volum /volum FBS, og et like stort volum av kollagen og nøytraliserende oppløsning (100 mM HEPES-buffer (Fisher Scientific, Pittsburgh , PA) i 2 x fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,3) som tidligere beskrevet [38]. Geler uten noen celler ble fremstilt på samme måte, bortsett fra at cellesuspensjonen volum var erstattet med media. Endelig kollagenkonsentrasjon ble variert fra 2, 3, og 4 mg /ml. Det totale volum av hver geloppløsning var 1 ml. Matrisen Løsningen ble tillatt å gelere i et 35 mm glassbunn tallerken (Mattek, Ashland, MA) ved 37 ° C og 5% CO
2 i en inkubator i 2 timer før 2 ml 10% volum /volum FBS -supplemented media ble lagt. Media ble erstattet hver to til tre dager. Geler ble fremstilt i triplikat for hver tilstand.
Rheometry
De mekaniske egenskaper av gelene med varierende kollageninnhold (2, 3, 4 mg /ml) ble evaluert ved hjelp av rheometri. Kort sagt ble kollagen oppløsninger uten celler (sammensetning som tidligere beskrevet) geldannet direkte på reometeret (TA Instruments AR2000 Rheometer) ved 37 ° C i 30 minutter. Umiddelbart etter gelering, ble målinger tatt ved hjelp av en kjegleformet geometri, oscillerende 0,1 til 10 Hz ved et dreiemoment på 0,1 μN * m. Tre prøver for hver tilstand ble målt. En kraft lov passform ble brukt på data for å få en verdi for masselagring og elastisk modulus på 10 Hz.
Konfokalmikroskopi
For å vurdere mikro gels, CRM ble utført ved hjelp en scanning confocal mikroskop (Olympus FV1000) med en 60 × 1,2 NA nedsenking i vann linse. Kollagen belagt i glassbunn retter var glade med lav intensitet 488 nm laser og lys mellom 485-495 nm lys ble samlet inn. Bilder ble kjøpt minst 100 mikrometer inn i gelen for å unngå kanteffekter. For kontroll geler som ikke ble utsådd med celler, tre 30 um stabler med 0,5 um tykke skiver ble oppnådd fra tilfeldig utvalgte områder i gelen 1, 3, 5 og 7 dager etter plettering. Ved hvert tidspunkt, for hver gel som ble podet med cellene, ble tre stabler tatt i regioner inneholdende celler og tre stabler ble tatt i regioner som ikke inneholdt celler (det vil si ikke hadde noen celler i løpet av 10 um over, under, eller sideveis). Regioner med og uten celler ble identifisert ved å utføre confocal fluorescens mikroskopi (CFM) samtidig med CRM. For CFM, ble en 543 nm laser brukes med innstillinger for eksitering /emisjonsspektra av Alexa Fluor 546. I cellulære regioner, ble en CFM bilde av cellene erholdt i parallell med CRM bildet av kollagen-strukturen. De samme mikroskop innstillingene ble brukt ved hvert kjøp for å sikre at resultatene var sammenlignbare.
Bildeanalyse
Raw CRM data ble analysert for å få kollagen strukturelle parametere. De samme behandlingsinnstillingene ble brukt fra bilde til bilde for å sikre konsistens. Fibril fraksjon og porestørrelse ble oppnådd med ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Kort fortalt ble 2D-bilder fra hver stabel binærisert, med kollagenfibre angitt med sorte piksler. Det binæriserte bilder ble deretter anvendt for å beregne den fraksjon som opptas av kollagen, i likhet med det som tidligere er rapportert [39]. Porestørrelsen ble målt ved å trekke tre linjer (horisontale, vertikale og diagonale, unngå cellene når de var til stede) over det binæriserte bildet i midten av hver stabel, og ved hjelp av plottet profilfunksjonen i ImageJ. Et skript ble skrevet i Matlab (MathWorks, Natick, MA) for å beregne avstanden mellom kollagenfibre fra denne profildata. Dette er igjen lik det som har blitt utført før [40].
Fiber diameter og lengde ble fastsatt ved hjelp Imaris (bitplan, St. Paul, MN). En ru overflate maske ble opprinnelig laget av den rå CRM data, hvorfra et glatt overflate ble generert. Objekter som er opprettet med den resulterende glatte overflaten hver representerte en kollagen fibril og statistikk på radius og en halv lengde av hver fibril var utgang.
Kvantitativ gelatin zymografi
Gelatin zymografi ble brukt til å sammenligne MMP aktivitet mellom cellelinjer. Både LNCaP og DU-145-celler ble sådd ut og dyrket til nær konfluens før inkubering med serum-fritt medium i 24 timer. Media ble ekstrahert fra kulturer, og konsentrert gjennom ultrasentrifugering i 30 minutter (10 kDa cutoff). Prøvene ble deretter blandet med Laemmli lastebuffer uten reduksjonsmiddel og underkastes til gelatin zymografi som tidligere beskrevet [41]. Kort beskrevet ble prøver ble anbrakt i en polyakrylamidgel ko-polymerisert med 0,1% gelatin og underkastet elektroforese. Gelene ble så overført til en vandig oppløsning inneholdende 2,5% Triton-X100 for å renaturere proteinet, etterfulgt av ekvilibrering i et u-buffer (50 mM Tris, pH 7,8, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl
2, 0,02% Brij- 35) og påfølgende inkubasjon ved 37 ° C i 20 timer. Geler ble til slutt farget og avfarget med Coomassie blå. Etter avfarging, ble gels tørket over natten ved hjelp av en gel tørkesett (Promega, Madison, WI). Områder av proteolytisk aktivitet er uttrykt som klare bånd mot en farget bakgrunn. Gel bildene ble behandlet med ImageJ og terskel å skaffe egnede pikselverdier for både MMP-2 og MMP-9 fulgt med normalisering av originale cellekonsentrasjoner. Eksperimentet ble utført i tre eksemplarer.
MMP-inhiberingsstudier
Cellene ble sådd ut i geler med varierende kollageninnhold (2, 3, og 4 mg /ml) i 12 brønners glassbunn plater ( Mattek). Det totale volum av hver av disse mindre geler var 0,5 ml. Hver gel ble behandlet med 50 uM marimastat (Tocris, Ellisville, MO) i 1 ml 10% FBS-supplert media 2 timer etter innledende geldannelse og blir plassert i inkubatoren. Deretter ble mediet erstattet med 100 uM marimastat i 10% FBS-supplert media hver 24. time. Geler ble fremstilt i triplikat. CFM og CRM ble utført 1 og 3 dager etter såing. Bildebehandling ble utført som beskrevet tidligere.
Statistisk analyse
Siden ingen av CRM strukturelle data fulgt normalfordelinger som vurderes av qq tomter, ble 95% konfidensintervall konstruert ved hjelp av bootstrapping fra minst 5000 simuleringer. Bias-korrigerte, akselerert algoritmen ble anvendt. Analysen ble utført med Matlab. Feilfelt på alle grafene er 95% konfidensintervall med mindre annet er angitt.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Strukturelle parametere for gels uten celler. (
A
) fibrillforskningen fraksjon og (
B
) pore størrelse over tid for alle tre gel konsentrasjoner. (
C
) Fiber diameter og (
D
) fiberlengder for 2 mg /ml kollagen over tid. (
E
) Fiber diameter og (
F
) fiberlengder på dag 7 for alle gel konsentrasjoner
doi:. 10,1371 /journal.pone.0024891.s001 plakater (TIF )
Figur S2.
Strukturelle parametere for de cellulære regioner av DU-145 celler og LNCaP celler i forhold til ingen celle tilstand over tid. Fibrillforskningen brøkdel for (
A
) 2 mg /ml; (
C
) 3 mg /ml; og (
E
) 4 mg /ml. Porestørrelse for (
B
) 2 mg /ml; (
D
) 3 mg /ml; og (
F
) 4 mg /ml
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0024891.s002 plakater (TIF)
Takk
Forfatterne ønsker å takke hjelp av Phil Allen, PhD, for mikros kompetanse, og Kaethe Beck, med utviklingen av Imaris bildebehandling rutine. Vi er også takknemlige for medlemmer av vårt laboratorium for innsiktsfulle kommentarer og forslag gjennom denne studien.
