Abstract
konstitutiv aktivering av pro-overlevelse kinaser er blitt et lovende mål av små molekyler med en økende interesse for å utvikle multi-målrettede midler. Mekanismene bak respons til de fleste agenter rettet mot kreftspesifikk overlevelse veier er fortsatt dårlig forstått, men avgjørende for deres klinisk anvendelse. I denne studien fant vi at sunitinib, et lite molekyl hemmer av flere tyrosin kinaser inkludert VEGFRs og PDGFRs induserer apoptose og hemmer cellevekst i tykktarm kreft celler i cellekultur og xenograft modeller via BH3-bare protein PUMA. Sunitinib induserte behandlingen
PUMA
transkripsjon via AKT /FoxO3a aksen. PUMA, BH3-etterligninger, eller 5-Flurourical lysfølsomt tykktarmskreftceller til sunitinib-indusert apoptose. Videre PUMA ble indusert ved sunitinib-behandling i xenografttumorer, og mangel på
PUMA
undertrykte betydelig anti-tumor effekt av sunitinib. Vår studie antyder at Puma-mediert apoptose er viktig for den terapeutiske respons til sunitinib, og aktivering av mitokondrisk veien ved BH3-etterligninger eller Puma manipulasjon kan være nyttig for å forbedre antitumoraktivitet av sunitinib. Modulering av PUMA og selektive BCL-2 familiemedlemmer kan være potensielle biomarkører for å forutsi sunitinib svar
Citation. Sun J, Sun Q, Brown MF, Dudgeon C, Chandler J, Xu X, et al. (2012) Multi-målrettet Kinase Inhibitor Sunitinib induserer apoptose i Colon kreft celler via PUMA. PLoS ONE 7 (8): e43158. doi: 10,1371 /journal.pone.0043158
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 2 mars 2012; Godkjent: 17 juli 2012; Publisert: 17 august 2012
Copyright: © Sun et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd CA129829, American Cancer Society stipend RGS-10-124-01-CCE og FAMRI (J. Yu), og ved NIH tilskudd CA106348, CA121105 og American Cancer Society stipend RSG-07- 156-01-CNE (L. Zhang). Dette prosjektet brukte UPCI felles fasiliteter som ble støttet delvis av prisen P30CA047904. J. Sun og Y. Shu støttes delvis av National Natural Science Foundation of China Grants 30772549. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA og forekomsten er på. økningen i utviklingsland [1]. Selv med en kombinasjon av forbedret kjemoterapi og stråling i de siste tiår, 5 års overlevelse av CRC pasienter med langt fremskreden sykdom fremdeles uakseptabelt lav. Avvikende aktivering av ulike kinase pathways er vanlig i de fleste solide svulster, noe som kan føre til økt spredning, overlevelse, angiogenese eller invasjon [2], [3]. I de senere år har betydelig håp blitt plassert på midler som er utviklet mot onkogene kinaser, hvis bruk i kombinasjon med kjemoterapi eller stråling kan forbedre overlevelse og resultatet av CRC pasienter [4]. Den målrettet tilnærming antas til slutt å gi sikrere og mer effektive legemiddel [5]. En stor utfordring i den kliniske bruken av disse midlene er utbredelsen av iboende og ervervet resistens, som underliggende mekanismene er fortsatt i stor grad ukjent og en gjenstand for intens gransking [4], [5].
Sunitinib (også kjent som SU11248) ble utviklet som en multi-målrettet reseptortyrosinkinasehemming (RTK) inhibitor, og godkjent av FDA i 2006 for behandling av nyrecellekreft (RCC) og imatinib resistente gastrointestinal stromal tumor (GIST) [6], [7] . Pågående kliniske studier blir utført for å evaluere effekt i andre krefttyper, inkludert metastatisk tykktarmskreft [7], [8] (https://clinicaltrials.gov/). Sunitinib hemmer en rekke av reseptor-tyrosin-kinaser (RTK) som enten er mutert eller aktiverte i kreft. Disse inkluderer reseptorer for blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF-R α og p) og vaskulær endotelial vekstfaktor-reseptorer (VEGFR1, 2 og 3), i tillegg til KIT (CD117), RET, CSF-1R, og FLT3 [6] , [7]. Sunitinib har blitt anbefalt som et andrelinjebehandling hos GIST som utviklet resistens mot imatinib på grunn av sekundære mutasjoner i
c-KIT
. Hemning av angiogenese, immunmodulering og induksjon av apoptose er blitt foreslått for å mediere anti-tumor effekten av sunitinib [7]. Mekanismene som ligger til grunn for den autonome celle virkningen av sunitinib slik som celledreping er ikke godt forstått.
Mitokondrier-mediert apoptose spiller en viktig rolle i antitumor-aktivitet i et bredt utvalg av konvensjonelle kjemoterapeutiske midler, så vel som målrettede terapier [9], [10]. Bcl-2-familien av proteiner er de sentrale regulatorer av mitokondrier-mediert apoptose, som er i inngrep med den selektive aktivering eller induksjon av den proksimale BH3-bare medlemmer i respons til tydelig så vel som overlappende signaler [11], [12]. Den BH3-bare protein PUMA spiller en avgjørende rolle i p53-avhengig og-uavhengig apoptose i humane kreftceller og mus [13], og aktiverer mitokondrie vei via BCL-2 familiemedlem Bax /Bak følgende nøytralisere alle medlemmer av antiapoptotic Bcl -2-molekyler som [14], [15], [16], [17]. DNA-skade indusert av gamma-bestråling eller vanlig brukt kjemoterapeutiske midler så som 5-fluoruracil (5-FU), adriamycin og etoposid, indusere p53-avhengig induksjon av apoptose Puma og [15], [18]. Gentoksisk påkjenninger som for eksempel vekstfaktor mangel, endoplasmatiske retikulum giftstoff og en rekke kinaseinhibitorer indusere Puma gjennom en rekke andre transkripsjonsfaktorer, inkludert p73, NF-kB og FoxO3a [13], [19], [20], [21], [22], [23].
i denne studien, viste vi at sunitinib induserer PUMA uttrykk uavhengig av p53 i tykktarm kreft celler. Induksjon av PUMA ble formidlet av transkripsjonsfaktoren FoxO3a ved hemming av AKT.
PUMA
mangel ført til motstand mot sunitinib-indusert apoptose i celler så vel som i xenografter. Vår studie gir en molekylære mekanismen av apoptose indusert av denne ikke-selektive kinase inhibitor i tykktarm kreft celler, og har viktige implikasjoner for biomarkører og potensielle strategier for å overvinne motstanden.
Materialer og metoder
Cell Culture and Drug Treatment
Colon kreft cellelinjer ble oppnådd fra ATCC. Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i 5% CO
2 og dyrket i Mycoy s 5A medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplert med 10% FBS (HyClone, Logan, UT), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). De somatiske knockout cellelinjer HCT 116
p53
KO [24], HCT 116
PUMA
KO [15], DLD1
PUMA
KO [18], HCT 116
FoxO3a
stabil knockdown (KD) celler og liten interfererende RNA (siRNA) [19] har tidligere blitt beskrevet. Cytostatika eller kjemikalier som brukes i studien omfatter sunitinibmaleat (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), 5-fluorouracil (5-FU), Gossypol (Sigma, St. Louis, MO), HA14-1 (Axxora LLC, San Diego , CA), ABT-737 (Selleck Chemicals LLC, Houston, Texas). Stamløsninger av alle forbindelser ble fremstilt i DMSO og fortynnet med dyrkningsmedium til arbeidskonsentrasjon før bruk. Celler ble infisert med adenovirus uttrykker PUMA, Ad-PUMA [15] (20 MOI) alene eller med tillegg av sunitinib. Transfeksjon av ekspresjonskonstruksjoner av Flag-Mcl-1 [16], Bcl-2 og konstitutiv AKT (Millipore) ble utført som beskrevet [20].
Western Blotting og subcellulære Fraksjone
Antistoff brukt for Western blotting inkludert de mot caspase-3, Myc (9B11), FoxO3a (total), p-FoxO3a, AKT (total), p-AKT (S473) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), cytokrom c, α- tubulin, BCL-XL, Mcl-en (BD Biosciences), caspase-9 (Stressgen BioReagents, Ann Arbor, MI), cytokromoksydase subenhet IV (Cox IV, Invitrogen), BCL-2 (Dako, Carpinteria, CA, USA) , Flag (Sigma), PUMA [15], p53, p21, Bim, Bud, Noxa, Smac og β-aktin (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ). Western blotting ble utført som tidligere beskrevet [25].
Frigjøringen av cytochorme c og Smac ble detektert i cytosol følgende subcelluar fraksjonering som beskrevet [20], [26]. I korte trekk ble celler behandlet i T75-kolber for angitte tidspunkter og utsatt for differensialsentrifugering for å oppnå cytoplasmiske og mitokondrielle fraksjoner. Konsentrasjoner av cytosoliske fraksjoner oppnådd ble normalisert ved anvendelse av en proteinanalyse fargereagens (Bio-Rad, Hercules, CA). Fraksjonene ble blandet med like volumer av 2x Laemmli-prøvebuffer og utsatt for Western blotting-analyse.
Chromatin Immunpresipitasjon
Chromatin immunoprecipitation (chip) ble gjort ved hjelp av Chromatin Immunpresipitasjon analysen kit (Millipore, Billerica , MA) med FoxO3a antistoff for kromatin nedbør som beskrevet [18]. Bunnfallet ble analysert ved hjelp av PCR ved bruk av primerne 5-GCGCACAGGTGCCTCGGC-3 og 5-TGGGTGTGGCCGCCCCT-3 som beskrevet [22].
luciferase Analyser
Celler ble transfektert med Puma reportere inneholdende enten WT eller muterte FoxO3a bindingssteder [19], med transfeksjon styre β-galaktosidase reporter pCMVβ (Promega), og ble behandlet med 12 uM sunitinib i 24 timer. Cellelysater ble oppsamlet og luciferase-aktivitet ble målt som tidligere beskrevet [23]. Alle reporter forsøkene ble gjort i tre eksemplarer og gjentatt tre ganger.
(A) De angitte tykktarmskreft cellelinjer ble behandlet med 15 mikrometer sunitinib i 24 timer. Nivåene av PUMA ble analysert ved Western blotting. (B) Den foreldre HCT 116 (WT) eller
p53
KO-celler ble behandlet som i (A) med økende doser av sunitinib og analysert for Puma, p53 og p21 ekspresjon. (C) og (D) HCT 116 celler ble behandlet med 15 uM sunitinib i de angitte tidsrom.
PUM, En mRNA og proteinnivåer ble analysert ved real-time henholdsvis RT-PCR og Western blotting,.
GAPDH
mRNA ble brukt som en kontroll for normalisering i RT-PCR, og β-actin ble brukt som en kontroll for lasting i Western blotting.
Sanntids Reverse Transcription- PCR
Total RNA ble isolert fra celler ved hjelp av Mini RNA Isolation II kit (Zymo Research, Irvine, CA) i henhold til produsentens protokoll. Total RNA (1 pg) ble anvendt for å danne cDNA ved anvendelse av Superscript II revers transkriptase (Invitrogen). Real-time PCR ble utført for PUMA og GAPDH som beskrevet [22].
(A) HCT 116 WT og
PUMA
KO celler ble behandlet med økende doser av sunitinib i 48 timer. Apoptose ble analysert ved kjerne fragmentering assay. Data ble oppnådd fra 3 uavhengige eksperimenter. **
P
0,01, KO
vs
WT.. (B) HCT 116 celler med de angitte genotyper var behandling med 15 uM sunitinib i 48 timer.
Øvre
, spaltningsproduktene av kaspase-3 og -9 ble analysert ved Western blotting.
Nedre
, frigjøring av cytokrom c og Smac i cytosol ble analysert ved Western blotting. β-aktin og CoxIV er kontroller for lasting og cytosolic og mitokondrielle fraksjoner, henholdsvis. (C) Colony formasjonen i HCT 116 WT og
PUMA
KO celler behandlet med sunitinib. Celler ble behandlet med 12 uM sunitinib behandling i 48 timer, deretter sådd ut i 1:200 eller 1:400 fortynning (~600 eller 300 celler per brønn) i 12-brønners plater og tillatt å danne kolonier i 14 dager.
Øvre,
representative bilder av koloniene.
Nedre
, koloniene som inneholder 50 celler ble nummerert og relativ overlevelse ble beregnet med ubehandlede celler satt til 100%. Data ble oppnådd fra 3 uavhengige eksperimenter. **
P
0.005, KO
vs
WT.. (D) DLD1 WT og
PUMA
KO celler var behandling med 30 mikrometer sunitinib i 48 timer.
Venstre
, PUMA og spaltningsproduktene av caspase-3 ble analysert ved Western blotting.
Høyre
, apoptose ble analysert ved kjerne fragmentering analyse. **
P
. 0,01, KO
vs
WT
apoptose Analyser
Heft og flytende cellene ble høstet, beiset. med Hoechst 33258 (Invitrogen), og analysert for apoptose ved nukleær farging assay. Et minimum av 300 celler ble analysert for hver behandling [25], [27]. For kolonidannelse assays, ble like antall celler underkastet forskjellige behandlinger og sådd ut i 12-brønners plater ved forskjellige fortynninger. Kolonier ble visualisert ved krystallfiolett farging 11 til 14 dager etter plettering som tidligere beskrevet [25], [28]. Hvert forsøk ble utført i triplikat og gjentatt minst to ganger.
(A) HCT 116 og HT-29 celler ble behandlet med 15 uM sunitinib for angitte tidspunkter. Nivåene av total FoxO3a, fosforylert (p) – FoxO3a, total-AKT og fosforylert (p) -AKT (S473) ble analysert ved Western blotting. (B) HCT 116
p53
KO-celler og HT-29-celler ble transfektert med enten tom vektor eller en konstitutivt aktiv AKT ekspresjonskonstruksjoner i 16 timer, deretter behandlet med 15 uM sunitinib i 24 timer. Nivåene av p-AKT og Puma ble analysert ved Western blotting. (C) HCT 116
p53
KO celler ble transfektert med enten en egge siRNA eller en
FoxO3a
bestemt siRNA i 24 timer, og deretter behandlet med 15 mikrometer sunitinib i 24 timer. Nivåene av angitte proteiner ble analysert ved Western blotting. (D)
FoxO3a
stabil knockdown (KD) celler ble behandlet med 15 uM sunitinib i 24 timer. Nivåene av angitte proteiner ble analysert ved Western blotting. Den spesifikke bånd av total-FoxO3a er angitt med en pil. p-aktin ble brukt som en kontroll for lasting.
xenografttumorer
Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh. HCT 116 WT og
PUMA
KO xenotransplantater ble etablert og målt som beskrevet [25]. I korte trekk ble 5-6 uker gamle kvinnelige atymiske nakne mus (Harlan, Indianapolis, IN) inokulert med 5 × 10
6 celler per område på begge flankene. Tumorene fikk etablere i 7 dager. Musene var oral gavaged i 10 påfølgende dager med 80 mg /kg /dag sunitinib fortynnet i natriumcitratbuffer (pH 4,7 til kjøretøy) eller kjøretøy [29]. Tumorvolum ble målt i to dimensjoner ved hjelp av en verniercaliper. Musene ble randomisert i grupper, slik at det gjennomsnittlige tumorvolum på tvers av gruppene var den samme før behandling. For alle
in vivo eksperimenter
, tumorvolumer ble målt hver dag i 2 dimensjoner og volumer ble bestemt i mm
3 ved hjelp av formelen l x b
2 x 0,52 (hvor l er større diameter, og b er den minste diameter av tumoren). Mus ble injisert i.p. 2 timer før avlivning med en enkelt dose av bromdeoksyuridin (BrdU) ved 150 mg /kg for å merke celler i S-fasen. BrdU ble oppløst i PBS til en sluttkonsentrasjon på 30 mg /ml. Histologisk og immunofluorescensanalyse for apoptose og proliferasjon ble utført på 5 uM frosne snitt, som beskrevet [25]. Mus ble avlivet 21 dager etter behandlingen, eller 24 timer etter den tredje behandling (dag 4). Svulster ble dissekert og hurtigfrosset for western blotting eller fiksert i 10% formalin før parafin innebygging.
(A) Chromatin immunoprecipitation (chip) ble utført på HCT 116
p53
KO celler etter 15 mikrometer sunitinib behandling for 8 og 12 timer. IgG ble anvendt som en kontroll for den FoxO3a-spesifikke antistoff. (B) HCT 116-celler ble transfektert med den PUMA reporteren som inneholder WT eller muterte FoxO3a bindingsseter i 16 timer, og deretter behandlet med 15 uM sunitinib i 24 timer. Rapportør aktiviteter ble målt ved hjelp av luciferase-analyse som beskrevet i metodene. (C)
FoxO3a
stabil knockdown (KD) celler ble behandlet med økende doser av sunitinib i 48 timer. Apoptose ble analysert ved kjerne fragmentering assay. Data ble oppnådd fra 3 uavhengige eksperimenter. **
P
0,01, KD
vs
WT.. (D) Uttrykk for Mcl-en undertrykt sunitinib-indusert apoptose i HCT 116 celler. -Celler ble transfektert med Flag-tagged Mcl-1 i 16 timer og deretter behandlet med 15 uM sunitinib i 48 timer. Apoptose ble analysert ved kjerne fragmentering assay. Data ble oppnådd fra 3 uavhengige eksperimenter. **
P
0,01, KO
vs
WT..
Høyre
, Mcl-1 uttrykk ble bekreftet ved Western blotting. β-actin ble brukt som en kontroll for lasting.
TUNEL og Farging
Histologisk analyse ble utført av hematoxylin og eosin farging. Terminal transferase deoxyribonucleotidyl -mediert dUTP Nick ende merking (TUNEL) flekker på frosne snitt ble gjort med rekombinant terminal transferase (Roche) og uUTP-Alexa 594 (Invitrogen) i overensstemmelse med produserer instruksjoner, og motfarget med 4 «, 6-diamidino- 2-phenylindole (DAPI) med mindre endring laget for parafin prøver [25], [30], [31]. Apoptotiske celler ble tellet under et fluorescens mikroskop i tilfeldig utvalgte felt, og den apoptose-indeksen ble beregnet som en prosentandel av TUNEL-positive celler i minst 1.000 scoret celler. BrdU-inkorporering ble visualisert med anti-BrdU- Alexa 594-antistoff (Invitrogen) og kjerner ble visualisert med DAPI. Indeksen proliferasjon ble beregnet ved telling av cellene under fluorescens mikroskop på flere tilfeldig valgte felt. Den BrdU-indeksen ble beregnet som en prosentandel av BrdU-positive celler i minst 1.000 scoret celler. Fosfo-AKT, fosfo-FoxO3a og aktiv caspase-3 immunhistokjemi ble utført som beskrevet [19].
Apoptose ble bestemt ved kjerne fragmentering analyse og aktivering av kaspaser. Alle data på apoptose ble innhentet fra 3 uavhengige eksperimenter mens representative vestlige blotter vises. (A) HCT 116-celler ble behandlet med 10 uM sunitinib, 5 uM HA14-1, 5 uM Gossypol, 1 uM ABT-737, 20 MOI Ad-Puma (0,2 pl /ml) alene, eller deres kombinasjon i 48 timer. *,
P
0,05, kombinasjonen
vs
monoterapi..
Høyre
, behandlet caspase-3 ble påvist ved Western blotting. (B) HCT 116
PUMA
KO celler ble behandlet med 12 mikrometer sunitinib, 5 mikrometer HA14-1, 5 mikrometer Gossypol, 1fiM ABT-737, 20 MOI Ad-PUMA (0,2 mL /ml) alene, eller deres kombinasjon i 48 timer. *,
P
0,05, kombinasjonen
vs
monoterapi..
Høyre
, behandlet caspase-3 ble påvist ved Western blotting. (C) HCT 116 WT og
Puma
KO-celler ble behandlet med 10 uM sunitinib, 30 ug /ml 5-FU, enten alene eller i kombinasjon i 48 timer. *,
P
0,05, KO
vs
WT..
Høyre
, behandlet caspase-3 ble påvist ved Western blotting.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism IV programvare. Alle p-verdier ble beregnet av t-test, og P 0,05 ble betraktet som signifikant. Betyr ± ett standardavvik (SD) ble vist i figurer der det er aktuelt.
Resultater
PUMA blir indusert av sunitinib i tykktarm kreft celler
uttrykk for PUMA er lav i mest ubetonte celler, og induseres av ulike genotoksiske og ikke-genotoksiske påkjenninger [23]. For å bestemme en potensiell rolle PUMA i sunitinib-indusert respons, vi analyserte nivåer av PUMA, p21 og p53 før og etter behandling i fem tykktarm kreft cellelinjer. Tre av disse linjene, HCT 116, RKO og SW 48 inneholde WT
p53
mens to linjer HT 29 og SW 480 inneholder mutant
p53
. Puma ble indusert ved sunitinib i alle fem cellelinjer (Fig. 1A). PUMA induksjon var doseavhengig og oppstod i både HCT 116 WT og
p53
knockout (KO) celler (Fig. 1B). Basale nivåer av PUMA var lavere i
p53
knockout celler sammenlignet med WT celler som tidligere rapportert (Fig. 1B) [15]. p53 og p21 ble også indusert av sunitinib-behandling.
PUMA
mRNA ble raskt indusert av sunitinib, foregående protein induksjon (Fig. 1C og 1D). Disse data tyder på at PUMA er transcriptionally indusert av sunitinib uavhengig av p53 i tykktarm kreft celler.
(A)
Venstre
, vekstkurve for HCT 116 WT og
PUMA
KO tumorer behandlet med sunitinib (Suni, oral gavage, 80 mg /kg /mus, daglig i 10 dager) eller bærer (ve, sitratbuffer pH4.7) i 21 dager. Tumorvolumet ble målt hver annen dag. N = 7 per gruppe. **
P
0,01, WT + Ve
vs
WT + Suni: *,
P
0,05, WT + Suni
vs.. PUMA
KO + Suni.
Righ
t, et representativt bilde av WT og
PUMA
KO svulster behandlet som indikert på dag 21. (B) Sunitinib induserte PUMA i xenografttumorer. Nivåene av angitte proteiner i fire tilfeldig valgte WT KO tumorer ble påvist ved Western blotting. (C) Innholdet av p-AKT og p-FoxO3a i WT tumorer 24 timer etter den tredje dose ble analysert ved IHC. Representative bildene vises. (D)
PUMA
mangel hemmet sunitinib-indusert apoptose og veksthemming i xenografttumorer. Parafinsnitt av HCT 116 tumorene 24 timer etter den tredje injeksjon ble utsatt for TUNEL og BrdU-farging for å kvantifisere apoptose og proliferasjon, respektivt. Indeksen for TUNEL-positive eller BrdU-merkede celler ble beregnet. **
P
0,01, WT + Ve
vs
WT + Suni: *,
P
0,05, WT + Suni
vs.. PUMA
KO + Suni.
PUMA som megler Sunitinib induserte apoptose
For å undersøke en potensiell rolle PUMA i sunitinib-indusert apoptose, sammenlignet vi svarene på HCT 116 celler med isogen
PUMA
knockout (KO) celler [15].
PUMA
KO celler var svært motstandsdyktig mot sunibinib-indusert apoptose (fig. 2A). Som ventet ble aktivering av caspase-3 og -9, eller cytosolic frigjøring av cytokrom c eller Smac svekket i
PUMA
KO celler, men ikke i
p53
KO celler (Fig. 2B) . I langtids koloni formasjon analyser,
PUMA
KO celler generert over 4 ganger flere kolonier enn WT celler (Fig. 2C). PUMA ble også betydelig indusert av sunitinib i
p53
mutant DLD 1 celler mens
PUMA
mangel betydelig blokkert sunitinib-indusert apoptose og caspaseaktivering i disse cellene (Fig. 2D). Vi har også undersøkt nivåene av flere BH3-bare proteiner og antiapoptotic BCL-2 familiemedlemmer etter sunitinib-behandling. Ingen konsistent endring ble observert i de fleste av dem, bortsett fra en hurtig Mcl-en nedregulering og en forsinket induksjon av Bim etter 24 timer, i HCT 116-celler (fig. S1A). Det ble imidlertid liten eller ingen Mcl-en nedregulering eller Bim induksjon observert i DLD1-celler (fig. S1B). Interessant, nivåer av flere BCL-2 familiemedlemmer økt i
PUMA
KO celler sammenlignet med WT celler, som kanskje gjenspeiler deres nedbrytning av proteaser aktiveres under behandlingen og apoptose (Fig. S1B). Disse resultatene tyder på at PUMA spiller en nøkkelrolle i apoptotiske responser til sunitinib i tykktarm kreft celler.
The Mechanism av PUMA Induksjon av Sunitinib
PI3K /AKT sti er en vanlig effektor nedstrøms flere kinaser målrettet av sunitinib. Vi undersøkte derfor AKT aktivering i et tidsforløp eksperiment følgende sunitinib behandling, og fant AKT de-fosforylering i løpet av minutter (fig. 3A). FoxO3a er en transkripsjonsfaktor og veletablert målet på AKT, og dens fosforylering av AKT fører til inaktivering og atom eksklusjon. Sunitinib behandling førte til en rask de-fosforylering av FoxO3a, men hadde ingen tydelig effekt på total FoxO3a nivåer (Fig. 3A). Det skal bemerkes at endringer i FoxO3a og AKT-fosforylering, eller
Puma
mRNA er dynamiske og forbigående; mens induksjon av Puma protein er vedvarende og jevn på tvers av forskjellige cellelinjer (fig. 1 og 3A). Eksogent ekspresjon av aktiv AKT trykkes Puma induksjon av sunitinib (Fig. 3B). Induksjon av PUMA ble betydelig hemmet av
FoxO3a
knockdown ved enten forbigående uttrykk for siRNA eller stabilt uttrykk for shRNA i både WT og
p53
KO HCT 116 celler (Fig. 3C og 3D).
p53
KO celler ble brukt til å redusere p53-depedent PUMA induksjon ved transfeksjon.
Vi neste fastslått om FoxO3a aktiverer direkte
PUMA
transkripsjon av kromatin Immunpresipitasjon (chip) analyse. To FoxO3a bindingssteder ligger i første intron av
PUMA product: [19]. Rekrutteringen av FoxO3a til
PUMA
promoter som inneholder disse områdene økt så tidlig som 8 timer etter behandling med sunitinib (fig. 4A). Ved hjelp reporter analyser, fant vi at mutasjoner i FoxO3a bindingssteder betydelig redusert PUMA reporter aktivitet etter behandling med sunitinib (Fig. 4B). Videre
FoxO3a
stabile knockdown-celler ble funnet å være motstandsdyktige mot sunitinib-indusert apoptose (Fig. 4C). MCL-1-nivåer ble restaurert av
FoxO3a
siRNA i sunitinib-behandlede celler (fig. 1D og 3C, S1), noe som tyder på sin degradering kan være en ekstra mekanisme for sunitinib-indusert apoptose i HCT 116 celler. Sunitinib-indusert apoptose forekommet på andre CRC linjer inkludert HT29, og ble undertrykket ved overekspresjon av Mcl-1 eller Bcl-2 (fig. 4D og S2). Disse dataene indikerer at FoxO3a regulerer PUMA induksjon og mitokondrie sti i sunitinib-indusert apoptose.
BH3 etterligninger eller forhøyet PUMA Levels bevisst Colon kreft celler til å Sunitinib
De ovennevnte observasjonene spår høye nivåer av PUMA , BH3-bare proteiner, eller lite molekyl BH3 etterligninger sensitivkreftceller til sunitinib-indusert apoptose. Flere BH3-etterligninger inkludert HA14-1, gossypol og ABT-737, og PUMA adenovirus (Ad-PUMA [15]), var i stand til å bevisstgjøre HCT 116 celler til sunitinib. Disse midler alene induserte lite eller begrenset apoptose (Fig. 5A). Interessant, BH3 etterligninger indusert betydelig apoptose og caspaseaktivering i
PUMA
KO celler når den kombineres med sunitinib (Fig. 5A og 5B). DNA-ødeleggende midler så som 5-FU induserer Puma og Noxa i p53 WT-celler [14], [32], [33], [34]. 5-FU også synergized med sunitinib å indusere apoptose i HCT 116-celler (fig. 5C), som er forbundet med øket Puma induksjon (fig. S3). Dette synergi ble svekket, men ikke sperret i
PUMA
KO celler (Fig. 5C) kanskje på grunn av modulasjoner av andre BCL-2 familiemedlemmer via både p53-avhengige og uavhengige mekanismer. Disse dataene viser at forhøyede nivåer av PUMA eller BH3 etterligninger kan forbedre apoptotiske responser til sunitinib, selv i apoptose-resistente celler.
PUMA formidler Terapeutiske Responses to sunitinib i xenograft modeller,
For å vurdere om PUMA modulerer terapeutiske svar
in vivo
, WT og
PUMA
KO HCT 116 celler ble injisert subkutant i flankene av BALB /c (nu /nu) hårløse mus for å etablere xenografter. Sammenlignet med bilen, sunitinib behandling resulterte i 62% og 38% veksthemming i HCT 116 WT og
PUMA
KO svulster, henholdsvis (figur 6A.). Forskjeller mellom
PUMA
genotyper var statistisk signifikant i sunitinib-armen (P 0,01)., Men ikke i bilen arm om effektivitet eller vekst i tumor etablering (Fig. 6A)
PUMA var signifikant indusert i WT tumorer fra sunitinib-behandlede mus (fig. 6B). Modulasjoner av Mcl-en, fosforylert FoxO3a og AKT ble også observert (Fig. 6B og 6C). Analysere tumorsnitt fra mus en dag etter den tredje sunitinib administrasjon (dag 4), fant vi en betydelig lavere rate av apoptose og høyere rate av celledeling i
PUMA
KO svulster sammenlignet med WT svulster (fig. 6D og S4A). Aktiv caspase-3-farging bekreftede betydelig redusert apoptose i
Puma
KO svulster (~80%), sammenlignet med WT tumorer som ble behandlet identisk (fig. S4B). Disse resultatene viser at den terapeutiske responsen på sunitinib
in vivo
er mediert av PUMA-avhengig apoptose.
Diskusjoner
Emerging tyder på at induksjon av apoptose er en viktig mekanisme et bredt spekter av anticancermidler [2], [10], [35]. Unndragelse av celledød er et kjennetegn på kreft og en viktig bidragsyter til terapeutisk motstand [2], [3]. I tillegg til godt dokumenterte effekter av sunitinib i hemme tumor angiogenese [6], [7], [36], [37], vårt arbeid viser at sunitinib viser en sterk pro-apoptotiske aktivitet i tykktarm kreft celler via PUMA induksjon gjennom transkripsjon faktor FoxO3a, men ikke p53, NF-kB p65 eller p53 homolog p73 og p63. Sunitinib-indusert apoptose er assosiert med induksjon av Bim eller nedregulering av Mcl-l i visse tykktarmskreftcellelinjer vi testet. Tidligere arbeid demonstrert involvering av Bim og STAT3 under sunitinib-indusert apoptose i andre celletyper [38], [39], [40]. Sammen utgjør disse data tyder på at induksjon av BH3-bare proteiner kan være en felles underliggende mekanismen sunitinib-indusert kreft celle drap som kan bli påvirket av status for ulike kinaser, og ulike BH3-bare proteiner kan være viktig i ulike celletyper.
en rekke mer selektive VEGFR inhibitorer ble også funnet å indusere apoptose i Puma og tarmkreftceller (data ikke vist), som støtter et ikke-angiogen rollen til anti-VEGFR terapier. Det vil være viktig å finne ut om sunitinib-indusert apoptose formidles av PUMA eller andre BH3-bare proteiner i andre solide tumorer som nyrekreft og GIST, og deres potensielle rolle i apoptotiske respons til andre VEGFR og PDGFR hemmere. Redusert følsomhet for sunitinib ble foreslått til å være knyttet til mutasjoner i
KIT
eller
VEGFR /FDGFR
eller i andre RTK, samt redusert uttrykk av løselige VEGF reseptorer (sVEGFs) [6], [7], som kan undertrykke celledød eller fremme overlevelse [2], [5]. I tillegg kan inhibering av tumor angiogenese eller andre komponenter i mikromiljøet indirekte aktivere celledødsveier [2]. Bruken av isogene cellelinjer som vi gjorde her kan være spesielt nyttig for å forstå narkotika mål og mekanismer [41].
Til tross for spenningen i utviklingen av midler rettet mot onkogene kinaser, kliniske data viser at de fleste av disse midlene er generelt effektive bare i en liten del av pasientene [4], [5]. En stor endring er å identifisere biomarkører for å hjelpe pasientens valg og lagdeling. Våre data viste at PUMA vedvarer 24-48 timer etter behandling med sunitinib. I motsetning til dette, hemming av AKT /FoxO3a er mer forbigående og gjenoppretter i timer, sannsynligvis som følge sekundære og overlevelses forsøk i tumorceller etter aktivering av apoptotisk signalering. Disse funnene potensielt forklare hvorfor oppstrøms signalmolekyler er mindre egnet som biomarkører, og foreslå modulering av mitokondrie dødsveien kan være mer nyttig avlesning for den generelle terapeutisk aktiviteten av cytostatika.
