Abstract
Nye bevis peker til MYC – en mangefasettert bHLHZip transkripsjonsfaktor deregulert i flertallet av kreft hos mennesker – som et prioritert mål for terapi. Hvordan å målrette Myc er mindre klart, gitt sitt engasjement i en rekke viktige funksjoner i friske celler. Her rapporterer vi på handlingen mekanismen av Myc forstyrrende molekylet betegnes Omomyc, som viste forbløffende terapeutisk effekt hos transgene mus kreft modeller
in vivo
. Omomyc handling er forskjellig fra den som kan oppnås ved gen knockout eller RNA-interferens, tilnærminger er utformet for å blokkere alle funksjoner av et genprodukt. Dette molekylet – i stedet – ser ut til å føre til en kant-spesifikk forstyrrelse som ødelegger enkelte protein interaksjoner av Myc-noden og holder andre intakt, med det resultat av omforming Myc transcriptome. Omomyc selektivt rettet MYC protein interaksjoner: den binder C- og N-myc, Max og Miz-en, men binder ikke gal eller velg HLH proteiner. Nærmere bestemt, det hindrer Myc binding til promoter E-bokser og trans av målgener samtidig beholde Miz-en avhengig binding til arrangører og transrepression. Dette er ledsaget av brede epigenetiske endringer som for eksempel redusert acetylering og økt metylering ved H3 lysin 9. I nærvær av Omomyc er Myc interactome kanaliseres til undertrykkelse og sin aktivitet ser ut til å gå over fra en pro-onkogen til en svulst undertrykkende en. Gitt den ekstraordinære terapeutiske virkningen av Omomyc i dyremodeller, tyder disse data på at vellykket målretting Myc for kreftterapi, kan kreve en lignende dobbelt virkning, for å forhindre Myc /Max-binding til E-bokser og, på samme tid, holde undertrykke gener som ville bli undertrykt av Myc
Citation. Savino M, Annibali D, Carucci N, Favuzzi E, Cole MD, Evan GI, et al. (2011) Handlingsmekanisme den Myc Inhibitor betegnes Omomyc kan gi ledetråder om hvordan å målrette Myc for Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (7): e22284. doi: 10,1371 /journal.pone.0022284
Redaktør: Laszlo Tora, Institutt for genetikk og molekylær og cellebiologi, Frankrike
mottatt: 02.11.2010; Godkjent: 23 juni 2011; Publisert: 21.07.2011
Copyright: © 2011 Savino et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsstøtte fra AIRC, ASI, MIUR og Fondazione Guido Berlucchi (SN), en Bear Necessities Pediatric Cancer Foundation grant (LS), en CNR kortsiktig mobilitet fellesskap (SN) og av CNR – Sapienza Universitetet Stipendiater (MS, DA). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mYC transcriptional regulatorer – C-, N- og L-myc – er grunnleggende, helix-loop-helix, leucine glidelås (bHLHZip) proteiner som binder seg til en rekke genomisk nettsider for å enten indusere eller undertrykke transkripsjon av gener som er viktige for cellevekst, differensiering og metabolisme [1] – [4]. Disse faktorene – spesielt c-myc og N-myc – er deregulert i de fleste kreft hos mennesker. Dette er vanligvis ikke grunn til
Myc
genmutasjon men resultater fra oppstrøms mutasjoner som påvirker andre onkogener eller tumor dempere. Myc aktivitet ser dermed ut til å være nødvendig for utvikling og vedlikehold av de fleste svulster, selv når initiert av andre årsaker. I tumorer indusert av Myc oppregulering i transgene mus, utløser selv kort Myc de-aktivering tumor regresjon ledsaget av vekst arrest, differensiering, og kollaps av svulsten karsystemet [5]. Myc opererer innenfor et svært sammenvevd interactome nettverk og en mulig strategi for målretting myc onkogen funksjon er dominant forstyrrelse av MYC protein interaksjoner. I dette henseende, Myc oligomerisering domene – den bHLHZip regionen – å bevist være i stand til å inhibere dominant Myc formerer evne hos rotte embryo fibroblast celler [6], [7]. Dette domenet formidler direkte interaksjon med Max og sekvens spesifikk binding til spesifikke konsensussekvenser – de E bokser – i arrangører av aktiverte målgener. Den bHLHZip domenet er også involvert i samspillet med andre partnere – som Miz-en – som formidler transkripsjonen undertrykkelse av Myc [4], [8]. Å forstyrre MYC protein-protein interaksjoner, har vi utviklet en dominant negativ molekyl ved å innføre fire utvalgte mutasjoner i bHLHZip område av human c-myc. Det resulterende 90 aminosyre miniprotein – betegnet Omomyc for sin evne til å danne homodimerer – er i stand til å hemme c-Myc /Max krets, for å påvirke transkripsjonen aktivering av c-Myc, og for å forbedre c-Myc avhengig apoptose i vevskulturceller [9 ], [10]. Det ble vist seg å forhindre c-myc indusert papillomatosis
in vivo
uten å påvirke vev homeostase [11] antyder en kapasitet på målretting kreftceller uten å skade normalt vev.
Til tross for sin gjennomgripende rolle i menneskets kreft, Myc møtt med betydelig skepsis som et terapeutisk mål siden kravet om spredning og vedlikehold av voksne stamcelle avdelinger reist bekymring for toksisitet av Myc hemming for friskt vev [12], [13]. Delvis takket være arbeide på Omomyc potensialet for Myc som et terapeutisk mål er nå etablert. Mange tvil om selektivitet for svulster har blitt fordrevet av studier som viser at forbigående hemmende Myc i huden, tarmepitelet og andre vev ikke dramatisk endre vev homeostase [11], [14], [15]. Effekt og sikkerhet av Myc målretting
à la Omomyc
har entydig vist ved reversibel uttrykk for Omomyc i transgene modeller [16], [17]. Systemisk uttrykk for Omomyc dempes spredning i raskt dele vev, men dette var godt tolerert; vev homeostase ble opprettholdt, ikke apoptose ble observert i normale vev og alle bivirkninger som lett ble reversert etter Omomyc fjerning. I Ras-drevet lungesvulster, virkningen av Omomyc var imponerende. Mus kontinuerlig uttrykker Omomyc mislyktes i å utvikle lunge adenokarsinom. I mus som tidligere hadde utviklet fremskreden kreft, induksjon av Omomyc utløste tumorregresjon som ble ledsaget av redusert proliferasjon og øke apoptose av tumorvevet [16]. En tilsvarende anticancer-effekt ble funnet i en simian virus 40 (SV40) -driven pankreatisk øy tumormodell [17], i brystkreft (G. Evan, personlig kommunikasjon) og gliom (under forberedelse). Så, manipulere Myc funksjon på samme måte som Omomyc kan ha potensial til en effektiv anticancer strategi for forskjellige tumortyper.
I betraktning av de markante egenskaper av dette molekyl, er det svært aktuelt å klargjøre dets virkningsmekanisme. Omomyc biologiske effekter er bare resultatet av
tout domstol
Myc funksjon ablasjon, som det ville skje med Myc genet eller mRNA knockouts? Åpenbart for å forklare den bemerkelsesverdige egenskapene til Omomyc er det viktig å forstå hvorvidt de er et resultat av selektiv målretting av Myc interactome og hvordan de påvirker de Myc aktiverte og fortrengte mål. Disse problemene løses i dette arbeidet.
Våre data tyder på at Omomyc ikke føre til en global hemming av Myc funksjon, men fungerer som en kant-spesifikk forstyrrelse av Myc interactome, kanalisering sin aktivitet mot transrepression. Dette kan være nøkkelen til suksess som en kreft agent.
Resultater
Omomyc selektivt rettet mot Myc interactome
Direkte fysisk interaksjon med bHLHZip protein Max er avgjørende for Myc funksjon : myc /Max-komplekset binder DNA – erkjenner E-bokser – og fungerer som en transkripsjonen aktivator [18]. Omomyc er i stand til homodimerize, for å danne heterodimerer med c-myc og Max proteiner, og for å interferere med c-Myc /Max kompleksdannelse og binding til E-bokser in vitro [9], [10]. For å bedre adresse Omomyc selektivitet undersøkte vi dens evne til å binde N-myc – hvilke aksjer betydelig funksjonell redundans med c-myc og har viktige roller i svulstdannelse i nervesystemet -, Mad – et strengt relatert bHLHZip faktor som dimerizes med Max, binder E-bokser og fungerer som transcriptional repressor [4] -, Heb og Id1 – to HLH proteiner representant for en stor familie av transkripsjons regulatorer innblandet i utviklingsprosesser [19]. For å vurdere evnen til å binde N-myc vi utførte immunoutfellinger på 293T celler ectopically uttrykker Omomyc smeltet til østrogen reseptor ER ™ – Omomer [10] – sammen med FLAG merket C- eller N-myc. Vi fant at Omomyc bundet til N-Myc på samme måte som c-Myc (figur 1A), i overensstemmelse med den virtuelle identiteten til de bHLHZip domene aminosyresekvenser for myc familieproteiner. For å vurdere binding til Max, Mad og de to HLH proteiner Heb (en E protein) og ID1 vi utført rullegardin analyser med GST-linked Max, Mad, Heb og Id1 på ekstrakter av 293T celler ectopically uttrykker FLAG-merket Omomyc. Mens binding til Max var sterk som tidligere rapportert [9], Omomyc binding til Mad var knapt synlig og binding til Heb og Id1 var umulig å oppdage (figur 1B). Den svake signal i GST-Mad rullegardin er sannsynligvis på grunn av svært høye nivåer av FLAG-Omomyc uttrykk i de transfekterte celler og ikke reflekterende av fysiologisk samspill mellom de to proteiner. I sammendraget, fant vi at Omomyc bindende spesifisitet for Max og Mad proteiner var det samme som Myc. Tilsvarende til Myc, betyr Omomyc ikke ut til å interagere med HLH proteiner og som derfor ikke virker ved å forstyrre HLH proteinnettverk avgjørende for differensiering kontroll [20] – [22]. Vi spurte været Omomyc samhandlet med hypoksi-induserbar faktor 1-alfa (HIF-1α), et protein som fungerer som en mester transcriptional regulator av adaptiv respons på hypoksi, spiller en viktig rolle i tumor angiogenese og viser en betydelig samspill med Myc i reguleringen av flere glykolytiske gener [23] – [25]. HIF-1α inneholder en bHLH domene og motvirker Myc ved å binde seg til Max [24]. For å undersøke Omomyc binding til HIF-1α vi utført immunoutfellinger på 293T celler ectopically uttrykker FLAG tagget Omomyc sammen med HIF-1α. Vi fant (Fig. 1C) som Omomyc ikke binde HIF-1α, mens Max gjør som rapportert. Til sammen disse eksperimentene klart viser at Omomyc er Myc-Max-Mad nettverk spesifikke og – innenfor dette nettverket – selektivt påvirker Myc /Max dimerization, som kreves for Myc binding til e-bokser og trans av et stort antall gener
A) Omomyc binder c-myc og N-myc. Immunoblotting (WB) med flagg og ER antistoffer – som antydet – for immunoutfellinger utført med FLAG antistoffer på 293T celler transfektert med FLAG-c-myc eller FLAG-N-myc uttrykker vektorer sammen med Omomer uttrykke vektoren. B) Omomyc binder Max, men ikke Mad og to representative HLH proteiner. Immunoblotting (WB) med FLAG antistoffer av GST rullegardin analyser utført med GST, GST-MAX, GST-MAD, GST-ID1 og GST-HEB (10 IG hver) på 293T celler transfektert med FLAG-Omomyc uttrykke vektoren. 293T celler transfektert med ID2 eller FLAG-13I [65] uttrykker vektorer ble brukt som positiv kontroll for henholdsvis GST-HEB og GST-ID1,. Utdrag fra bakterier uttrykker Hans-MAX ble brukt som positive kontroller for GST-MAX og GST-MAD. C) Omomyc binder ikke HIF-1α. Immunoblotting (WB) med HIF-1a, Max og FLAG antistoffer – som antydet – for immunoutfellinger utført med FLAG antistoffer på 293T celler transfektert med HIF-1α, Max og FLAG-Omomyc uttrykker vektorer. D) Omomyc binder Miz-en. Immunoblotting (WB) med Miz-en og ER antistoffer – som antydet – for immunoutfellinger utført med Miz-1-antistoffer på 293T celler transfektert med Miz-en og Omomer uttrykker vektorer
Et viktig aspekt av Myc. funksjon er transrepression av flere gener som er involvert i vekstkontroll, differensiering og tumor suppresjon [4]. Denne aktiviteten ser ikke ut til implisere direkte Myc binding til E-bokser. Myc blir rekruttert til arrangører av fortrengte gener bare indirekte, ved interaksjon med proteiner som direkte binder seg til slike arrangører. Den mest kjente av dem er Miz-1, et sink-finger-protein som er involvert i Myc avhengig undertrykkelse av cellesyklus inhibitorer – p15-INK4b (Cyclin-avhengig kinase 4 inhibitor B) og p21 (CDKN1: cyklin-avhengig kinase inhibitor 1) – og i Myc avhengig apoptose i respons til vekstfaktor uttak [26] – [29]. Antagelig i kompleks med Max, MYC kontakter Miz-1 N-terminale område gjennom aminosyreseter D394 S405 og [28] som er plassert i den HLH-regionen. Ettersom disse områdene ikke er mutert i Omomyc, hypotese vi at Omomyc beholdt evnen til å binde Miz-en. Vi testet denne muligheten via immunoprecipitation på 293T celler ectopically uttrykker Omomer og Miz-en. Figur 1D viser at Omomyc samhandler direkte med Miz-en. Endogen Miz-1 ble rapportert til å akkumuleres i cytoplasma av celler, med en mindre fraksjon i kjernen; Myc overekspresjon utløser kjernefysisk translokasjon av Miz-en og karbonlagring i diskrete subnuclear foci [30]. For å undersøke samspillet og intracellulær lokalisering av Omomyc, Omomyc /Miz-en og Omomyc /c-myc komplekser, vi transfektert 293T celler med FLAG merket Omomyc eller c-myc uttrykke plasmider sammen med plasmider som uttrykker ukodet Miz-en og c-myc, og detektert protein lokalisering av immunofluorescens med anti FLAG, c-Myc, og Miz-1-antistoff (figur 2). I celler transfektert med enkle ekspresjonsplasmider, Miz-1 var det meste (ca. 90%) lokalisert i cytoplasma som tidligere rapportert [30], Myc var til stede kun i kjernen som forventet, og Omomyc var i stor grad i kjernen (ca. 85% ) med en mindre del i cytoplasma (figur 2). Omomyc mangler kjernefysiske lokalisering signal av MYC proteiner: Det kan gå inn i kjernen på grunn av sin lille størrelse eller ved dimerisering med endogen Myc eller Max. Når kotransfektert, mest MYC proteiner samlokalisert med Omomyc i kjernen; en brøkdel av Omomyc forble i cytoplasma – ikke er knyttet til Myc – sannsynligvis på grunn av et høyere nivå av ekspresjon. Ektopisk ekspresjon Myc utløst nukleær translokasjon av Miz-1 (ca. 40%) og dannelse av diskrete subnuclear brennpunkter, som tidligere rapportert [30]. Miz-1 ble delvis flyttet i kjernen, i nærvær av en overuttrykt Omomyc også (ca. 35%). Endogen Miz-1 – som er til stede i små mengder i celler [30] -. Vil antagelig være hovedsakelig i kjernen, i nærvær av en overuttrykt Myc eller Omomyc
A) immunfluorescens mikrofotografier av 293T-celler transfektert med Miz -1, c-myc, FLAG-c-myc og FLAG-Omomyc uttrykke plasmider – som angitt ovenfor paneler – og farget med antistoffer mot FLAG (grønn), Miz-en (rød) og c-myc (rød) som angitt på innsiden paneler. Kjerner av de samme feltene ble farget i blått med DAPI (4,6-diamidino-to-phenylindole). B) Kvantifisering av forsøkene er vist i A), basert på undersøkelse av 15 mikroskopi-feltet og minst tre biologiske replikater.
Til sammen disse funnene viser at endringen av de Myc interactome ved Omomyc resulterer ikke kun fra den hemming av Myc-binding til Max – noe som er nødvendig for E-box binding og transaktivering -, men også fra interaksjonen av Omomyc med Miz-1, en Myc bindingspartner som er involvert i transrepression
Omomyc påvirker. transkripsjonen respons av fibroblaster til serum stimulering
myc-proteiner er i stand til å binde seg til 10-20% av genomiske loci og for å modulere ekspresjon av hundrevis til tusenvis av gener. Omomyc ble vist å påvirke trans av Myc aktivert målet genet
cad
i Rat1 fibroblaster og ikke å påvirke nedregulering av Myc trykt målet
gadd45 product: [10]. For å få et innblikk i omfattende genuttrykk endringer påvirket av Omomyc, vi analyserte transkripsjons respons på serum stimulering av Rat1 fibroblaster stabilt infisert med en Omomer produserer eller en tom retrovirus (Rat1-Omomer og Rat1-kontrollceller, henholdsvis, som beskrevet i [ ,,,0],10]). c-myc er kjent for å bli nedregulert ved serum sult og skarpt indusert ved tilsetning serum – sammen med en rekke andre umiddelbare tidlige gener – og nådde en topp etter 1 til 2 timer; c-Myc induksjon har en rolle i cellesyklusen gjeninnførings [31] – [33]. Bortsett fra celleproliferasjon, serum responsen av fibroblaster integrerer andre metoder – f.eks. g. sårtilheling [34] – og serum regulert gener inkluderer gener som er regulert av Myc samt gener som ikke er det. Celler ble serum-sultet før serum stimulering og mRNA-ekspresjon ble analysert ved tidspunktet for serum re-tilsetning (tid 0) og 90 deretter – et tidspunkt ved hvilket Myc induksjon er maksimal – slik at induksjon av en direkte Myc mål bør nøye følge ekspresjonen av Myc. mRNA uttrykk ble analysert via en oligonukleotid array som inneholder prober for ca 7000 i full lengde sekvenser og 1000 EST (expressed sequence tags) klynger. Data er tilgjengelige i GEO database med følgende sjonsnummer: GSE25039. Relativ mRNA uttrykk verdier (Brett endringer) ble beregnet ved å ta som referanse Rat1-kontrollceller ved tid 0; bare gener som viser en Fold Endring av minst +3 (oppregulert gener) eller -3 (downregulated gener) ble tatt hensyn til. På tidspunktet for serum stimulering, Omomer uttrykker og tak Rat1 celler viste en praktisk talt identisk genekspresjon profil (figur 3, øverst). På 90 min av serum induksjons 111 sekvenser ble oppregulert og 96 nedregulert i Rat1-kontrollceller. Påfallende, ble en uttalt downregulation funnet i Rat1-Omomer celler: så mange av 516 gensekvenser ble nedregulert og 143 oppregulert (tabell S1). Alt i alt, det totale antall sekvenser hvis ekspresjon ble opp eller nedregulert i nærvær av Omomyc etter 90 min serum stimulering utgjorde 8,2% av sondene i gruppen. Blant sekvensene nedregulert i nærvær av Omomyc, 475 representerte gener med en kjent GeneID (gen-ID) og 41 andre transkribert regioner. For å finne ut om genene nedregulert i nærvær av Omomyc ble også validert MYC målene vi sammenlignet dem til settet av gener oppført i Myc Cancer Gene database (www.myccancergene.org), en samling av MYC responsive gener identifisert i uavhengige studier gjennom en rekke teknikker [35]. 115 (24%) av de 475 genene nedregulert i nærvær av Omomyc ble oppført i Myc målet genet database: 45 ble oppført som oppregulert og 35 som nedregulert av Myc, mens opp- eller nedregulering av de resterende 35 gener var ukjent. For å påpeke direkte myc mål innenfor listen av gener nedregulert i nærvær av Omomyc, ble listen krysset med de fra to undersøkelser som brukte ChIP analyse for å definere genom bred promoter belegg av Myc i embryonale stamceller (ES) celler [36], [37]. 31,5% av genene nedregulert i nærvær av Omomyc hadde promotorer som ble rapportert å være direkte bundet av Myc i ES-celler (P-verdi: 1,3 x 10
-24) sammenlignet med 19% i dens fravær (P- verdi: 3 × 10
-2). Til sammen 44,4% av Omomyc downregulated gener viste seg å være ekte MYC mål i henhold til enten Myc målgener database eller en oversikt over MYC bundet arrangører i ES-celler (Venn-diagram: Figur 4A). Gener som er felles for alle de tre grupper er gruppert i en dimensjon i figur 4B. En så stor – om enn ufullstendig – overlapp mellom gener hvis nedregulering var assosiert til Omomer aktivering i Rat1 fibroblaster og validert MYC målene er svært viktig. At overlappingen er ufullstendig, er i samsvar med andre analyser av ekspresjon og beregningsmessig utledet gensettene [38], [39], og det kan være delvis på grunn av andre virkninger av serum. Figur 3 (midten) viser klassifiseringen i funksjonelle kategorier basert på GO (Gene Ontologi) vilkår. Som rapportert for gener assosiert med c-myc aktivitet [36], [40], [41], gener påvirkes av Omomyc falle i flere funksjonelle klasser som involverer vekst, metabolisme, cellesignalveier, cellecyklusprogresjonen, og apoptose. Spesielt, ble gener nedregulert i nærvær av Omomyc anriket i kategorier – nukleotid og nukleinsyre metabolisme – som er over- representert blant målene oppregulert etter c-Myc [36], [40] – [42], som støtter tanken om Omomyc som en inhibitor av Myc mediert trans (figur 3, nederst). Mål kjent for å være oppregulert ved Myc og funnet å være nedregulert ved Omomyc inkluderer gener som koder for proteiner som er direkte involvert i oversettelse og ribosom montering – for eksempel oversettelse initiering faktor Eif3s9, oversettelse forlengelse faktor Eef1a1, og ribosomalt protein L3 og S4 – samt som gener som koder metabolske enzymer – isocitrat dehydrogenase 2, laktat dehydrogenase B phosphoglycerate kinase 1 -, proteiner involvert i cellesyklusprogresjon – den anaphase fremmende kompleks subenhet Anapc5, Cyclin B1 og cyclin D1 -, ATPase /DNA helicase TIP49 (Ruvbl1) , og den strukturelle kromatin protein Hmgb1. Hmgb1 har en viktig rolle i kromatin ombygging og er en mediator for inflammasjon hvis overekspresjon er forbundet med mange tumortyper [43]. TIP49 er en viktig Myc kofaktor, involvert i Myc transkripsjonen og onkogene funksjoner [44]. Flere gener funnet å være nedregulert ved Omomyc og kjent for å være Myc trykt mål koder for proteiner som er involvert i signalveier, celle adhesjon og transkripsjons – som akt1, ErbB2, c-Jun og fibroblast vekstfaktor reseptor Fgfr1 – mens
Mxi1
koder for et protein som samhandler med Max og negativt regulerer Myc funksjon.
Mxi1
blir undertrykt av Myc [45] men aktiveres av HIF-1α [46], [47]. Defekter i dette genet har blitt rapportert i prostatakreft og i en undergruppe av glioblastomas [48], [49].
Omomyc fremmer nedregulering av flere gener. Topp. Mange flere gener ble nedregulert i celler som uttrykker Rat1 Omomer (Omomer) enn i celler som ikke (kontroll) ved 90 følgende serum stimulering av Rat1 fibroblaster i nærvær av tamoxifen. Antallet oppregulert gener var lignende. Rat1-kontrollceller ved tid 0 ble tatt som referanse. Midten. Distribusjon i ulike biologiske prosessen klasser – basert på Gene ontologi klassifisering – gener downregulated 90 «følgende serum stimulering i Omomer og kontrollceller. Bunn. Gener relatert til nukleotid og nukleinsyre metabolisme er de mest betydelig overrepresentasjon – som beregnet av Panther programvare -. Blant genene nedregulert i nærvær av Omomyc (Omomer-celler i nærvær av tamoksifen)
A) Venn-diagram som illustrerer overlapp mellom gener nedregulert ved Omomyc i denne studien, gener oppført som mYC mål i myc målet genet database (www.myccancergene.org), og gener som er rapportert å være direkte bundet av c-myc i ES -celler [29], [38]. Innenfor Myc målgenet database og ES-celledatasettene ble bare gener som hadde en sonde på Affymetrix U34A matrisen tatt i betraktning. B) Overlappende, bona fide MYC målgener ble hentet fra vårt datasett og gruppert i en dimensjon. C) Relativ uttrykk nivå (endring) – målt av Real Time PCR på 90 min etter serum stimulering i nærvær eller fravær av 4-OHT – av
Ccnd1
,
Eif3s9
,
Pgk1
,
akt1
,
ErbB2
,
Gadd45a
,
Mxi1
mRNA i villtype (til venstre) og Myc null (til høyre) Rat1 celler som uttrykker tamoxifen induserbar Omomyc (Omomer).
Ccnd1
,
Eif3s9
,
Pgk1
representerer Myc aktivert mål;
akt1
,
ErbB2
,
Gadd45a
,
Mxi1
representerer Myc trykt mål. Expression ved serum tillegg (tid 0) ble tatt som referanse for beregning av Fold Endre.
For ytterligere å validere våre funn, utførte vi Real Time PCR-analyser i villtype og Myc null Rat1 fibroblaster uttrykke tamoxifen induserbar Omomyc (Figur 4C). Vi sammenlignet – på 0 og 90 min av serum stimulering – uttrykket nivåer av en utvalgt utvalg av gener som påvirkes av serum stimulering som er kjent for å være enten fortrengt –
Gadd45a
,
Mxi1
,
ErbB2
,
akt1 Anmeldelser – eller aktivert –
Pgk1
,
Eif3s9
,
Ccnd1 Anmeldelser – ved Myc [40], [45 ], [50]. Disse genene, som enhver genet, er ikke eksklusive MYC mål og andre transkripsjonsfaktorer modulert eller ikke av serum kan bidra til deres regulering. Vi fant at uttrykket nivåer av fortrengte mål
Gadd45a
,
Mxi1
,
ErbB2 Hotell og
akt1
i villtype Rat1 celler var upåvirket eller mer undertrykt i nærvær av Omomyc mens oppregulering av de aktiverte målene
Pgk1
,
Eif3s9 Hotell og
Ccnd1
ble kompromittert (figur 4C, venstre). I MYC null-celler, fant vi at Omomyc ikke i vesentlig grad påvirker uttrykk for undertrykt og svekket ikke oppregulering av de aktiverte mål (figur 4C, høyre). Derfor effekten av Omomyc på transkripsjon av Myc aktivert mål ser ut til å kreve en viss aktivitet av Myc.
I sum er disse funnene tyder på at Omomyc ikke globalt hemme Myc funksjon i transcriptional regulering av målgener og foreslår at det selektivt perturbs myc transkriptomet ved å tråkke Myc mediert trans og bevare Myc mediert undertrykkelse.
Omomyc påvirker forskjellig trans og undertrykkelse ved å påvirke Myc binding til målet genet arrangører
for å undersøke mekanismene som er involvert i genregulering av Omomyc utførte vi luciferaserapportørplasmid og kromatin immunoutfellingsstudier (chip) analyser på to gener som koder nukleolært protein nucleolin og cyclin-avhengig kinase inhibitor p21, henholdsvis representerer ekte og direkte mål av Myc mediert aktivering og undertrykkelse [51], [52]. c-myc er i stand til å aktivere
nucleolin
transkripsjon via to svært konserverte E-bokser i intron 1 [51]. For å teste evnen til Omomyc å hemme Myc mediert transcriptional aktivering, utførte vi reporter analyser i 293T celler transfektert med luciferase reporter plasmid pNucL14 [51] – der muse
nucleolin
promoter, exon 1, intron 1 og første 8 nt av exon 2 – sammen med ulike kombinasjoner av FLAG-c-myc og Omomyc ekspresjonsplasmider (figur 5A). Vi fant at Omomyc hemmet Myc-mediert aktivering av luciferase reporter på en doseavhengig måte, mens det ikke påvirker dets basale aktivitet. For å teste om hemming av
nucleolin
trans av Omomyc skyldes en reduksjon av promoter bindende, målte vi hvor mye Myc bundet til
nucleolin
arrangøren på 293T celler transfektert med
nucleolin
reporter, FLAG-c-myc og Omomyc uttrykker plasmider. Gjenoppretting av
nucleolin
DNA samutfelt med Myc ble kvantifisert ved real-time PCR, ved hjelp av primere som ligger rundt de to E-bokser i
nucleolin
intron 1. Vi fant at Omomyc forårsaket en 40% reduksjon av mengden av promotor bundet Myc (figur 5B, venstre). I tillegg konkurrerer for Myc /Max forening, er Omomyc stand til å danne homodimerer samt Omomyc /Maks dimers: bare de siste bind E-bokser
in vitro
med høy effektivitet [9]. Derfor Omomyc kan påvirke Myc binding til DNA via to concurring mekanismer: hemming av Myc /Max dimerization samt direkte konkurranse for E-box bindende. For å vurdere den sistnevnte har vi målt mengden av Omomyc bundet til
nucleolin
promoter i celler transfektert med c-myc og FLAG-Omomyc uttrykker plasmider (Figur 5B, høyre). Vi fant at Omomyc ble spesielt rekruttert til E-boks som inneholder regionen i intron 1 og at den konkurrerte med c-myc for binding til denne regionen. Til sammen disse dataene indikerer at Omomyc kan påvirke trans ved avsette Myc i komplekser ute av stand til å binde seg til E-bokser samt ved å opptre – antagelig i forbindelse med Max -. Som kompetitiv hemmer av Myc /Max komplekser for E-Box bindende
A) Luciferase aktivitet av musen
nucleolin
arrangøren reporter plasmid – pNucL14 – transfektert i 293T celler sammen med FLAG-c-myc og Omomyc uttrykker vektorer. Data ble normalisert ved kotransfeksjon av PRL-TK Renilla luciferase. Den basale aktiviteten av reporteren ble satt til en verdi på 100. B) Kvantitativ ChIP analyse av Myc og Omomyc binding til
nucleolin
promoter-regionen (NCL, grå søyler). Venstre: FLAG-c-myc bindende i 293T celler transfektert med
nucleolin
reporter pNucL14 sammen med FLAG-c-myc og Omomyc uttrykker plasmider. Høyre: FLAG-Omomyc bindende i 293T celler transfektert med
nucleolin
reporter sammen med FLAG-Omomyc og c-myc uttrykker plasmider. Et område av
luciferase
kodende sekvens (Luc, svarte striper) ble brukt som kontroll. Barer representerer prosent av tilført DNA immunopresipitert, etter bakgrunn subtraksjon. Chip verdiene er uttrykt som% av innspill DNA
For å undersøke hvordan Omomyc kan handle for å støtte Myc mediert undertrykkelse, gjennomførte vi analyser på menneske
p21
arrangøren -. Spesielt sekvensen omfattet mellom -194 og 16 fra transkripsjonsstart nettstedet – hvor Myc er rekruttert av sink finger protein Miz-1 [27], [52]. Vi utførte analyser og reporter funnet at luciferase ekspresjon drevet av full-lengde human
p21
promoter – p21Cip1-Luc [53] – ble inhibert av c-myc og det Omomyc var synergistisk med c-Myc (figur 6A ). Interessant – selv i fravær av en kotransfektert c-myc – Omomyc provosert
p21
promoter undertrykkelse til nivåer som ligner på de som forårsakes av c-myc. Derfor Omomyc er i stand til å støtte
p21
promoter undertrykkelse både i nærvær og fravær av en over-uttrykkes c-Myc. For å undersøke om dette var knyttet til økt promoter bindende, utførte vi chip analyser på 293T celler transfektert med p21 reporter sammen med FLAG-Myc og økende mengde Omomyc plasmid. Vi observerte at Omomyc markant økt c-myc binding til -194 til 16 region (figur 6B, øverst). Interessant, den gjensidige analysen på celler transfektert med FLAG-Omomyc og økende mengde c-myc plasmid indikerte at Omomyc var i stand til å kommunisere med det samme
p21
promoter-regionen (figur 6B, nederst). I dette tilfelle har Myc overekspresjon ikke konkurrere med bindingen Omomyc.
