Abstract
Protein kinase D (PKD) har vært innblandet i mange aspekter av tumorigenesis og progresjon, og er en ny molekylære mål for utviklingen av kreftbehandling. Til tross for nylige fremskritt i utviklingen av potente og selektive PKD lite molekyl hemmere, forblir tilgjengeligheten av
in vivo
aktive PKD-hemmere sparsom. I denne studien beskriver vi oppdagelsen av en roman PKD lite molekyl hemmer, SD-208, fra en målrettet kinase inhibitor bibliotek skjermen, og syntese av en serie av analoger å undersøke struktur-aktivitetsforhold (SAR) vs. PKD1. SD-208 vises en smal SAR-profil, var en ATP-konkurranse pan-PKD-hemmer med lav nanomolar potens og var celle aktiv. Målrettet inhibering av PKD av SD-208 resulterte i sterk inhibering av celleproliferasjon, en effekt som kan bli reversert ved å overuttrykt PKD1 eller PKD3. SD-208 også blokkert prostatakreft celle overlevelse og invasjon, og stansede celler i G2 /M-fasen av cellesyklusen. Mekanistisk, ble SD-208-indusert G2 /M arrest ledsaget av en økning i nivåene av p21 i DU145 og PC3 celler samt forhøyet fosforylering av Cdc2 og Cdc25C i DU145 cellene. Viktigst, SD-208 gitt oralt i 24 dager betydelig avskaffet veksten av PC3 subkutan tumorxenotransplantater i nakne mus, som ble ledsaget av redusert spredning og økt apoptose og redusert uttrykk av PKD biomarkører inkludert survivin og BCL-XL. Vår undersøkelse har identifisert SD-208 som en roman effektiv PKD lite molekyl hemmer, viser det terapeutiske potensialet for målrettet hemming av PKD for prostatakreft behandling
Citation. Tandon M, Salamoun JM, carder EJ, Farber E, xu S, Deng F, et al. (2015) SD-208, en Novel Protein Kinase D Sperre, blokker Prostate Cancer Cell Proliferation og tumorvekst
In Vivo
ved å fremkalle G2 /M cellesyklus arrest. PLoS ONE 10 (3): e0119346. doi: 10,1371 /journal.pone.0119346
Academic Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 25 juli 2014; Godkjent: 19 januar 2015; Publisert: 06.03.2015
Copyright: © 2015 Tandon et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av National Institutes of Health gi R01CA129127, R01CA142580 og utlandet Hong Kong og Macao Scholars Collaborative Research Fund of NSFC i Kina ( Grant # 81328020). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Medforfatter Qiming Jane Wang er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Prostatakreft er den vanligste mannlige malignitet i vestlige land [1] og den nest største årsaken til kreft døden i USA, som representerer 29% av alle mannlige kreftdødsfall [2]. Mens lokalisert sykdom kan behandles med et par modaliteter, er den metastatisk trinnet smertestillende middel i stedet for terapeutisk og det er for tiden ingen effektiv behandling. Protein kinase D (PKD) er en familie av allestedsnærværende serin-treonin protein kinase som tilhører Ca
2 + /calmodulin-avhengig protein kinase super [3]. De tre isoformer av PKD (PKD1 /PKCμ [4], PKD2 [5] og PKD3 /PKCν [6]) er vidt distribuert i forskjellige vev, og er homologe i struktur og funksjon. PKDs aktiveres av proteinkinase Cs (PKCS) gjennom fosforylering av to bevarte serinrester i aktiveringen løkken av kinase domene. For PKD1 innebærer aktivering PKC-mediert fosforylering på Ser
738 og Ser
742 i aktivering loop, etterfulgt av autofosforylerings på Ser
910 som formidler full aktivering [7,8].
PKD spiller en viktig rolle i mediering mitogene signalisering og er blitt vist å forsterke GPCR-indusert celleproliferasjon gjennom MEK /ERK /RSK sti [9]. Emerging bevis demonstrerer involvering av PKD i nøkkelsignalbaner som regulerer tumorcelle-proliferasjon så som β-catenin, androgen reseptor, mTORC1-S6K1, og MAPK i forskjellige tumorcellemodeller [10-15]. Samlet viser dette mekanistiske fotavtrykk en viktig rolle PKD i kreft, som er grunnlaget for målretting PKD hjelp lavmolekylære inhibitorer for kreftbehandling.
I de siste årene har utviklingen av små molekyl hemmere som målrette PKD familien har avansert betydelig [15-19]. Etter oppdagelsen av den første potent, selektiv, og celle-aktiv lite molekyl hemmer CID 755 673 etter vår gruppe [20,21] vi rettet en betydelig innsats på å forbedre sin styrke og selektivitet gjennom kjemiske modifikasjoner. Mens vi utviklet fører med mye bedre potens og selektivitet, for eksempel kb-NB142-70 [20,22],
in vivo
effekt og anvendelse av denne klassen av hemmere forble begrenset [23]. En fersk studie hvor målrettede biblioteker av små organiske kinase hemmere har også identifisert en ny ATP-konkurranse 4-azaindol stillas, og et sett med pyrazolopyrimidinforbindelse lavmolekylære inhibitorer med lav nanomolar potens for
in vitro
hemming av PKD som er potente blokkert prostata kreft celler spredning og vekst [18,24,25]. Til tross for den enorme innsatsen mot utvikling av potente og selektive PKD lite molekyl hemmere for kreftbehandling, er det fortsatt stor etterspørsel etter effektive
in vivo
-aktiv PKD lite molekyl hemmere i stand til å utvikle seg til preklinisk utvikling og videre inn i den kliniske søknad.
i denne studien identifiserte vi SD-208 som en roman ATP-konkurranse PKD lite molekyl hemmer
in vitro Hotell og
in vivo
. I prostata kreft celler, viste vi at SD-208 undertrykte betydelig tumorcellevekst gjennom målrettet hemming av PKD og blokkerte tumorcelle invasjon. En mekanistisk undersøkelse, vil SD-208 opphevet cancer celleproliferasjon gjennom induserende G2 /M cellesyklus-stans ved å øke cyklin-avhengig kinase inhibitor (CDKI) -p21 nivåer og modulere aktiviteten av Cdc25C /Cdc2 pathway. Videre SD-208 blokkert PC3 prostatakreft celleproliferasjon og veksten av tumorxenotransplantater i nakne mus, korrelere til redusert BCL-xL og Survivin. Vi har også generert en serie av analoger av SD-208 ved kjemisk syntese, og undersøkt deres hemmende profil, noe som demonstrerer en smal SAR for dette føre struktur. Våre resultater og dermed karakterisere SD-208 som et strukturelt nytt PKD lite molekyl hemmer som i vesentlig grad opphever prostatakreft celleproliferasjon
in vitro Hotell og
in vivo
.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne undersøkelsen ble utført i henhold til Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh retningslinjer og dyret protokollen og studien ble godkjent av University of Pittsburgh Institutional Animal Care og Brukerutvalget (Protocol Nummer: 11120102).
Cell kultur og reagenser
Menneskelig prostata carcinom PC3, DU145 og LNCaP celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og kultivert i henhold til produsentens anbefaling. Alle cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C, 5% CO
2 i en fuktig atmosfære. Hams F-12 og MEM var fra Cellgro (Manassas, VA) og andre kultur materialer var fra Invitrogen (Life Technologies, Carlsbad, CA). Kinase aktiv rekombinant GST-merket humant protein kinase D1 (PKD1) ble hentet fra Enzo miljø- og biovitenskap (Farmingdale, New York). DMSO ble kjøpt fra Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Rekombinant PKCα, PKCδ, og CAMKIIα ble hentet fra SignalChem (Richmond, BC, Canada). ATP ble kjøpt fra Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). HDAC5 underlaget peptid ble syntetisert ved Biobasic Canada Inc. (Markham, ON). Myelin basisk protein 4-14 ble kjøpt fra AnaSpec Inc. (Fremont, CA). En farmakologisk aktive kinase inhibitor bibliotek ble kjøpt fra Tocris Biovitenskap (Minneapolis, MN).
Syntese av SD-208-analoger
Vi bestemte oss for å kjemisk modifisere 5-klor-2-fluorfenyl (
sone 1
) og
para
-aminopyridine (
sone 2
) delene av SD-208 å sondere bidrag fra disse sidekjedene til PKD1 hemming (tabell 1 og S1 fig.). Detaljer om syntesen er beskrevet i
Hjelpemiddel Informasjon
.
Docking av SD-208
Denne studien ble utført som tidligere rapportert [25]. Den strukturelle homologi modell av PKD1 er kinase domene (rester 587 til 835) ble generert ved hjelp av I-TASSER server. Sybyl-X 2.1 Surflex-Dock programvare utføres dokking av SD-208 inn PKD1 er kinase domene. Program innstillingene ble konfigurert under påfølgende parametere. Alle hydrogenatomene var tilstede i både homologi modell samt SD-208. Forankrings området ble begrenset innenfor rammen av ATP-bindingssetet, som inkluderer følgende rester: Ala
610, Lys
612, Met
659, Glu
660, Lys
661, Leu
662, Hans
663, Glu
710, Leu
713, og Cys
726. Tjue ekstra starter conformations ble evaluert for SD-208 og alle bindende modi ble vurdert. Molekylær modellering ble presentert ved hjelp av PyMol.
In Vitro
Radiometrisk PKD Inhibitor Screening Assay
En
in vitro
radiometriske PKD kinase analysen ble benyttet for å undersøke en lite bibliotek med 80 kommersielt tilgjengelige kinase hemmere, Tocriscreen kinase inhibitor samling (Tocris biovitenskap, Minneapolis, MN), for PKD1 hemmende aktivitet på en mikrometer konsentrasjon [24].
In Vitro
Radiometrisk protokollen er beskrevet i
Hjelpemiddel Informasjon
.
Western Blot analyse
LNCaP og DU145 prostata kreft celler ble opprettholdt i RPMI 1640, mens PC3-celler ble opprettholdt i Hams F-12 medium, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1000 enheter /l penicillin og 1 mg /ml streptomycin i 5% CO
2 ved 37 ° C. Et Western blot-analyse ble utført som tidligere rapportert [10]. Primære antistoffer rettet PS
916-PKD1 (human PS
910-PKD1) (Millipore), PS
744/748-PKD1 (human PS
738/742-PKD1), PKD1, pHsp 27 , Hsp 27, p21, Cyclin A2, p-Cdc2, Cdc2, Cyclin B1, p-Cdc25C, Cdc25C, survivin, BCL-XL, Akt og pS
473-Akt (Cell Signaling Technology), PKD2 (Abcam), cyclin D1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), ble GAPDH (Enzo Life Science, Farmingdale, New York) og tubulin (Sigma) brukes for blotting.
In vitro Radiometrisk PKC og CAMKIIα kinase analysen
PKC kinaseanalyse ble utført ved ko-inkubering 1 uCi [γ-
32P] ATP, 20 pM ATP, 50 ng av renset PKCα eller PKCδ og 5 pg av myelin basisk protein 4-14, 0,25 mg /ml bovint serumalbumin, 0,1 mg /ml fosfatidylcholin /fosfatidylserin (80/20%) (1 uM), 1 uM forbol dibutyrate i 50 ul kinasebuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 4 mM MgCl
2 og 10 mM β-merkaptoetanol. For CAMK assay, ble 50 ng av CAMKIIα og 2 ug syntide-2-substrat i 50 pl kinasebuffer inkubert med 0,1 mM MgCl
2, 1 uCi av [γ-
32P] ATP, 70 pM ATP. 0,5 mM CaCl
2 og 30 ng /pl kalmodulin ble preinkubert i 15 minutter på is og deretter tilsatt i kinasereaksjonen. Reaksjonene ble inkubert ved 30 ° C i 10 minutter og 25 ul av reaksjonsblandingen ble observert på Whatman P81 filterpapir. Filterpapiret ble vasket 3 ganger i 0,5% fosforsyre, lufttørket og telt ved bruk av Beckman LS6500 FB-scintillasjonsteller.
MTT-analysen
PC3-celler ble sådd på 96-brønners plater (3000 celler /brønn) og fikk feste seg over natten. Cellene ble deretter inkubert i medium inneholdende 0.7-100 pM inhibitorer i 72 timer. 50 ul av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid metyl tiazolyl tetrazolium (MTT) løsning ved 2 mg /ml konsentrasjon ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer ved 37 ° C . Deretter media ble fjernet, og 200 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn. Platen ble blandet ved rysting i 5 minutter, og den optiske tetthet ble bestemt ved 570 nm.
Subkutan prostata tumor Xenograft Study
atymisk NCR-nu /nu-mus (4-6 uker gamle) (NCI, Frederick, MD) ble injisert subkutant med 1,4 X 10
6 PC3 celler i 100 mL media. Tre dager etter inokulasjon, når tumorer ble håndgripelig, ble musene tilfeldig delt inn i følgende grupper (5 mus pr gruppe); (A) bærer (kontroll) 1% (w /v) metylcellulose administrert ved oral føring to ganger daglig; (B) SD-208 60 mg /kg suspendert i 1% metylcellulose administrert ved oral føring to ganger daglig i 21 dager. Kroppsvekt ble målt to ganger ukentlig. Svulster ble målt i to dimensjoner hver 2 til 3 dager etter calipers og tumorvolumet ble beregnet som
V plakater (mm
3) = (
L x B
2) /2. Tumorvolumene ble sammenlignet ved hvert tidspunkt mellom grupper ved hjelp uparet t-test og en
p
verdi av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Tjue-fire dager etter vaksinasjonen, ble musene avlivet av CO
2 innånding og svulster ble skåret ut. Alle dyrestudier ble utført i samsvar med en institusjonell Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh.
Immunhistokjemisk (IHC) Farging av tumorvev
Formalin-fiksert og parafin innebygd Snittene ble farget som beskrevet tidligere [10]. Kort fortalt seksjonene ble deparraffinized av xylen og rehydrert i å redusere gradienter etanol. Antigen gjenfinning ble utført ved ulmende skinnene ved nær koketemperatur i 30 minutter i 10 nmol /l natriumcitrat-buffer (pH 6,0), etterfulgt av avkjøling til romtemperatur. Vevssnitt ble deretter farget med Ki-67 (Genetex, Irvine, CA) og spaltet caspase-3 (Cell signale Technology, Beverly, MA) antistoff ved 4 ° C over natten og deretter inkubert med biotinylert geite-anti-kanin-antistoff (Vector Laboratories, Logan, UT). Platene ble deretter utviklet ved hjelp Vectastain ABC Standard kit og AEC Reagens (Scytek Labs, Logan, UT). Vevene ble til slutt motfarget med hematoksylin. Totalt 10 felt ble undersøkt og regnes fra hver behandlingsgruppene i blindt.
Immunpresipitasjon og p-PKD2 kinase analysen
PKD2 ble immunopresipitert ved inkubasjon 500 mikrogram av totale cellelysater fra tumor eksplantater med protein A /G-Sepharose-kuler (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) preconjugated med anti-PKD2 antistoff (GeneTex, Irvine, CA.) over natten ved 4 ° C med konstant rotasjon. De immunkomplekser ble deretter pelletert og vasket med vaskebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM natrium-klorid, og 1% Triton X-100). Like mengder av immunkompleks ble deretter utsatt for PKD kinase assay, som beskrevet i tillegg protokollen. I korte trekk ble analysen utført av coincubating 20 pl immunopresipitert PKD2 med 25 mM ATP, 0,2 ul [γ-
32P] ATP (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA) og 1,2 mikrometer en 25 A.A. HDAC-5 peptidet som substrat [26] i et sluttvolum på 50 pl. Reaksjonen ble tillatt å forløpe ved 30 ° C i 10 min. En porsjon av reaksjonsblandingen ble deretter flekket med P81 papir, vasket i 5% fosforsyre og tellet.
Cell Proliferation Assay and Cell Cycle Analysis
spredning av PC3-celler ble målt ved å telle antall levedyktige celler ved trypanblått-farving, som tidligere beskrevet [10]. Cellesyklusanalyse ble utført som beskrevet [22]. I korthet, PC3-celler ble behandlet med de aktuelle forbindelser ved 30 uM i 72 timer, og deretter fiksert i 70% iskald etanol over natten, etterfulgt av merking med propidium jodid. De merkede celler ble analysert ved hjelp av et FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA).
Matrigel bølgen Assays
Matrigel invasjon assay ble utført som beskrevet tidligere [21,22] (se
Hjelpemiddel Informasjon
for mer informasjon).
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble gjennomført ved hjelp av GraphPad Prism programvare 5.0. En
p
verdien av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Identifikasjon av SD-208 som en roman PKD lite molekyl hemmer
Vi gjennomførte en skjerm av PKD lite molekyl hemmere på Tocriscreen kinase inhibitor samling av 80 kjemisk ulike kinase hemmere ved 1fiM konsentrasjon ved å bruke en
in vitro
radiometriske PKD kinase analysen. Med en cut-off set ved ≥ 50% hemning av total PKD1 kinase-aktivitet, ble 16 forbindelsene identifisert som primære treff. Blant dem, SD-208 trykkes 82% av PKD1 aktivitet ved en uM konsentrasjon (data ikke vist), og ble ytterligere evaluert for inhibering av PKD1, 2 og 3 i en 10-punkts konsentrasjonskurven ved hjelp av radiometriske PKD-kinase-analyse [21]. Som vist på fig. 1A, SD-208 hemmet PKD1, 2 og 3 med en IC
50 av 106,87 ± 6,6 nM (n = 9) 93,54 ± 2,7 nM (n = 9), og 105,3 ± 2,6 nM (n = 9) hhv. Ved hjelp av LNCaP prostata kreftceller som modellsystemet, effekten av SD-208 om-12-myristat 13-acetat (PMA) -indusert endogene PKD1 aktivering ble undersøkt som tidligere beskrevet [10,22]. Som vist på fig. 1B-C, behandling av LNCaP celler med 10 nM av PMA i 20 min indusert robust PKD1 aktivering, oppdages av økt PKD1 aktivering sløyfe fosforylering på Ser
738/742 gitt av PKC og C-terminal autofosforyleringsaktivitet på Ser
910 . Forbehandling med økende konsentrasjoner av SD-208-konsentrasjon avhengig inhibert autofosforylering på Ser,
910 av PKD1 med en IC
50 fra 17,0 ± 1,5 uM (fig. 1C). I motsetning til dette, PKC-avhengig trans-fosforylering ved Ser
738/742 var upåvirket av SD-208, noe som indikerer at SD-208 direkte opphevet PKD1 katalytisk aktivitet uten å blokkere oppstrøms PKC-mediert PKD1 trans-fosforylering. Dermed er SD-208 strukturelt distinkte pan-PKD-hemmer som utløser målrettet hemming av PKD1 kinase aktivitet i prostata kreft celler.
A. Fastsettelse av PKD kinase aktivitet
in vitro
. Inhibering av rekombinant human PKD1, 2 og 3 ble undersøkt i nærvær av 10 forskjellige konsentrasjoner av SD-208 ved en
in vitro
radiometrisk PKD-kinase assay. IC
50-verdier ble beregnet som middelverdi ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter med tre bestemmelser på hver forbindelseskonsentrasjon i hvert forsøk. Dataene ble plottet som en funksjon av inhibitorkonsentrasjon og en representativ kurve som er vist. B. SD-208 hemmet PMA-indusert PKD1 aktivering i prostatakreftceller. LNCaP-celler ble forbehandlet med forskjellige doser av inhibitorer for 45 min, etterfulgt av PMA stimulering ved 10 nM for 20 min. Cellelysater ble utsatt for immunblot for p-S
910-PKD1 og p-S
738/742-PKD1. Tubulin ble strøket som lasting kontroll. Forsøket ble gjentatt tre ganger, og de representative blottene er vist. C. Bestemmelse av celle IC
50. Western blot fra «B» ble kvantifisert ved hjelp densitometry analyse. Dataene ble plottet og IC
50-verdier ble avledet fra konsentrasjon-respons kurver ved bruk av GraphPad. En av de tre konsentrasjons-responskurvene er vist. D. SD-208 er en ATP-konkurranse kinase inhibitor. PKD1 kinase-aktivitet ble målt som en funksjon av økende konsentrasjoner av ATP i nærvær av varierende konsentrasjoner av SD-208. Lineweaver-Burke plott av dataene er vist. Presenterte data var middelverdien ± S.E. av tre uavhengige eksperimenter med tre bestemmelser på hvert datapunkt i hvert forsøk. E-F. Selektiviteten til SD-208 mot relaterte kinaser. Inhibering av PKCα (B) eller PKCδ (C) ble bestemt ved 10 nM, 100 nM, 1 uM og 10 uM. Som kontroller PKC-hemmer GF109203X potent hemmet PKCα og PKCδ aktivitet. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av to uavhengige eksperimenter. G. Inhibering av CAMKIIα ble målt ved hjelp av radiometriske CAMK kinase assay. Data er gjennomsnitt ± S.E. av to uavhengige forsøk med tre bestemmelser på hvert datapunkt i hvert forsøk. Statistisk signifikans ble bestemt ved anvendelse av uparede t-test. ns, ikke signifikant betydning; *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P. 0,001
SD-208 var en ATP-kompetitiv hemmer med høy selektivitet for PKD løpet tettere forbundet kinaser
For å få en bedre innsikt i modus for handling for SD-208, undersøkte vi effekten av økende konsentrasjoner av ATP på PKD1 hemming. Lineweaver-Burk plottene ble samlet ved å plotte den inverse verdien av reaksjonshastigheter (1 /v) mot den resiproke verdi av ATP-konsentrasjoner (1 /[ATP]) ved forskjellige forbindelseskonsentrasjoner. Poengene ble montert ved lineær regresjon. Som vist Fig. 1D, alle linjer konvergerte på Y-aksen, noe som indikerer at SD-208 var en ATP-konkurrerende inhibitor. Deretter bestemmes vi spesifisiteten av SD-208 for PKD ved å undersøke deres aktivitet for de klassiske og nye PKC isoformene bruker PKCα og PKCδ. Ingen signifikant hemmende aktiviteter for PKC isoformer ble oppdaget på 0,1 og 1 mikrometer og for PKCα 10 mikrometer (Fig. 1E-F). Den potente PKC-inhibitoren GF109203X ble testet som en positiv kontroll, og det potent og konsentrasjonsavhengig inhibert PKCα og PKCδ. Høy sekvens homologi av PKD med CAMK familien førte oss å undersøke hemming av CAMKIIα av SD-208. Som illustrert i fig. 1G, SD-208 viste ingen aktivitet på CAMKIIα opp til 10 mikrometer. Tatt sammen indikerer disse data at SD-208 er en meget spesifikk inhibitor for PKD i forhold til andre nært beslektede kinaser inkludert PKCS og CAMKs.
Synthesis, SAR-analyse, og modellering av SD-208 og dennes analoger
Vår tilnærming til de syntetiske studier som beskrevet i S1 fig., var basert på to soner av substitusjon i SD-208, hvor det 2-fluor-5-klorbenzen representerer sone 1 og 4-aminopyridin representerer sone 2 ( fig. 2). Ved hjelp av pteridin kjerne som en syntetisk plattform, var vi er interessert i å utforske de substitusjoner som er knyttet til den kondenserte pyrimidinringen, spesielt for å identifisere SAR bidragene fra fluor- og klor substituenter i sone 1 og pyridinringen i sone 2. Det sekundære amin sone 2 ble bevart fordi amino substitusjoner alfa til nitrogenatomer i heterosykliske grupper er ofte innblandet i proteinkinase hengsel bindings [27,28]. Som en konsekvens kan sekundært amin bevise avgjørende for aktivitet.
2-sone modell for SD-208 analog syntese.
Vår SAR etterforskning i første omgang fokusert på betydningen av substituentene på den aromatiske ringen i sone 1 (tabell 1). Elektrontettheten av den aromatiske ring i SD-208 er redusert med den elektronegativitet av den fluoratom [29,30]. Videre kan klor bidra til dipol-dipol interaksjoner i proteinbindings kløften [31]. Fjerning av halogenene fra benzenringen (5a-d) førte til en signifikant redusert aktivitet. I motsetning til dette, installasjon av elektrontiltrekkende grupper, slik som fluor (5e-g) og trifluormetyl (5H) gjenopprettet aktivitet, men bare når sone 2 besto av 4-aminopyridin (5e, t). Interessant nok var bare 4-aminopyridin tolereres i sone 2. Derfor, våre forsøk på å forbedre oppløseligheten med piperazin (5j) og 2-morfolinoetyl (5 g) substituenter mislyktes i å bevare PKD1 hemmende effekter. Overraskende, og med en regioisomer, 3-aminopyridin (5d, f), ble ikke tolerert. Denne observasjonen tyder på at nitrogenet i pyridinringen kan være involvert i vesentlige hydrogenbindingsvekselvirkninger, men bare i en bestemt romlig arrangement. Ytterligere spredning av sone 1 med 3,5-diklor substituenter (5i) ikke gjenopprette aktiviteten. Dette støtter ytterligere betydningen av elektrontiltrekkende gruppe siden klor er mindre elektronegative enn fluor. Å endre posisjonene av substituentene på benzenringen i den 2,5-difluor-(5e) og 3-trifluormetyl- (5H) analoger konservert aktivitet. Dette resultatet indikerer at posisjonen av substituentene på denne carbon ikke være kritisk så lenge som den funksjonelle gruppe er tilstrekkelig elektrontiltrekkende.
I forbindelse med denne SAR-analyse, benyttet vi vår modell PKD1 homologi [25] for å rasjonelt utforske en antatt binding modus for SD-208 i det aktive området av PKD1. Vanlig blant ATP-konkurrerende inhibitorer, ble SD-208 er vist i fig. 3A for å samhandle med hengselregionen gjennom hydrogenbindingsdannelse mellom aminosyren ryggrad Leu
662 og dens pteridin kjerne. I tillegg ble et potensielt kritisk hydrogenbinding observert med nitrogenet fra den 4-aminopyridin og ladet sidekjede av Lys
612. En lignende interaksjon ble også rapportert i andre kjente PKD1 inhibitorer [18]. Vår SAR analyse støtter videre ideen om at nitrogen fra 4-aminopyridin fungerer som et verdifullt hydrogen obligasjon akseptor. Ablasjon av denne bindingen viste en markant nedgang i PKD1 hemming. Dessuten vises i fig. 3B, posisjonerer vår modell disubstituert fenylring i en hydrofob lomme som består av Leu
589 og Leu
713, som kan diktere toleransen av aromatiske substitusjoner. Selv om andre binde moduser av SD-208 ble undersøkt, den aktuelle modellen beste rekapitulert Resultatene er representert i vår SAR-analyse.
Denne avbildningen vist en potensiell bindende modusen for SD208 i det aktive sete til PKD1. Røde stiplede linjer representerer viktige interaksjoner mellom SD-208 og PKD1.
SD-208 hemmet prostatakreft celleproliferasjon og invasjon
Vi neste undersøkte effekten av målrettet hemming av PKD av SD -208 på prostata cancer celleproliferasjon, overlevelse, og cellesyklusprogresjon. Som vist på fig. 4A-B, SD-208 30 pM forårsaket signifikant reduksjon i PC3 prostatakreftceller proliferasjon starter på dag 2 og vedvarte til slutten av forsøket. SD-208 også konsentrasjonsavhengig måte induserte celledød med en IC
50 fra 17,0 ± 5,7 pM (n = 3) (fig. 4C). Effekten av SD-208 på tumorcelle invasjon ble vurdert ved anvendelse av Matrigel invasjon assay (celle invasjon). Som illustrert i fig. 4D, behandling av celler med 30 pM SD-208 i 20 timer resulterte i over 60% inhibisjon av celle invasjon sammenlignet med kontrollgruppen, noe som indikerer at SD-208 signifikant tumorcelle blokkeres invasjon. Tatt sammen demonstrerer våre data som SD-208 er en potent inhibitor av prostatacancer celleproliferasjon og invasjon.
A-B. SD-208 hemmet PC3 (A) og LNCaP (B) prostatacancer celleproliferasjon. PC3 og LNCaP-celler ble sådd i tre paralleller i 24-brønners plater. Cellene ble latt bli tilkoblet over natt. En blodceller på dag 1 ble gjort, og deretter enten et kjøretøy (DMSO) eller SD-208 på 30 mikrometer ble lagt. Celler ble talt daglig i totalt 6 dager. Data er gjennomsnitt ± S.E. av to uavhengige forsøk med tre bestemmelser på hvert datapunkt i hvert forsøk. C. SD-208 hemmet PC3 prostatakreft celleoverlevelse. PC3-celler ble sådd på 96-brønners plater (3000 celler /brønn) og ble deretter inkubert i medium inneholdende 0.3-100 pM inhibitorer i 72 timer. MTT-løsning ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer. Optisk tetthet ble avlest ved 570 nm for å bestemme cellenes levedyktighet. IC
50 ble bestemt som gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter for hver forbindelse. D. SD-208 hemmet prostatakreft celle invasjon. DU145-celler ble inkubert med 30 pM SD 208 i Matrigel innsatser. Etter 20 timer ble invasiv celler fjernet og invasive cellene fiksert i 100% metanol, farget i 0,4% hematoxylin løsning, og fotografert. Antallet celler som invaderte Matrigel matrisen ble bestemt ved celletall på 6 felt i forhold til det antall celler som overføres gjennom reguleringsinnsatsen. Prosentvis invasjon ble beregnet som prosent av cellene invaderte gjennom Matrigel setter vs. totale celler migrert gjennom kontroll innsatsene. Data er gjennomsnitt ± S.E. av tre uavhengige eksperimenter med tre bestemmelser på hvert datapunkt i hvert forsøk. Statistisk signifikans ble bestemt ved anvendelse av uparede t-test. ***, P 0,001. E-F. Overekspresjon av PKD1 og PKD3 i prostatakreftceller reddet de anti-proliferative effekter av SD-208. PC3 (0,5 millioner) celler ble sådd i et 60 mm rett og infisert neste dag med 50 og 100 MOI av PKD1 og PKD3 adenovirus (Adv-PKD1 og Adv-PKD3). Målt adenovirus (Adv-null) ble anvendt som kontroll. Etter 24 timer 3000 celler /brønn ble sådd ut i 96-brønners plater og behandlet med og uten 10 og 30 uM SD-208 i 72 timer. MTT-løsning ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer. Optisk tetthet ble avlest ved 570 nm for å bestemme cellenes levedyktighet. Overekspresjon av PKD1 og PKD3 ble bekreftet ved Western blotting-analyse. Dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger, og data er gjennomsnittet ± S.E. av alle tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans mellom DMSO og hemmer behandling ble bestemt ved hjelp av uparet t-test *, p. 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. G. PKD mediert Hsp27 aktivitet i prostatakreftceller ble hemmet av SD-208. DU145-celler ble forbehandlet med forskjellige doser av inhibitorer for 45 min, etterfulgt av PMA stimulering ved 10 nM i 20 min. Cellelysater ble utsatt for immunblot for p-S
910-PKD1 og p-S
738/742-PKD1. GAPDH ble strøket som lasting kontroll. Forsøket ble gjentatt to ganger og de representative blotter vises.
SD-208-indusert vekst arrest ble formidlet gjennom målrettet hemming av PKD
For å bestemme målet spesifisiteten av SD- 208 på cellenivå, forsøkte vi å undersøke om SD-208-indusert anti-proliferative effektene ble formidlet om målrettet hemming av PKD. Det ble gjort et forsøk på å reversere effekten av PKD inhibitor via overekspresjon forskjellige PKD isoformer. Som vist på fig. 4E-F, PC3 celler ble infisert med null adenovirus (Adv-null) og adenovirus bærer PKD1 og PKD3 gener (Adv-PKD1 og Adv-PKD3) på 50 og 100 MOI. Western blotting viste overekspresjon av PKD1 og PKD3 i PC3 celler infisert med adenovirus som bærer de respektive gener. De infiserte celler ble underkastet SD-208 behandling ved 10 og 30 uM. Uttrykk for økende nivåer av PKD1 og PKD3 reversert de anti-proliferative effekter av SD-208. De høyere nivåer av PKD1 eller PKD3 uttrykk, desto større rednings effekter, og ved 100 MOI en nesten fullstendig reversering av inhibisjon av cellevekst ble observert for Adv-PKD3 ved 10 og 30 uM SD-208 (fig. 4). Disse data indikerer at den anti-proliferative effekter av SD-208 blir mediert via inhibering av PKD. For å avgjøre om anti-proliferative tilhører SD-208 er på grunn av målrettet hemming av PKD, søker vi å finne ut om det også hemmet PKD mediert PMA-indusert Hsp27 fosforylering på Ser-82 i prostatakreftceller (Yuan og Rozengurt 2008 ). Hsp27 er en godt etablert direkte substrat av PKD [32,33]. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig.
